12.372 and R

대황으로부터 질염 원인 균주에 대한 항균성 물질의 분리 및 정제

송가현, 고희선, 김현수*

Separation and Purification of Antimicrobial Substance from Rheum palmatum L. against Vaginitis-inducing Strains

Ga-Hyeon Song, Hee-Sun Ko, and Hyun-Soo Kim*

Received: 15 September 2020 / Revised: 5 February 2021 / Accepted: 15 March 2021

© 2021 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract: The present study aimed to explore natural sub- stances as an alternative to antibiotics that result in adverse effects, such as reduced counts of essential lactic acid bacte- ria in the vagina and compromised vaginal function. For this purpose, Rheum palmatum L. methanol extracts were used to separate substances that do not inhibit lactic acid production in the vagina while inhibiting the pathogens causing vaginitis using different methods used in previous studies. Extraction was performed to separate the substance in the R. palmatum L. methanol extract with antibacterial activity against patho- gens causing vaginitis. The maximum antibacterial substance was detected in the ethyl acetate layer extract on TLC (Thin Layer Chromatography). Fractionation by silica gel column chromatography to separate the antibacterial substance from the R. palmatum L. ethyl acetate layer extract revealed that fraction 4 had the maximum antibacterial substance. In addi- tion, on analyzing fraction 4 using HPLC, two peaks were identified and separated at R

12.372 and R

13.44 min, with peak purities of 82.8% and 92.9%, respectively. After concen- trating the fractions from both the peaks to 10 mg/mL, their antibacterial activity was tested against pathogens causing vaginitis and a beneficial strain found in the vagina. Inhibi- tory zones of 7 mm and 6.5 mm against Sphingomonas pauci- mobilis KCTC 2834 and Proteus mirabilis KCTC 2510, respectively, were identified. No antibacterial activity was found against the vaginal strain Lactobacillus coleohominis KCTC 21007.

Keywords: Rheum palmatum L., vaginitis, antibacterial activity, lactobacillus, purification

1. INTRODUCTION

질염은 사춘기 이후 여성의 외음부인 질내 정상 세균의 분포 에 변화가 생겨 산도가 감소하고, 특정 병원균에 감염되어 염증이 발생한 질병을 말한다. 질염의 종류에는 세균성 질염 (bacterial vaginosis), 트리코모나스 질염(trichomonas vaginitis), 칸디다 질염(vulvovaginal candidosis)이 있다 [1]. 이러한 질 염은 항생제를 이용해 치료한다. 그러나 항생제를 이용한 치 료는 항생제 내성균 증가 및 질 내에 서식하는 다수의 필수 적인 유산균의 감소 및 기능의 약화가 회복되지 않아 재발되 는 문제점이 있다 [2].

여성 질 내의 유산균은 성숙한 여성의 질 점막에 서식하는 다수의 그람양성 간균이다. 이 유산균은 여성의 질 점막 상 피의 여성호르몬 작용으로 인해 생성되는 glycogen을 영양 으로 번식하여 생산하는 젖산에 의해 질 내의 pH를 3.8~4.0 으로 유지함으로써 병원균의 침입을 방지한다. 따라서 질염 원인 병원균은 저해하면서 질 내의 유산균은 억제하지 않는 천연물질에 주목한다 [3]. 본 연구는 선행연구 [4,5]에 따라 질염 원인 병원균에 항균효과를 나타낸 대황(Rheum palmatum L.) 을 이용하여 실험하였다.

대황은 비교적 기온이 낮고 강수량이 적으며 공기가 희박 하고 일조량이 풍부한 지역에서 자라는 여러해살이풀로 한 방에서 해열소염진통제, 사하약, 고혈압용약, 피부질환용약 으로 사용되어 왔다 [6,7]. 건조 대황 뿌리의 가장 중요한 성 분은 chrysophanol, emodin, physicon, rhein, aloe-emodin과 안트라퀴논 유사체 [8]이며, Rheum 종의 여러 가지 안트라퀴

Major in Biological Sciences, Faculty of Basic Sciences, College of Natural Science, Keimyung University, Daegu 42601, Korea.

Tel.: +82-53-580-5284, Fax.: +82-53-580-5284 E-mail: [email protected]

Review Paper

논의 화학 성분과 치료 효과 사이의 상관관계에 관한 연구로 는 R. palmatum L.의 rhein과 sennosides가 설사작용을 한다 는 보고 [9]가 있다. 또한 안트라퀴논 유도체의 함량은 다른 Rheum 종에서 다양하다고 알려져 있으며, R. palmatum L.은 전체 함량의 3.4%, R. tanguticum은 1.2%만이 함유되어있다.

anthraquinones 이외에 여러 가지 tannin [10], chromones [11]

와 stilbenoids [12]가 미량 성분으로서 다른 약리작용을 가진 다고 보고되어있다. tannin의 함량 역시 종에 따라 다양하며, 대략 R. palmatum L.이 11%, R. emodi, R. franzenbachii, R.

hotaoense, R. officinale, 및 R. tanguticum은 4-7%라고 알려져 있다.

R. palmatum L. 의 emodin은 aloe-emodin보다 많으며, R.

tanguticum은 aloe-emodin은 없으나 당화된 rhein의 양이 상 당히 많다고 알려져 있다 [13,14]. Rhein은 Escherichia coli, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Candida albicans, Clostridium perfringens와 Fusofacterium varium에 대한 항균 활성이 보고되었다 [15].

최근 Ge 등 [16]은 대황의 상이한 위치를 기반으로 한 환경 적 대사체의 차이를 HPTLC와

H NMR을 이용하여 분석한 결과, 장엽대황(Rheum palmatum)과 탕구트대황(Rheum tanguticum)은 성장고도에 의해 화학적 변화를 받는 것을 확 인하였다. 즉, 고도를 담당하는 대사산물 분화는 chrysophanol, emodin 및 sennoside A였으며, 반면 aloe-emodin, catechin 및 rhein은 주요 종 특이적 마커임을 확인하였다.

본 연구에서는 선행연구 [4,5]를 참고하여 항균성 물질의 효율적인 분리를 위하여, 질염 원인 병원균에 항균활성이 나 타난 대황 methanol 추출물을 실험에 사용하였으며, 항균성 물질의 분리를 위한 TLC의 전개 방식 및 silica gel column chromatography의 분취에 있어서 다른 용매들을 사용하였고 n-hexane, chloroform, ethyl acetate와 H

O를 이용한 분별추출 을 수행하였다.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. 대황의 추출

실험에 사용한 한약재는 질염 원인 균주에 대한 항균활성이 나타난 대황(Rheum palmatum L.)을 선정하였으며, 약재는 원산지가 경북 의성으로 ‘토종마을’에서 구입하여 사용하였 다 [4]. 추출은 대황 10 g에 95% methanol 100 mL를 첨가하 여 28

C, 150 rpm에서 24시간 동안 진탕 추출하였다. 추출액 은 여과하여 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan)를 이 용하여 45

C에서 농축하였으며, 농축물은 4

C에 보관하여 실험에 사용하였다.

2.2. 실험균주 및 사용배지

실험에 사용한 질염 원인 균주는 선행연구에서 선정한 균주 를 선정하여 ATCC (American Type Culture Collection)에서 Candida albicans ATCC 10231을 분양받았으며, KCTC (Korean

Collection for Type Cultures) 에서 Chryseobacterium gleum KCTC 2904, Sphingomonas paucimobilis KCTC 2834, Proteus mirabilis KCTC 2510, 그리고 질 유용 균주인 Lactobacillus coleohominis KCTC 21007을 분양받아 사용하였다 (Table 1).

C. albicans ATCC 10231은 YM broth (Difco Co., USA)에 28

C, C. gleum KCTC 2904 와 P. mirabilis KCTC 2510은 nutrient broth (Difco Co., USA)에 각각 28

C와 37

C, S.

paucimobilis KCTC 2834는 R2A broth (Difco Co., USA)에 28

C, L. coleohominis KCTC 21007은 Lactobacilli MRS broth (Difco Co., USA)에 37

C의 온도에서 배양하였다. 고체배지 는 agar 20 g/L (Duksan Co., Korea)를 첨가 및 제조하여 사용 하였다.

2.3. Thin Layer Chromatography (TLC)

대황 methanol 추출물은 항균성 물질의 분리를 위하여 TLC 를 수행하였다. TLC plate (Silica gel 60 F254, Merck Co.)에 10 mg/mL 농도의 대황 methanol 추출물 1 μL를 점적하였으 며, 전개한 용매는 n-hexane, acetone, chloroform, methanol, ethyl acetate 와 methylene chloride를 비율별로 혼합하여 전개 하였다. 기준 물질은 선행연구를 수행하여 얻은 항균성 물질 인 TLC R

0.29의 분획을 사용하였다. 전개한 TLC plate는 UV lamp의 단파장인 254 nm와 장파장인 365 nm에서 spot을 확인하였고, 전개한 TLC plate에 10% 황산 시약을 스프레이 하여 100

C 의 hot plate에 열처리한 후 UV lamp를 이용하여 spot을 확인하였다.

2.4. 대황 methanol 추출물의 분별 추출

대황 150 g에 95% methanol 1,500 mL를 첨가하여 28

C에서 24 시간 동안 진탕하여 추출하였다. 추출액은 여과하여 rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축하였다. 농축물은 1,000 mL의 hot water에 용해하여 고정시킨 separatory funnel에 넣 고, 1,000 mL의 n-hexane, chloroform과 ethyl acetate 순으로 각각 실온에서 12시간 정치한 후 분별 추출하였고, 추출한 용매는 45

C 에서 농축하였다. 용매 별 농축한 추출물의 일정 량을 methanol에 용해한 후 TLC plate에 시료 5 µL를 점적하 여 methylene chloride와 methanol을 9:1의 비율로 조제한 전 Table 1. Strains used for anti-microbial activity

Strains Temperature (^oC) Source Candida albicans ATCC

10231 28 Man with

bronchomycosis Chryseobacterium gleum

KCTC 2904 28 High vaginal swab,

London U,K Sphingomonas

paucimobilis KCTC 2834 28 Vaginal swab

Proteus mirabilis KCTC

2510 37 Human vagina

Lactobacillus coleohominis

KCTC 21007 37 Vagina of healthy

woman

개 용매에 전개하였다. 전개한 TLC plate는 UV lamp의 254 nm와 365 nm 파장에서 spot을 확인하였고, 전개한 TLC plate에 10% 황산 시약을 스프레이하여 100

C hot plate로 열 처리한 후 UV lamp의 254 nm와 365 nm 파장에서 spot을 확 인하여 항균성 물질이 확인된 용매 분획물을 실험에 사용하 였다.

2.5. Silica gel column chromatography

분획물 중 항균성 물질 분리를 위하여 silica gel column chromatography를 수행하였다. 분획물은 methylene chloride와 methanol을 10:3의 비율로 조제한 용액에 농도 50 mg/mL로 용 해 후 시료로 사용하였다. Silica gel column (∅ = 7 × 27 cm)에 silica gel 60 (Merck Co., USA)과 methylene chloride와 methanol을 20:1의 비율로 조제한 용매를 혼합하여 높이가 30 cm가 되게 평형화 하였다. 시료는 2 mL 첨가하여 200 mL 씩 분취하였다. 분취한 분획은 TLC plate에 5 µL 점적한 후 전개하여 UV lamp를 이용하여 확인한 후 유사한 분획은 모 아서 농축하였다. 농축한 분획은 methanol에 용해하여 10 mg/mL의 농도로 조제한 후 TLC plate에 1 µL를 점적하여 전 개하여 항균성 물질을 회수하였다.

2.6. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Silica gel column chromatography를 통해 회수한 항균성 물 질의 순도를 확인하기 위하여 C

column (HAIsil C

5 micron. 250 × 4.6 mm)을 이용한 HPLC (Gilson, Inc., USA)를 사용하여 분석하였다. 항균성 물질 분획은 methanol과 acetonitrile 을 5:5로 한 이동상을 이용하여 유속을 0.8 mL/

min로 조정한 HPLC에 20 μL를 주입하여 분석하였다. 주입 후 HPLC 분석은 UV-visible detector (Gilson, Inc., USA)를 사 용하여 254 nm에서 측정하여 수행하였다.

2.7. 항균성 물질의 항균활성 측정

HPLC를 통해 분취한 A와 B의 분획은 질염 원인 균주에 대 해 항균성을 나타내는지 확인하기 위해 항균활성을 수행하 였다. 항균활성은 각 생육배지를 혼합 평판법으로 제조하여 paper disc를 이용해 agar diffusion 방법으로 확인하였다. 분 획물은 완전히 건조한 후 선행연구에서 C. gleum 균주에 대 해 항균활성을 나타낸 최소 농도인 10 mg/mL의 농도로 항균 활성을 수행하였다. 농도를 조정한 분획물은 paper disc ( ∅ = 6 mm, ADVANTEC, Toyo Roshi Kaisha, Ltd, Japan)에 20 μL를 분주하여 건조시킨 후 평판배지에 얹어 각 최적 생 육온도에서 24시간 배양하였다. Inhibitory zone의 유무 및 크 기를 통해 항균력을 확인하였다.

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 대황 methanol 추출물의 TLC 확인

TLC 전개는 n-hexane과 acetone을 3:1 비율로, n-hexane과 ethyl acetate 을 3:1, chloroform과 methanol을 3:1 그리고 methylene chloride와 methanol을 9:1의 비율로 전개하였다.

Fig. 1에 보인 methylene chloride와 methanol을 9:1의 비율로 전개하였을 경우 최적의 분리능으로 확인되어 항균성 물질 의 최적 전개 조건임을 확인하였다. 다른 전개 조건인 chloroform: methanol (3:1) 의 조건 (Fig. 1, F)을 비롯한 나머 지 조건들은 분리능이 미흡하였다. 선행연구에서는 대황 중 성 분획물의 TLC 분석 시 ethyl acetate와 methanol 조합에 의 한 전개용매를 사용하여 365 nm에 기준했을 때 16개의 band 가 나타났으나, 본 실험 조건에서는 methylene chloride와 methanol의 조합으로 된 전개용매를 사용하여 7개 정도의 band로 간결해졌다.

Fig. 1. TLC analysis of methanol extract from R. palmatum L. and antimicrobial substance from R. palmatum L.. Developing solvent;

methylene chloride : methanol = 9:1, A: UV 254 nm, B: UV 365 nm, C: sulfate colored TLC plate, D: sulfate coloring; UV 254 nm, E:

sulfate coloring; UV 365 nm, F: Developed with chloroform : methanol (3:1) and confirmed with UV 254 nm, a: methanol extract from

R. palmatum L., b: antimicrobial substance from R. palmatum L.

3.2. 대황 methanol 추출물의 항균성 물질 분리 3.2.1. 분별 추출

선행연구 [4,5]에서는 대황 methanol 추출물을 산성, 중성, 염 기성으로 분별 추출하여 실험하여 항균성 물질의 분리를 수행 하였으나 항균성 물질이 나타난 중성 분획물의 TLC를 수행한 결과 다양한 밴드 패턴과 항균활성의 범위가 넓어 항균성 물질 분리가 어려워 본 연구에서는 효율적인 분리를 위해 다양한 용 매를 사용한 분별 추출로 항균성 물질의 분리를 수행하였다.

대황 150 g은 methanol로 추출하여 농축액 84.6 g을 회수하 였다. 위의 실험재료 및 방법에 따른 분별추출을 통해 n- hexane 분획은 1.40 g을 회수하였고, chloroform 분획은 1.13 g, ethyl acetate 분획은 27.5 g, 그리고 H

O 분획은 26.9 g을 회 수하였다. 회수한 각 분획은 rotary vacuum evaporator를 이용 하여 농축하였다. 각 농축물들은 methanol로 용해하여 Fig. 2 에서 보는 바와 같이 TLC plate에 5 μL 점적 후 전개하여 spot 을 확인하였으며, 선행연구에서 확인한 항균성 물질(b)과 비 Fig. 2. Fractional TLC analysis after solvent extraction. Developing solvent; methylene chloride : methanol = 9:1, A: UV 254 nm, B:

UV 365 nm, C: sulfate colored TLC plate, D: sulfate coloring; UV 254 nm, E: sulfate coloring; UV 365 nm. a: antimicrobial substance from R. palmatum L., b: n-hexane layer of R. palmatum L. methanol extract, c: chloroform layer of R. palmatum L. methanol extract, d:

ethyl acetate layer of R. palmatum L. methanol extract, e: H

O layer of R. palmatum L. methanol extract.

Fig. 3. TLC analysis of fraction number 1~7 by silica gel column chromatography using ethyl acetate layer of R. palmatum L. methanol extract. Developing solvent; methylene chloride : methanol = 9:1, A: UV 254 nm, B: UV 365 nm, a: antimicrobial substance from R.

palmatum L.

교하여 분리가 용이하다고 판단한 ethyl acetate 분획을 이용 하여 silica gel column chromatography를 수행하였다.

3.2.2. Silica gel column chromatography

대황 ethyl acetate 분획은 silica gel column chromatography를 수행하였으며, 용출은 methylene chloride: methanol (20:1) 용 액으로 200 mL씩 분취하여 총 27개를 획득하였다. 분취한 Fig. 4. HPLC analysis of antibacterial substances (fraction number 4 of ethyl acetate layer) by silica gel column chromatography. Mobile phase: methanol : acetonitrile = 5:5, Flow rate : 0.8 mL/min, Detection: 254 nm, Injection: 20 µL.

Fig. 5. HPLC analysis of substance A and B separated by HPLC.

Mobile phase: methanol : acetonitrile = 5:5, Flow rate : 0.8 mL/

min, Detection: 254 nm, Injection: 20 µL.

Fig. 6. Antibacterial activity of substances A and B collected by HPLC from R. palmatum L. (A): C. gleum KCTC 2904, (B): S.

paucimobilis KCTC 2834, (C): P. mirabilis KCTC 2510, (D): L. coleohominis KCTC 21007. M: methanol.

분획은 총 7개의 분획으로 분리하였고, Fig. 3에서와 같이 TLC 분석을 통해 그 중 항균성 물질(a)을 함유한 단일 밴드 로 확인되는 no. 4, 5 분획 중 no. 4를 농축하여 0.25 g을 획득 하였다. 선행연구에서는 TLC로 확인 시 ethyl acetate : methanol (24:1, 22:3)의 조합으로 수행되었고 여전히 여러 밴드가 존 재하였으나, 본 실험에서는 methylene chloride : methanol (20:1)의 조합으로 silica gel chromatography를 수행한 것으 로 TLC 확인 시 뚜렷한 한 개의 밴드로 나타났다.

3.2.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Silica gel column chromatography 분획 중 항균성물질이 함 유된 ethyl acetate 분획인 no. 4 분획 (0.25 g)은 10 mg/mL의 농도가 되게 methanol로 용해시킨 후, methanol과 acetonitrile 을 5:5로 한 이동상을 유속 0.8 mL/min으로 일정 시간 base line을 안정화한 HPLC 상에서 시료 20 μL를 주입하여 분석 하였다. 그 결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 ethyl acetate의 no.

4 번 분획은 retention time (R

) 12.551 (57%) 과 13.516 (42.2%) 의 두 개의 peak (A, B)가 확인되었다. 이에 A와 B를 분취하 여 각각의 분획을 얻어 HPLC를 재수행하였다. 그 결과로 Fig. 5에서 보는 바와 같이 (A) R

12.372분의 peak는 peak purity가 82.2%로 확인되었고, (B) R

13.44분의 peak는 92.9%로 확인되었다. 선행연구 [4]에서는 TLC 상의 spot을 회수한 후 HPLC로 분석하는 방법으로 항균성물질의 존재만을 확인하 였고, 본 연구에서는 용매 선정을 통해 silica gel column chromatography를 수행한 다음 항균성 물질이 포함된 no. 4 번 분획을 찾아서 농축하고 HPLC로 분석한 결과에서 2개의 main peak 를 확인하였다. 각각은 HPLC를 통해 분취하여 항 균성 확인에 이용하였다.

3.2.4. 항균활성 확인

HPLC를 통해 분취한 A와 B를 10 mg/mL의 농도로 조정하여 질염 원인 균주와 질 유용 균주에 대해 항균활성을 수행하였 다. B 분획에서는 모든 균주에 항균활성이 나타나지 않았으 나, A 분획의 경우 C. gleum KCTC 2904에서 10 mm의 inhibitory zone이 확인되었고 S. paucimobilis KCTC 2834에서 7 mm, P.

mirabilis KCTC 2510에서 6.5 mm의 inhibitory zone이 확인 되었으며, 질 유용 균주인 L. coleohominis KCTC 21007에서 는 항균력이 나타나지 않음을 확인하였다 (Fig. 6). 본 연구에 서 대황에서 얻은 이 A 분획의 물질은 질염 원인 균주에는 항 균활성을 보이나 질 건강에 유익한 유산균은 저해하지 않는 천연 질염 치료제로서 선행연구에서 얻은 물질과 같은 항균 성 물질로 추정할 수 있었다. 본 연구의 방법으로 얻어진 질 염 원인 균주에 대한 항균성 물질에 대해 추후연구로서 A와 B 물질의 관계, NMR 분석 등을 통한 물질 규명이 필요하다.

4. CONCLUSION

질염은 사춘기 이후 여성의 질내에 병원균이 감염된 질병으

로 세균성 질염, 트리코모나스 질염, 칸디다 질염이 있다. 이 에 대한 치료로 질 내의 필수적인 유산균 수 감소 및 기능의 약화 등 문제점이 있는 항생제치료 대신 천연물 치료제를 탐 색하기 위해 본 연구에서는 대황 methanol 추출물을 이용하 여 질염 원인 병원균은 저해하면서 질 내의 유산균은 억제하 지 않는 물질을 선행연구와 달리한 추출방법을 모색하여 분 리하고자 하였다.

대황 methanol 추출물의 질염 유발 병원균에 대한 항균성 물질을 분리하기 위해 분별 추출을 하였고 ethyl acetate 층 추출물에서 항균성 물질이 가장 크게 나타나는 것을 TLC를 통해 확인하였다. 대황 ethyl acetate 층 추출물에서 항균성 물질을 분리하기 위해 silica gel column chromatography를 수 행하여 1~7번 분획 중 4번 분획에서 항균성 물질이 가장 크 게 나타나는 것이 확인되었다. HPLC를 이용하여 4번 분획 을 분석한 결과 R

12.372 (A)와 R

13.516 (B)로 2가지 peak 가 확인되어 HPLC로 각각 분리하여 분취하였다. 그 결과로 A 의 peak purity가 82.8%, B가 92.9%로 확인되었다. A와 B를 각각 농축하여 10 mg/mL의 농도로 조정 후 질염 원인 병원 균과 질 유용 균주에 대해 항균활성을 확인한 결과는 B 분획 에서는 모든 균주에 항균력이 나타나지 않았으나, A 분획은 C. gleum KCTC 2904에서 10 mm, S. paucimobilis KCTC 2834 에서 7 mm, P. mirabilis KCTC 2510에서 6.5 mm의 inhibitory zone이 확인되었으며, 질 유용 균주인 L. colehominis KCTC 21007에 대해서는 항균력이 나타나지 않아 대황 추출 물의 천연 질염 치료제로서의 개발 가능성을 재확인하였다.

Acknowledgement

이 논문은 2020년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단 의 지원을 받아 수행된 기초연구사업입니다 (NRF-2017 R1D1A1B03036147).

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