Received: 24 October 2019 / Revised: 12 December 2019 / Accepted: 12 December 2019

해조류의 종보존을 위한 동결 공정에서의 열역학적 특성

김민용¹, 김종덕², 신종암³, 신영우⁴*

Thermodynamic Properties in the Process of Freezing for Cryopreser- vation of Algae

Min Yong Kim ¹, Jong Deog Kim², Jong Ahm Shin¹,and Young Woo Shin⁴*

Received: 24 October 2019 / Revised: 12 December 2019 / Accepted: 12 December 2019

© 2019 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract: The two-step cooling method have been mostly used for the preservation of algae, with cryoprotectants in freezing medium. However, in order to minimize the freezing damages and to get higher survival rate, effect of ice crystal on algae must be reduced in the process of first-step freezing.

As size and distribution of ice crystals depend on cooling rate and recrystallization of ice crystal decrease the survival rate, optimal conditions in first-step freezing of cryopreservation must be established. In this study optimal cooling rate and final freezing temperature of Pyropia seriata, Undaria pinnati- fida, Sargasum fulvellum were investigated. The mixed sus- pension of 10% DMSO and 0.5 M sorbitol in 50% seawater used as cryoprotectant. Exothermic temperature, freezing time, latent heat of freezing, temperature range of freezing process were measured by differential scanning calorimetry. Results obtained revealed the optimal cooling rate and final freezing temperature of P. seriata as 1.25

C/min, −30.5

C, U. pinnatifida,

1.0

C/min, −27.8

C and S. fulvellum, 1.0

C/min, −27.1

C respectively.

Keywords: cryopreservation, Pyropia seriata, Undaria pinnati- fida, Sargasum fulvellum, DSC, thermophysical properties, freezing rate

1. INTRODUCTION

해조류는 근래에 항암, 항종양성과 항성인병에 대한 기능성 물질로서 뿐 아니라 [1-6], 면역, 생리, 신경세포의 활성물질, 세포선별, 조직화학, 면역학적 검사에 이용되는 biosensor의 소재 [7,8], 작물의 내성과 유용미생물의 활성화를 위한 비 료, 가축 및 어·패류의 사료, 화장품, 구취제, 해조요법 (algotherapy), 해양수질의 정화 소재 물질로서 그 유용성이 점점 커져가고 있다 [9-15]. 또한 광합성과 호흡과정에서 이 산화탄소와 산소를 흡수 · 방출함으로서 지구의 탄소순환에 도 기여하고 있는 등 재생 가능한 천연자원으로서의 가치가 매우 높은 것으로 알려져 있다 [16]. 그러므로 해조류의 활 용도를 높이기 위해서는 생산성, 품질성 및 부가가치가 높은 품종을 육성하고, 안정적 우량 종묘의 보존과 공급을 위한 연구가 더욱 절실한 상황이다.

해조류의 보존에 관한 연구는 장기간 보존성, 시·공간적 활용성 및 유전적 안정성이 높은 것으로 발표된 액체질소 (LN) 동결보존법이 이용되어 왔다 [17-19].

고등식물과 미세 조류에 대한 액체질소 동결보존의 연구 는 성공적으로 이루어져 왔으며 [20,21], 육상식물의 배양 세포의 동결보존법을 모델로 해조류의 동결보존에 관한 연 구 방법도 확립되기 시작하였다 [22-27]. 그 후 미역 (U.

1전남대학교 냉동공학과

1Department of Refrigerating & Air Conditioning Engineering, Chonnam National University, Yeosu 59626, Korea

2전남대학교 생명산업공학과

2Department of Biotechnology, Chonnam National University, Yeosu 59626, Korea

3수중생태기술연구소

3Underwater Ecology Institute, Yeosu 59769, Korea

4전남대학교 냉동공학과

4Department of Refrigerating & Air Conditioning Engineering, Chonnam National University, Yeosu 59626, Korea

Tel:+82-61-659-7275, Fax: +82-61-659-7279 e-mail: [email protected]

Research Paper

pinnatifida)에 대한 액체질소 동결보존에서 생존 결과가 보 고되었다 [24,27]. 또한, 대황 배우체를 이용한 다시마 목 (Laminariales) 동결보존 연구에서는 실용적인 성과를 보였 다 [28]. 김 속 (Porphyra) algae에 대한 동해방지제를 이용한 2 단계 동결보존법의 최적 동결조건을 제시하고, 해조류의 종에 따라 동해방지제의 종류 및 효과가 다르므로 적절한 동 해방지제의 선택의 중요성을 발표하였다 [29-32].

현재 해조류의 동결보존은 동결매액으로서 대부분 50~

10% 천연 해수를 사용하며, 지금까지 각종 생물의 동결보존 에 있어서 동결방지제로 사용되고 있는 DMSO (dimethyl- sulfoxide), Glycerol (C

H

O

), Ethylene glycol (HOCH

CH

OH), Glycerol, Proline, Betaine·HCl, Skimmed milk, Sucrose, Glucose (C

H

O

), Sorbitol (C

H

O

), 및 Mannitol (C

H

O

) 에 대하여 동결방지제의 효과를 검토한 결과에 의하면 DMSO이외에도 Sucrose와 Proline에서 동해방어효과가 나 타났지만, 동결방지제 중에서 DMSO의 효과가 입증되고 있 다 [21,27,31-33].

또한 액체질소를 이용한 2단계 동결보존법을 이용한 국내 산업종으로 널리 사용되고 있는 모무늬돌김 (Pyropia seriata) 의 사상체의 동결보존 연구에서 동결방지제로서 널리 사용 되고 있는 DMSO의 동해방지효과에 대한 해수농도에 영향 을 검토한 결과 DMSO를 넣지 않은 경우에는 생존율은 모두 10%이하였지만, DMSO를 넣은 경우에는 해수농도 50%에 서의 생존율은 최대가 되고, 50% 해수에 대한 DMSO를 5%

첨가 시 생존율은 65.4%로 최대가 되고 농도 15%까지는 생 존율이 거의 변화가 없는 것으로 보고된 바 있다 [33].

그러나, 동결보존에 적합한 세대, 조직, 세포의 종류, 생리 적 상태 및 전처리방법, 동결속도 제어, 생존율 측정법 등 정 립되어야 할 조건이 많으며, 더욱 동결전후의 형태적, 유전 적 검증도 필요하다고 생각되어 진다.

지금까지 동결보존을 위한 생물학적, 이화학적 연구는 다 수 수행되었으나, 해조류의 종 보존의 필수공정인 동결 및 해동 공정에서의 열의 이동 현상에 따른 해조류의 열역학적 및 물리화학적 변화에 대한 연구는 많지 않은 실정이다. 동 결 보존 공정에서 해조류의 생존율은 열역학적인 영향을 받 으므로 최적보존조건의 결정을 위한 생물학적 방법과 열역 학적 방법에는 상관성이 있을 것으로 생각되며 그 규명이 필 수불가결하다고 할 수 있다.

그러므로, 본 연구에서는 해조류의 종 보존을 위한 동결 및 해동 공정에서의 최적조건의 확립을 위하여 모무늬돌김 (Pyropia seriata), 미역 (Undaria pinnatifida), 모자반 (Sargasum fulvellum) 의 1차 동결에 의한 빙결정의 형성 과정을 저온현 미경으로 관찰하고, 시차주사열량계 (DSC: Differential Scanning Carolimetry) 로 동결속도 0.1~2.0

C/min에서 측정 한 발열곡선으로부터 동결 개시온도 및 종료온도 및 동결잠 열을 구하고, 동력학 프로그램을 이용하여 동결 속도 상수, 활성화에너지, 엔탈피, 엔트로피를 구함으로써 최적의 동결 조건을 결정함으로써 빙결정에 의한 손상을 최소화 하고자 한다.

2. MATERIALS AND METHOD

2.1. 실험 재료

본 연구에서 사용한 Pyropia seriata 유리사상체는 전남대학 교 해조양식연구실에서 계대 배양하고 있는 유리 사상체를 이용하였다. 유리 사상체 계대 배양에는 20

C, 14시간 명기 (60 µEm

s

; 백색형광등)·10시간 암기의 광주기하에서 PES 배지를 사용하여 배양하고 [김세권, 김철호(1994) 해양생물 공학, 서울외국서적, 서울, 한국], 사용 전에 세단하였다.

Undaria pinnatifida (Harvey) 의 배우체와 Sargassum fulvellum (전라남도 진도군 임회면 상만리 해안에서 2014년 봄에 채 취)의 모조에서 방출시킨 유배를 전남대학교 해조양식연구 실에서 배양시켜 이용하였다. 이들 균주는 PESI 배지[김세 권, 김철호(1994) 해양생물공학, 서울외국서적, 서울, 한국]

에서 Undaria pinnatifida는 22

C, Sargassum fulvellum는 17

C에서 배양한 후 백색 형광램프로 14L:10D간 15 µEm

s

처리하였다. 동해 방어제는 해수 (32‰)에 최종농도의 목표치 (5~15%)의 2배가 되게 혼합하여 만든 용액과 동량의 배우체 와 유배 현탁액을 혼합하여 제조하였다.

2.2. 동해 방지제

본 연구에서는 지금까지 각종 생물의 동결보존에 있어서 동 해방어제로 사용되고 있는 DMSO, Glycerol (C

H

O

), Ethylene glycol (HOCH

CH

OH), Glycerol, Proline, Betaine·HCl, Skimmed milk, Sucrose, Glucose (C

H

O

), Sorbitol (C

H

O

), 및 Mannitol (C

H

O

)에 대하여 P. seriata, U. pinnatifida, S. fulvellum에 대한 동결보존 효과는 DMSO,와 Sorbitol을 사용한 경우에 높게 나타났으며, 최적의 비율은 50% 해수 + 10% DMSO + 0.5M sorbitol로 보고하였다 [33]. 본 연구에서도 발표한 비율 로 혼합된 현탁액을 기준으로 실험을 행하였다.

2.3. 동결보존액 처리 사상체의 동결

P. seriata, U. pinatifda, S. fulvellum의 기본액은 50% 해수 + 10% DMSO + 0.5 M sorbitol로 조제하였다. 동해방어제 처리 는 2 ml 바이알에 해수 0.75 mL를 넣은 후 사상체 1 mg을 넣 고, 기본액 (2배) 0.75 mL를 15분에 걸쳐 시료가 세포내의 수 분과 치환될 수 있도록 하였다.

2.4. 시차주사열량계에 의한 열물성 측정

동해방어제를 첨가한 사상체의 동결보존에서 열역학적 최적 조건을 결정하기 위하여 시차주사열량계 (Seiko Instruments Inc. DSC 220C) 를 이용하여 현탁액 10 mg을 시료팬 키트에 채우고 압착 밀봉한 뒤 동결속도 –0.1~ –5

C/min로 동결하여 발열곡선 (exothermic curve)를 측정하였다. 이 발열반응곡선 으로부터 시차주사열량계의 partial kinetics program을 이용 하여 열역학적 물성을 구하고 동결보존에 최적의 조건을 결 정하였다.

시차주사열량계의 구성은 데이터를 처리하는 Disk station

main unit와 측정결과를 출력하는 X-Y plotter, 냉각시스템인

auto cooling unit로 되어 있으며, 시차주사열량계의 보정용 표준시료는 Indium (156.6

C)과 Tin (232.0

C) 및 mercury (−38.87

C)로 하여 각각 용융점을 측정하여 편차를 구하였다.

시차주사열량계 측정을 위하여 밀폐형 팬을 사용하였으며, 냉각제로는 액체질소를 사용하고, 측정값은 동일 시료를 각 각 3번씩 측정하여 평균치를 구하였다.

2.5. 현탁액의 동결

대조군으로 속이 빈 용기를 사용하고, 밀봉용기에는 현탁액 10 µl를 넣어 무게를 측정하여 프로그램에 입력하였다. −40

C 까지 동결속도 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0

C/min로 현탁액을동결시 켜 발열곡선으로부터 동결잠열 및 과냉각온도, 동결점, 동결 완료온도 등을 측정하였다.

2.6. 해조류 현탁액의 동결 Kinetics

Fig. 1.의 발열반응곡선에서 발열반응개시온도 (T

)와 발열 반응종료온도 (T

) 구간을 시차주사열량계의 partial kinetics program을 이용하여 등온법으로 반응곡선의 전체면적 (A)에 대한 발열반응이 진행된 부분면적 (a)의 비율 (%)과 열유속 (dH/dt) 및 냉각속도 (V

)로부터 (1)식을 이용하여 동결속도 상수 (k

)를 구하였다.

(1) 또한 (1)식으로 구한 동결속도상수로부터 활성화 에너지, 엔 탈피, 엔트로피를 계산하여 비교하므로써 최적의 동결조건 을 결정하였다.

(2)

(3)

(4) 활성화에너지 (Ea)는 동결점에서 동결이 완료되는 동결종

료온도사이의 각 온도에서의 동결이 진행되기 위해서 필요 로 하는 최소의 열량을 파악할 수 있는 지표로써 동결반응속 도의 대수로그 값 (ln k

)을 y축의 값으로 하고 절대온도의 역 수 (1/T)를 x축으로 하여 구한 1차식으로부터 기울기를 측정 함으로써 (2)식에 의하여 계산하였다.

2.7. 동결과정의 저온현미경 관찰

1차 동결 과정에서의 동결특성을 저온현미경 (Olympus U- Pot, camera : Coolpix MDC Lens and Olympus 2E 26867, cooling system : Lin Kam Co . LK 600PMS)으로 최대 배율인 40배의 배율, 동결속도 −0.5~ − 2

C/min로 해수 현탁액과 해수 및 동 결보존액 현탁액의 빙결정 형성과정을 관찰하여 동결점을 확인하였다.

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 해수 수용액을 포함한 사상체의 동결 특성

일반적인 동결고 속에서의 냉각속도를 기준으로 상온에서 0

C까지는 동결속도 2

C/min로, 빙결정이 생성되는 0

C에서

−10

C까지는 0.1

C/min, −10

C에서 −40

C까지는 2

C/min 의 동결속도로 시료의 온도를 강하시키면서 사상체의 동결현 상을 관찰하였다. P. seriata 현탁액의 동결과정을 Fig. 2에 나 타내었다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 사상체 현탁액은 –18.8

C 에서 미세한 빙결정이 생기기 시작하여 −30

C이하에서는 빙 결정의 분포 및 성상에 큰 차이를 보이지 않았으므로 동결상 태를 그대로 유지하고 있는 것으로 나타났다. 관찰 결과로부 터 −20

C를 경과하면서 얼음의 결정이 안정화되고 −30

C이 하의 온도에서 변화가 없는 것으로 관찰됨에 따라 해수현탁 액의 동결은 −30

C 이하의 온도에서 완료된다고 판단된다.

3.2. 동결보존액 처리 사상체의 동결

동해방어제 처리는 2 mL 바이알에 해수 0.75 mL를 넣은 후 사상체 1 mg을 넣고, 기본액 (2배) 0.75 mL를 15분에 걸쳐 시 료가 세포내의 수분과 치환될 수 있도록 하였다. 기본액은 50%해수 + 10% DMSO + 0.5 M sorbitol로 조제하였으며, 제 조한 시료를 동결속도 1

C/min 및 0.5

C/min 로 동결시키면서 동결되는 과정을 측정하였다. 사상체의 보존방법으로 동해 방어제를 이용한 경우에서의 사상체의 1차 동결시의 빙결정 의 생성 및 형상에 대한 특성의 측정 결과는 Fig. 3 및 Fig. 4 에 나타내었다.

상온에서 온도가 내려가면 4

C 부근에서 사상체의 둘레에 흰색의 경계선이 보이기 시작하고, −9

C를 전후하여 동해방 어제 부분과 사상체의 경계부분에 결정의 계면이 점점 커지 면서 뚜렷해지며, −11

C 전후에서 동해방어제가 존재하는 부분에 가는 선들이 형성되면서 −20

C를 지나면서 동해방어 제 부분의 가는 선이 굵은 선으로 형성된다. −26

C 에서 서서 히 어두워지기 시작하면서 −28

C를 전후하여 완전히 어두워 지면서 하얀 선이 보이기 시작한다. −31

C 전후에서 작은 빙

A a– ---

=

k_f

ln C E_a

RT--- ln –

=

H

Δ = Ea RT– = T SΔ +ΔF

F

Δ RT bT

Kh--- ln

=

Fig. 1. DSC exothermic curve of freezing.

결정이 나타나며, −35

C이하가 되면 전체의 색이 일정하게 되면서 안정된 상태가 유지되므로 사상체와 방어제의 구별 이 되지 않는 상태가 되는 것으로 관찰되었다.

해수를 포함한 사상체의 동결과정과 동결보존재를 이용하 는 경우의 저온현미경 관찰상의 차이점은 해수를 포함한 사 상체를 동결하는 경우에는 빙결정이 생성됨을 의미하는 화

면상의 어두워지는 정도가 급격하게 진행되고, 사상체에 미 치는 영향이 크다고 생각되나, 동해방지제의 경우 –30

C 에 서 동결의 진행이 느리고, 밝기도 떨어지는 속도가 느리므로 빙결정의 형성에 대한 사상체의 안정성을 확보할 수 있는 것 으로 확인되었다.

또한, 동결속도 1

C/min인 경우 −28.3

C에서 −0.5

C/min Fig. 2. Freezing process of Pyropia seriata in sea water at freezing rate 2

C/min.

Fig. 3. Freezing process of Pyropia seriata in cryoprotectant at freezing rate –1.0

C/min.

인 경우 −26.5

C에서 동결되었으며, 동결속도에 관계없이

−30

C를 지나면서 현탁의 빙결화된 색이 동일해 지는 현상 으로 보아 빙결정이 안정화되면서, −35

C 이하에서는 현탁액 빙결정의 전체의 색의 변화를 보이지 않았다. 이것은 사상체 의 1차 동결에서 −35

C이하의 온도가 되면 빙결정이 안정화 됨으로써 2차 처리공정인 액체질소처리를 하더라도 사상체 의 생존율을 높일 수 있는 최적의 보존 온도임을 나타낸다.

3.3. 동결 매체별 열특성

동결 기본 매체로 물, 해수, 해수 +동결보존액을 사용하는 경 우의 동결 특성 비교를 위하여 동결점 및 동결잠열을 측정하 였다. 사상체의 동결보존액으로 물, 해수 및 50% 해수 + 10%

DMSO + 0.5M sorbitol 을 사용한 경우의 현탁액의 열역학적 동결특성을 시차주사열량계의 동결속도 0.1~2.0

C/min에서 발열곡선을 측정하고 사상체 현탁액의 동결점 및 동결잠열

을 결정하여 비교한 결과를 Table 1에 나타내었다.

동결보존액의 종류에 따른 동결개시온도에서 동결종료온 도의 편차는 해수+동결방지제+P. seriata 8.75

C, 해수+P.

seriata 12.34

C 및 증류수 +P. seriata에서는 10.17

C로 나타 났으며, 또한 동결종료온도는 해수 +동결방지제 +P. seriata –28.39

C, 해수 +P. seriata −20.63

C 및 증류수 +P. seriata에 서는 –19.00

C로 나타났으며, 동결진행온도편차가 해수 +동 결방지제 +P. seriata가 가장 작게 나타났다. 동결과정중의 동 결잠열은 증류수 +동결방지제 +P. seriata 164.9 J/g, 해수 +P.

seriata는 288.2 J/g 그리고, 증류수 +P. seriata에서는 337.3 J/

g으로 동결잠열도 동일하게 증류수 +동결방지제 +P. seriata 가 가장 작게 나타났다.

동결보존액을 이용하는 사상체의 동결잠열이 Water + P.

seriata > Sea water + P. seriata > Sea water + Cryoprotectant +P.

seriata의 순으로 나타났으며, 해수와 동결보존액을 혼합매 Fig. 4. Freezing process of Pyropia seriata in cryoprotectant at freezing rate –0.5

C/min.

Table 1. DSC endothermic characteristics of Pyropia seriata suspension

Material Temperature (^oC) cooling Rate (^oC/min)

average

0.1 0.5 1.0 2.0

Sea water + Porphyra seriata

Tf

−

−

−

−

−

T_c

−

−

−

−

−

Lf

−

−

−

−

−

Sea water + Cryoprotectant +

Porphyra seriata

Tf

−

−

−

−

−

Tc

−

−

−

−

−

Lf

−

−

−

−

−

Water + Porphyra seriata

Tf

−

−

−

−

−

Tc

−

−

−

−

−

Lf

−

−

−

−

−

* T

: Freezing Temperature, T

: Freezing Cease Temperature L

: Freezing Temperature

체를 이용하는 사상체의 동결잠열이 해수 만을 이용하는 동 결잠열보다 57.2%로 낮은 값을 나타내었다. 동결잠열이 작 은 것은 동결시간이 단축됨을 의미하며, 동결잠열의 크기는 현탁액 속의 물 > 해수 > 해수 + 동해방어제의 순으로 큰 값 을 나타내었다.

이것은 해조류의 종보존을 위한 보존액으로서 물과 해수 보다 동해방어제를 사용하는 것이 동결과정 중에 빙결정의 형성에 따른 상변화에 관여하는 열량을 감소시킴으로써 사 상체에 대한 열적 영향력이 저하되고 열의 방출에 의한 빙결 정형성과정에서 사멸율이 작아짐을 의미하며 생존율 상승 의 주요인이 된다 [33].

3.4. 동결보존액을 사용한 해조류 사상체의 동결 특성 P. seriata, Undaria pinnatifida, Sargassum fulvellum 의 발열 반응 실험을 냉각속도 0.1~2.0

C/min 범위에서 행하여 동결 개시온도, 동결최대진행온도, 동결종료온도를 측정하였다.

측정 결과는 Fig. 7, Fig. 8과 같다. P. seriata, U. pinnatifida, S.

fulvellum 모두 동결 속도가 증가함에 따라 큰 변화를 보이지 않으며, 동결 온도, 동결 최대진행 온도는 동일한 동결 속도 에서 S. fulvellum > P. seriata > U. pinnatifida 의 순으로 높은

온도를 나타내었다.

Fig. 7, Fig. 8에서 보는 바와 같이 P. seriata, U. pinnatifida, S. fulvellum 모두 동결속도가 증가 할수록 동결 종료온도는 낮 아졌으며, 동결 종료 온도의 범위는 P. seriata −20.5

C~−30.5

C, U. pinnatifida −18.1

C ~ −27.8

C, S. fulvellum −17.0

C~ − 27.1

C였다

동결에 의한 빙결정 생성온도 범위는 Fig. 7, Fig. 8에 나타 내었다. 빙결정 생성온도의 범위, 동결개시온도와 동결종료 온도와의 차이 (temperature difference)는 동결 속도가 클수 록 넓은 온도 범위에 걸쳐 분포하며, 상대적으로 편차의 상 승이 적은 냉각속도는 P. seriata 0.1~1.25

C/min, U.

pinnatifida 0.75~1.0

C/min 였으며, S. fulvellum은 상승률이 거의 일정하였다.

3.5. 동결시간

동결시간은 Fig. 9, Fig. 10, Fig. 11에서 보는 바와 같이 P.

seriata 은 냉각 속도 0.1~1.25

C/min 에서 냉각속도가 클수록 동결시간이 짧아지며, 1.25

C/min에서 최단시간을 나타내었 다. 1.5

C/min이상에서는 다시 상승하는 경향을 보였다. U.

pinnatifida의 동결 진행 시간은 냉각 속도 0.1~1.0

C/min에서 는 김과 동일하게 냉각속도가 클수록 짧아져 1.0~1.5

C/min 이상에서는 다시 증가하였으며, S. fulvellum은 냉각속도 1.0

C/min에서 최단시간을 나타내었다. 위의 결과로부터 해조

Fig. 6. Exothermic temperature of Pyropia seriata suspension.

Fig. 8. Exohtermic temperature of Sargassum fulvellum suspension.

Fig. 7. Exothermic temperature of Undaria pinnatifida suspension.

류의 종보존을 위한 동결 보존 공정에서 생존율을 높이기 위 해서는 동결 진행 시간이 짧을수록 효과가 크므로 최적 냉각 속도를 1.0~1.5

C/min로 하는 것이 타당하다고 생각된다.

3.6. 동결잠열

동결 잠열은 조성 성분 및 조성 비율이 변화 되지 않는 경우

냉각속도의 관계없이 일정한 값을 가지며, 냉각속도 0.1~2.0

C/min의 범위에서의 동결잠열은 Fig. 12와 같다. P.

seriata, U. pinnatifida, S. fulvellum 각각 153.58 J/g, 146.67 J/

g, 123.08 J/g 의 값을 나타내었으며 미역이 가장 큰 값을 나타 내었다.

cell suspension의 동결과정을 측정한 DSC latent heat thermograms의 방출열량에는 water transport (WT, 수분의 이 동), intracellular ice formation (IIF, 세포내 빙결정 형성, 세포 내 수분동결) 과 extracellular ice formation (EIF, 세포외 빙결 정 형성, 세포외 수분동결)에 관련된 열량으로 구성되며, 동 결속도에 따라서 빙결정의 크기, 형상, 수가 달라지고, 동일 한 동해방어제 및 동결속도라 하더라도 현탁액의 해조류 세 포내 및 세포외 수분함량의 분포 및 조성성분에 따라서 빙결 정의 형셩 특성이 달라지고 세포내외의 빙결에 의한 방출열 량의 차이를 보이고 있다 [34].

3.7. 동결 속도 상수

P. seriata, U. pinnatifida, S. fulvellum 현탁액의 동결과정에서 의 발열 반응곡선으로부터 DSC partial kinetics program으로 구한 동결속도상수 값은 전체 동결 열량에 대한 각 온도에서 의 열유속(heat flux)의 크기를 나타내며, 최대점이 존재한다.

동결에 의하여 동결속도상수는 최대점까지 열유속이 증가 하고 그 후로 감소되므로 해조류의 동결에 의한 반응이 최대 가 되는 온도를 결정할 수 있다[35]. 현탁액의 동결과정에서 동결 초기에 동결속도상수의 값이 크게 나타나므로 초기에 사 멸율이 높은 것으로 판단된다.

3.8. 활성화 에너지

활성화에너지 (Ea)는 동결점에서 동결이 완료되는 동결종료 온도사이의 각 온도에서의 발열반응인 동결공정이 진행되 기 위해서 필요로 하는 최소의 열량을 알 수 있는 지표로써 활성화에너지는 빙결정의 형성에 관여하는 물성치이며, 동 결속도 및 빙결정의 크기와 상관성을 가지고 있다 [36-38].

활성화에너지가 커지면 빙결정의 크기가 크고 성장함을 나 타낸다.

각각의 해조류의 활성화에너지는 P. seriata 39.71 J/g·mole

Fig. 11. Freezing time and exohtermic temperature of Sargassum fulvellum suspension.

Fig. 10. Freezing time and exothermic temperature of Undaria pinnatifida suspension.

Fig. 9. Freezing time and exothermic temperature of Pyropia seriata suspension.

Fig. 12. Latent heat of freezing.

~2.47 J/g·mole, U. pinnatifida 46.44 J/g·mole~ 2.64 J/g·mole, S. fulvellum 40.96 J/g·mole~2.35 J/g·mole의 값을 나타내었으 며, 동결속도가 클수록 활성화에너지의 값이 작아지는 경향 을 보이고 있다. 이러한 결과로부터 동결속도가 커짐에 따라 서 크기가 작은 빙결정이 다수 생성되며, 동일한 동결속도에 서도 해조류 종류별 활성화에너지의 차이를 보이는 것은 생 성되는 빙결정의 크기에 차이가 있음을 나타내고 있다.

3.9. 상변화와 엔탈피 및 엔트로피

1차 동결단계에서의 영향을 최소화하고 안정성 및 효율을 고려한 최적 동결 속도 조건을 구하기 위하여 동결 공정에서 안정성에 관여하는 열물성인 entrophy (S)와 동결속도와의 관계를 Fig. 13에 나타내었다.

물은 동결점 이하의 초기 과냉각상태에서의 불안정성을 극복하기 위해서는 glass transition temperature근처의 온도로 낮춤으로서 안정한 상태로 전환시켜야 하며, glass transition temperature의 측정 및 규명은 어려운 과정이나, 동결공정의 일정온도에서의 열량변화인 엔트로피 (ds=dq/T)의 측정으로 안정 상태로의 도달의 추정이 가능하다 [35]. 해조류의 종보 존 현탁액에는 해수가 포함되어 있으므로 물의 특성을 나타 내게 되며, glass transition temperature의 온도 이상에서의 불 안정성으로 인하여 해조류 사상체 조직이 영향을 받을 수 있 으므로 최적의 동결보존 조건을 결정하기 위해서는 동결공 정의 일정온도에서의 열량변화인 엔트로피가 최소가 되는 동결속도의 결정이 중요하다.

Fig. 13 의 P. seriata, U. pinnatifida, S. fulvellum 현탁액 각각 의 동결속도에 따른 엔트로피의 변화는 동결 속도에 상관성 을 보이며, 1.0

C/min이하에서는 큰 편차를 나타내는 반면에 1.0

C/min 이상에서는 거의 일정하게 안정화되고 있으므로 최적의 동결 속도는 1.0

C/min로 하는 것이 적절한 것으로 생각된다.

Table 2. Freezing kinetic constant of Pyropia seriata suspension in the process of freezing

Material Cooling rate (^oC/min )

0.1 0.2 0.5 0.75 1.0 1.25 1.5 1.75 2.0

P. seriata

3.15 43.23 16.69 21.94 37.97 427.45 782.27 1071.53 1088.23

1.46 19.53 67.94 98.99 106.99 183.96 338.32 426.03 470.66

0.81 10.69 37.09 56.10 95.14 109.39 178.46 236.77 268.30

0.50 7.06 22.73 33.87 59.59 66.74 107.13 144.98 156.07

0.29 4.72 14.13 21.33 35.26 40.86 64.30 86.86 90.92

0.22 3.12 9.51 12.88 22.53 26.79 39.53 55.40 56.21

0.15 1.79 5.27 7.57 12.75 16.05 22.91 33.64 32.55

0.09 0.92 2.92 4.05 7.44 9.34 12.49 16.46 17.70

0.04 0.40 1.08 2.01 3.68 3.08 4.93 8.15 6.99

Table 3. Freezing kinetic constant of Undaria pinnatifida suspension in the process of freezing

Material Cooling rate (^oC/min )

0.1 0.2 0.5 0.75 1.0 1.25 1.5 1.75 2.0

U. pinnatifida

10.03 39.35 111.65 265.94 416.03 542.10 1072.77 1091.04 1320.39

3.83 16.93 47.45 113.75 173.96 237.64 446.23 455.85 550.49

2.19 8.17 26.29 63.78 99.60 127.46 226.78 250.81 300.08

1.43 5.15 16.44 37.89 61.75 74.76 139.44 144.61 178.98

0.97 3.22 10.71 23.43 39.56 44.45 87.57 88.27 118.47

0.53 1.44 6.19 13.54 25.85 25.47 55.85 54.28 72.15

0.32 0.96 3.62 8.16 14.23 15.15 36.12 31.39 45.93

0.13 0.52 1.92 3.99 8.79 7.42 18.73 17.07 25.57

0.04 0.31 0.63 1.57 3.72 3.66 6.90 6.76 9.46

Table 4. Freezing kinetic constant of Sargassum fulvellum suspension in the process of freezing

Material Cooling rate (^oC/min )

0.1 0.5 1.0 2.0

S. fulvellum

14.10 298.92 798.06 2013.77

6.34 126.03 344.90 849.95

3.65 70.95 192.70 501.36

2.30 44.88 119.55 311.16

1.57 28.79 78.36 200.80

1.27 18.63 51.13 126.63

0.54 11.07 30.45 80.77

0.31 5.70 17.68 45.02

0.15 2.80 7.71 22.26

Table 5 Activation energy of Pyropia seriata, Undaria pinnatifida and Sargassum fulvellum suspension in the process of freezing

Material Cooling rate (^oC/min )

0.1 0.5 1.0 1.5 2.0

P. seriata 39.71 11.55 5.31 3.22 2.47

U. pinnatifida 46.44 9.55 6.36 4.39 3.68 S. fulvellum 40.96 9.56 5.18 3.13 2.35

엔탈피는 관계식 ΔH= TΔS + ΔF 로부터 자유에너지(ΔF) 와의 상관성을 가지며, 자유에너지는 동결전에는 작은 값을 가지나 빙결핵이 생성되고 동결이 진행되면 최대값을 지나 동결 종료시 최저값을 나타내게 된다 [39]. 엔탈피는 자유에 너지의 변화에 영향을 받으며, 해조류의 종보존을 위한 동 결보존시스템의 설계 및 냉동부하 계산에 필수적인 열물성 치이다.

Fig. 14에서 P. seriata, U. pinnatifida, S. fulvellum 현탁액의 엔탈피는 동결 속도에 상관성을 나타내며, 동결속도가 커지 면 온도의 급속한 강하로 해조류 사상체 현탁액의 엔탈피의 값이 낮아지며, 동결속도 1.0

C/min이상에서는 엔트로피와 유사하게 안정화되고 있다.

4. CONCLUSION

해조류의 종보존을 위한 1차 동결공정에서 P. seriata, U.

pinnatifida, S. fulvellum 현탁액의 열물성을 측정하여 최적동 결조건을 결정하였다. 저온현미경의 관찰에 의하여 –35

C이 하의 온도에서는 동결에 의한 빙결정이 안정화됨으로써 2차 처리공정이 가능한 최적의 온도이며, 보존 매체액의 동결잠 열은 물>해수>동결보존액의 순으로 큰 값을 나타내었으며, 동결잠열이 작을수록 동결과정 중에 빙결정의 형성에 따른 상변화에 관여하는 열량이 감소됨으로써 열적 영향력이 저 하되고 사멸율이 줄어들므로써 생존율을 높일 수 있는 요인 이 된다. 그러므로 동결잠열이 작은 동해방어제를 선정해야 하며, 동결잠열이 생존율의 예측 열물성으로 활용될 수 있음 을 확인하였다.

또한 동결 종료 온도의 범위는 P. seriata –20.5

C~-30.5

C, U. pinnatifida –18.1

C~–27.8

C, S. fulvellum –17.0

C~ – 27.1

C였으며, 동결진행시간이 최소가 되는 최적냉각속도를 1.0~1.5

C/min로 나타났다.

P. seriata, U. pinnatifida, S. fulvellum 현탁액의 동결잠열은 각각 153.58 J/g, 146.67 J/g, 123.08 J/g 으로 미역이 가장 큰 값을 나타내었으며, 각각의 동결 속도에 따른 엔트로피 및 엔탈피의 변화는 동결 속도 1.0

C/min이상에서는 거의 일정 하였으므로 급속동결이 미세한 ice crystal의 형성에 의한 조 직의 안정화에는 유리하나 열효율을 고려하여 최적의 동결 속도는 1.0

C/min 가 적절한 것으로 생각된다.

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