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수혈불응증 을 일으킬 수 있

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Academic year: 2021

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년 월 일 년 월 일 년 월 일

:윤 수 영 경기도 안산시 단원구 고잔 동 고대안산병원 진단검사의학과

본 연구는 년도 정부 중소기업기술청 의 재원으로 한국과학재단의 지원으로 수행되어졌음

1233445552

고려대학교 의학전문대학원1, 고려대학교 의과대학 진단검사의학교실2, 대한적십자사 혈액수혈연구원3, 대한적십자사 혈액관리본부4, 예비티5

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인구의 노령화와 더불어 장기이식 조혈모세포 이식 각종 암 질환에 대한 화학요법 등 보다 적극 적인 치료방법의 적용으로 인해 적혈구제제 및 혈 소판 제제에 대한 수요는 계속 증가 하고 있다 반 복적인 수혈 시 같이 혼입되는 백혈구는 수혈된 후 발열성수혈부작용을 일으킬 수 있고 등 백혈구 항원에 의한 동종면역이 유발되어 혈소판

수혈불응증 을 일으킬 수 있

으며 이식편대숙주병을 일으키기도 한다 또한 등의 바이러스는 백혈구 세포 내에서 증식하므로 수혈될 백혈구가 일종의 바이러스 운반체로 작용할 수 있으므로 면역기능 이 저하 되어 있는 환자에게 등 바이러스 감 염을 유발할 수 있다 이러한 부작용을 감소시키 기 위해 백혈구를 줄이기 위한 노력으로 필터를 이용한 여과법 등이 통상적으로 사용되고 있다 발열성수혈부작용을 예방하려면 혈액제제에 함유 되어 있는 백혈구 수를 개 이하로 줄여야 하 고 동종면역을 예방하기 위해서는 개 이 하로 감소시켜야 한다 이식편대숙주병을 막기 위해서 필요한 최소 림프구의 수는 아직 확인되지 않았지만 현재 사용하는 백혈구제거필터로는 여 전히 예방할 수 없고 혈액제제의 방사선조사만이 유일한 예방법이라고 할 수 있다

압타머 는 그 자체로 안정된 삼차구조 를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으 로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 또는 변형핵산 으로 표적분자에 결 합할 수 있다 이러한 특성 때문에 자주 단일 항

체와 비교가 되고 라고도 불

릴 정도로 대체항체로서의 가능성도 매우 높다 년

기술 이 발표된 후

압타머를 응용한 여러 기법들이 소개 되고 있다 압타머는 균일하면서도 고순도로 생 산이 가능하고 크기가 항체보다 작아 안정적이면 서도 체내에서 면역반응을 유발하지 않아 현재 압타머는 질병치료나 진단용으로서 많은 연구가 진행되고 있다

본 연구에서는 압타머를 이용한 세포제거 기 술을 혈액필터에 적용하고자 항원에 결합 하는 압타머를 발굴하여 자석비드에 부착한 후 수혈 혈액을 필터링함으로써 해당 항원을 가진 세포 즉 백혈구를 제거하도록 하는 압타머필터의 개발 가능성을 평가하였다

대한적십자사로부터 부적격으로 폐기되는

백혈구여과제거적혈구 와

항응고제 함유 단위를 연구용 혈액 대상으로 하였다 백혈구여과제거적혈구는 백혈구제거필 터

가 부착된 채혈백

녹십자 충북 한국 을 이용하여 제조하였다

백혈구 공통항원인 에 대한 압타머 는 포항공대 압타머사업단에 의 뢰하여 받은 압타머를 사용하였다

이 포함된 비드와 증류수에 용해시킨

압타머를 실온에서 밤새도록 균질화 시켰다 증

류수로 번 세척하고 에 압타머

고정비드를 보관하였다

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멸균생리수 중외생명과학 충남 한국 과 압타머 고정비드 와 균질화 시 킨 후 혈액백에 주사기를 사용하여 압타머 고정 비드용액 을 투입하고 분간 냉장고에서 교반하여 압타머 고정비드와 내의 잔여백 혈구를 결합시켰다 압타머 고정비드를 제거하기 위하여 실온에서 혈액백을 자석 서울 한 국 위에 분간 정치한 후 혈액백을 기울여 연결 된 빈 백으로 혈액의 상층액을 옮겼다 압타머가 제거된 상층액만 회수하기 위해

에서 분간 정 치하는 과정을 회 반복 하였다 실온에서의 실 험은 한시간 이내에 끝마쳤으며 잠시라도 중간 에 실험이 지연될 경우에는 냉장 보관하였다

백혈구여과제거적혈구 및 압타머필터 후의 혈

액제제에서 자동혈액분석기

를 이용하여 적혈구 백혈구 수를 측

정하고 서울 한국 을

이용하여 백혈구 수를 측정하였다 이때 혈액검

체 을 배지

와 배지

에 접종하고

에 장착하여 일간 배양하며 세균 검사를 하였다

백혈구여과제거적혈구 단위의 평균 잔여 백

혈구 수는 제제 한 단위당 개였으며 압

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타머필터 후 백혈구여과제거농축적혈구 단위 의 잔여 백혈구 수는 평균 개로 감소하 여 백혈구 제거율은 압타머필터 후 평균 였다

백혈구여과제거적혈구 단위의 평균 적혈구 수는 단위당 개였으며 압타머필터 후 평균 적혈구수는 단위당 개로 적혈구 회 수율은 였다

압타머필터 전후 세균 배양 검사는 모두 음성 결과를 보였다

혈액제제 내에 혼입된 백혈구로 발생하는 부 작용을 예방하기 위해서 백혈구필터를 이용한 백 혈구의 제거가 널리 이용되고 있다 최근에 사용되는 ∼ μ 의 를 갖는

는 수혈 시 저장혈액에서 생길 수 있는 및 생명력을 잃은 적혈구 백혈 구 및 혈소판 등의 육안적 혈괴 뿐 아니라 혈액의 저장기간의 연장에 따른 미세응집까지도 제거하 고 있다 백혈구로 인한 수혈부작용을 방지하기 위해서는 총 백혈구 수를 감소시키는 것 외에 혈 액제제 내에 어떤 종류의 백혈구가 남아있는지도 중요한데 혈액내의 적은 양의 수지상 세포들이

에 강한 자극제로 작용하거나

을 가진 세포들이 수혈 후 강한

면역력을 보여 동종면역에 관여 하는 것으로 알

려져 있다

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면역억제 골수를 가진 환자 장기이식 수여자 빠른 기간내에 동종골수이식이 예정된 환자는 이 식편대숙주병을 일으키지 않도록 혈액제제내의 생존 림프구수를 충분히 낮추기 위해 방사선조사 된 혈액을 사용한다 하지만 방사선 조사는 혈액 제제에 불리한 영향을 줄 수 있는데 용혈로 인한 칼륨 이온의 유출과 나트륨 이온의 유입 증가

감소

과 의 증가 등은

잘 알려져 있다 뿐만 아니라 방사선 조사 후 장기간 저장 시 적혈구의 생존능력이 저하되므로 유효기간이 충분한 적혈구에 대해 방사선을 조사 했을 경우 최대 일까지만 사용하도록 규정하고 있다 방사선 조사가 적혈구 막에 손상을 가져 오고 생존능력을 저하시키는 원인이 아직 정확 하게 규명된 것이 아니지만 방사선 조사 시 발생 하는 반응성산소종

이 중요 요인으로 추정되고 있다

상용 백혈구제거필터를 이용한 방법이 이식편 대숙주병의 위험을 완전히 막을 수 없다 하더라 도 년도에 과 가 발표한 보고에서 백혈구제거필터를 사용한 후 상당한 정도로 이식 편대숙주병이 감소된 것을 볼 때 백혈구제거필터 의 효율을 높여 충분한 수의 백혈구 혹은 특정 림 프구의 수를 감소시킨다면 이러한 부작용을 가지 고 있는 방사선조사를 대체할 수 있을 것으로 기 대된다

기존의 검사시약에 사용되는 면역 항체의 경 우 동물이나 세포를 이용하여 만들기 때문에 생 산하는데 많은 시간과 비용이 요구되며 또한 비 특이적 반응이 많아 만든 시기에 따라 기능성도 다르다 그에 비해 압타머는 특정 항원을 선정하 여 화학적 방법으로 합성하므로 단시간에 적은 비용으로 생산이 가능하고 고순도의 정제가 매우 용이하여 생산적인 측면에서 탁월한 장점이 있

다 그리고 실온에서 보관이나 운반이 가능하고 변성이 되더라도 다시 짧은 시간에 재생이 가능 하기 때문에 장시간 또는 반복사용이 요구되는 진단용으로 사용이 가능하다 또한 다른 의약용 단백질의 경우에 쉽게 나타나는 생체 내 면역거 부반응이 거의 일어나지 않는 것으로 알려져 이 는 임상치료용으로 매우 중요한 장점이 될 수 있 다 이 예로 현재 임상에서 사용되는 압타머로는 황반변성

을 유발하는 단백질과 특이적으로 결합하 며 그 결과 단백질이 와 결 합하는 것을 막음으로써 에 탁월한 치료 효 능이 있는 과 과도한 혈전형성을 유발하 는 에 선택적으로 결합함으로써 혈전형성을 억제하는 사의 혈전성 미세 혈관 질환 치료 등이 있다 나아가 와 압타머를 융합하여 에 응용하거나 특정 표지자에 대한 압타머를 이용하여 생체 내 세포의 탐지 로 사용하려는 연구도 활발하 게 이루어지고 있다

클리니맥스 로 그 효과가 입증되어 이미 임상에서 사용되고 있다 항체를 이용 하여 환자나 공여자에서의 골수 또는 말초혈액에 서 조혈줄기세포를 무균적으로 분리하여 고농도 로 농축하거나 나아가 을 사용하여 해당 림 프구를 최소화하여 이식편대숙주병을 방지하는 데 사용하고 있다 그러나 고가의 항체를 이용 하므로 비용이 매우 높아 일상적인 혈액제제의 백혈구 제거용으로 사용하기에는 무리가 있다고 할 수 있다

이런 시스템에 항체 대용으로 화학적으로 합

성이 가능한 압타머를 대체 사용하면 비용을 절

감 할 수 있고 안정성도 높아져 혈액제제의 백혈

구 분리용으로 사용할 수 있을 것으로 기대할 수

있다 본 연구에서는

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을 타겟으로 제작한 압타머를 이용하여 혈 액제제 내에 존재하는 미량의 잔여 백혈구와 반 응하도록 하여 의 백혈구를 제거하였다 백 혈구제거 필터 사용시 중요한 평가척도 중 하나 는 해당 혈액제제의 혈구 성분 변화를 최소화 하 는 것이라 할 수 있는데 압타머 필터 후 적혈구 회수율은 매우 우수한 결과를 보였다 그러나 압 타머 필터를 실제 임상에서 사용하기 위해서는 필터 후 잔존 압타머비드의 잔재 여부와 응고인 자 등 혈장 성분에 미치는 영향 용혈 여부 수혈 후 적혈구의 생존율 등이 추가로 확인되어야 할 것이다 또한 압타머필터의 효율이 기존 상용필 터와 비교하여 충분한지를 입증하기 위해 기존의 상용필터와 새로 개발된 압타머 필터를 이용하여 각각 제거를 하고 그 제거율을 비교 분석하여 현 재 사용하고 있는 상용필터의 성능에 뒤떨어지지 않는 결과를 뒷받침되도록 고안된 연구가 필요하 다

낮은 농도의 백혈구를 측정하기 위해서는 분 석민감도와 정밀도가 높은 측정법을 사용하는 것 이 필수적이라고 할 수 있다 본 실험에 사용된

의 검출한계는 개 μ 로 단위 당 개에 해당되며 단위 당 개에서 가 이하로 다른 방법인 법과 나지오 챔버계수방법에 비해 우수하다고 보고되어 있 다 본 연구의 예비 실험에서도 단위 당 개에 서 가 이내로 유세포분석기를 이용한 방 법보다 높은 재현성을 보여 측정에 적절할 것으 로 판단되었다

본 실험은 압타머를 이용하여 백혈구를 제거 할 수 있다는 가능성을 보여주는데 의의가 있다 고 할 수 있다 향후 발굴될 압타머의 항원 친화 성을 높이고 필터과정을 개선하면 백혈구 제거율 을 더 향상시킴으로써 잔존백혈구를 충분한 정도 로 낮출 수 있다면 와 같은 수혈부작용의

위험을 획기적으로 감소시킬 수 있을 것으로 기 대된다

본 연구는 압타머를 이용한 세포제거 기술을 혈액필터에 적용하고자 항원에 결합하는 압타머를 발굴하였고 이를 비드에 부착한 후 혈 액제제와 반응시켜 백혈구를 제거하는 압타머필 터를 개발하였으며 성공적으로 백혈구를 제거하 는 것을 확인하였다 이는 압타머 필터의 임상적 사용가능성을 보여주는 것으로 현재 고비용 고위 험의 방사선조사 등의 과정을 대치 할 수 있을 뿐 아니라 특정세포의 농축이나 제거에 다양하게 압 타머를 사용할 수 있을 것으로 기대된다

혈액제제 내에 혼입된 백혈구로 발생하 는 부작용을 예방하기 위해서 백혈구필터를 이용 한 백혈구의 제거가 널리 이용되고 있다 그러나 상용 백혈구 필터로는 이식편대숙주병을 예방하 기에는 충분한 백혈구제거가 되지 않아 고가의 기기를 이용한 방사선 조사를 시행하고 있는 실 정이다 한편 항체를 대체하는 압타머를 이용한 기술들이 활발히 개발되어 임상에 사용되기 시작 하고 있다 이에 백혈구에 결합하는 압타머를 이 용한 압타머필터를 개발 하여 그 효율과 임상적 용 가능성을 평가하고자 하였다

포항공대 압타머사업단에 항원에 결합하는 압타머 선별을 의뢰하여 제공받았으며 이를 비드에 부착시켜 백혈구와 결합하도록 한 후 자석을 이용해 제거하는 형식의 압타머필터를 개발하였다 대한적십자사 혈액원에서 제공받은 백혈구제거적혈구 단위에 압타머필터를 사용 하여 잔여 백혈구를 제거한 후 백혈구 제거율과 적혈구 회수율 세균배양을 시행하였다

압타머필터 후 백혈구는 가 제거되

(7)

었으며 의 적혈구회수율을 보였다 세균배 양에서는 아무것도 자라지 않았다

압타머를 이용한 세포제거 기술을 혈액

필터에 적용하고자 항원에 결합하는 압타

머를 발굴하여 비드에 부착한 후 수혈 혈액을 필

터링함으로써 해당 항원을 가진 세포 즉 백혈구

를 제거하도록 하는 압타머필터를 개발하여 이를

평가하였다 향후 압타머 부착 효율 및 필터과정

개선 다른 항원에 대한 압타머 적용 등을 통해

혈액제제에서 백혈구 제거율을 높여 이식편대숙

주병 예방을 위한 방사선조사를 대체하는 등 임

상에 적용할 수 있을 것으로 생각된다

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참조

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