“Epigenetics”란 “outside conventional genetics”로 발생이

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“Epigenetics”란 “outside conventional genetics”로 발생이

deacetylation)이 관여하는 것으로 알려져 있다. 이들 두 과 정 사이의 불균형은 cancer나 leukemia의 형성에 중요한 역할을 하게 되며, 이런 이유로 이들 두 과정에 관여하는

여러 가지 요소들은 epigenetic modification의 작용점으로 서 관심이 증가되고 있는 추세에 있다. 현재, 임상시험에 서는 개발된 몇 종류의 DNA methylation과 histone dea- cetylase (HDAC)의 억제제가 암 환자들에게 적용되고 있 다. 이러한 epigenetically-effective drug들은 다양한 진단 표 지자(biomarker)의 발굴과 더불어 drug의 efficacy를 더 향 상시킬 수 있을 것이다.

DNA Methylation과 Histone Modification

DNA methylation은 DNA methyltransferase의 작용으로 S-adenosylmethionine으로부터 methyl기를 DNA cytosine의 5’-탄소에 전달하는 과정을 의미하며, 이러한 methylation

치료 작용점으로서의 Epigenetic 조절자

부경대학교 자연과학대학 미생물학과 김 군 도

Epigenetic Controllers as a Therapeutic Target

Gun-Do Kim

Department of Microbiology, College of Natural Sciences, Pukyong National University, Busan 608-737, Korea Epigenetic processes required DNA methylation and histone modification which are regulated by several classes of enzymes in the cells. Imbalances in histone acetylation and DNA methylation lead to an aberrant behavior of the cells in morphology, cell cycle, differentiation, and carcinogenesis. Thus, the enzymes regulating the reactions can be considered as a therapeutic target of epigenetic modification.

Clinical trials designed to evaluate inhibitors of DNA methyltransferases and histone deacetylases at phase I or phase II are showing encouraging results in cancer patients. A growing number of genes that are silenced by epigenetic inactivation can be used as biomarkers to monitor the efficacy of epigentically- effective drugs. (Cancer Prev Res 10, 1-5, 2005)

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Key Words: Epigenetics, DNA methylation, Histone modification, Acetylation, Deacetylation, Biomarker,

Drug efficacy

책임저자：김군도, ꂕ 608-737, 부산광역시 남구 대연3동 599-1 부경대학교 자연과학대학 미생물학과

Tel: 051-620-6368, Fax: 051-611-6358.

E-mail: [email protected]

접수일：2005년 1월 20일, 게재승인일：2005년 2월 14일

Correspondence to：Gun-Do Kim

Department of Microbiology, College of Natural Sciences, Pukyong National University, Busan 608-737, Korea

Tel: +82-51-620-6368, Fax: +82-51-611-6358 E-mail: [email protected]

은 주로 DNA (cytosine-5) methyltransferase (DNMT) 1에 의 해 hemimethylated DNA에서 주로 일어난다. 현재까지 알 려진 methylation의 기능을 가진 DNA (cytosine-5) methyl- transferase로는 DNMT1, DNMT3a와 DNMT3b가 존재하 며, 이들은 서로 다른 작용부분을 통하여 복합체를 형성 하면서 methylation을 유도하는 것으로 알려져 있다. 특 히, DNMT3a와 DNMT3b는 de novo 작용으로 hemimethy- lated DNA뿐만 아니라 non-methylated DNA에도 methyla- tion을 유도할 수 있다는 보고들이 있다. Histone deacety- lase (HDACs), Rb 또한 이들 DNMT family와 더불어 trans- criptional repressive 복합체를 형성한다. 이 이외에 DNMT1, DNMT3a/b에 존재하는 regulatory N-terminal이 존재하지 않는 putative methyltransferase인 DNMT2가 알려져 있다.

Histone modification 과정은 두 가지의 효소, histone acetyltransferase (HAT)와 HDAC의 상호작용에 의해 조절 되는 과정으로, histone의 hypoacetylation은 응축된 chroma- tin 구조를 유도하여 gene transcription을 억제시키는 반면 histone acetylation은 느슨한 chromatin 구조를 유도하여 transcription을 활성화시킨다. HAT은 GNAT (GCN5- related N-acetyltransferase) family, MYST와 p300/CBP (CREB [cAMP response-element binding site]-binding protein) family 로 구분되며, 기능적으로는 acetyl-CoA로부터 acetyl기를 histone 단백질의 특정 lysine의 e-amino기에 전달하는 역 할을 한다. 이와는 달리, HDAC은 core nucleosomal histone (H2A, H2B, H3와 H4)의 말단에 존재하는 lysine으로부터

acetyl기를 제거하는 역할을 하며 구조적 차이를 토대로 크게 3가지 class로 구분되어 각기 다른 위치의 lysine을 작용점으로 사용하고 있다(Table 1).

Aberrant Epigenetic 현상과 암과의 관계

2000년대에 들면서 다수의 연구결과는 DNA methyl- ation과 histone modification의 불균형이 암의 발생과 진전 에 중요한 역할을 한다고 주장하며, 이들 두 과정이 어떻 게 chromatin remodelling, DNA replication 그리고 cell cycle, apoptosis와 angiogenesis 과정에 관여하는 여러 유전자의 transcriptional 조절에 관여하는지를 설명하고 있다.

다양한 tumor suppressor 유전자들은 promoter의 CpG island 부분이 hypermethylation되면서 전사과정에서 silence 되는 현상을 보이며, 이러한 aberrant CpG island methyl- ation에는 DNMT1과 DNMT3b가 관여하고 있음이 다양 한 암세포를 대상으로 많은 연구에서 보고되었다(Fig. 1).

대표적인 hypermethylated 유전자로는 hMLH (human mutL homology) 1, IGF (insulin like growth factor)-2, BRCA (breast cancer gene), E-cadherin, DAPK (death-associated protein kinase), p14, p15, p16, p53, p73, LKB1/STK11, APC (adenomatous polyposis of the colon) 등이 있고, 보고되는 수가 점점 증가 하고 있는 추세이다.

HAT의 경우, monocytic leukemia zinc finger protein (MOZ)- CBP fusion 단백질을 형성함으로써 aberrant chromatin Table 1. DNA methyltransferases와 histone deacetylases의 상호작용

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DNA methyltransferase Binding protein Function

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DNMT1 DNMT3a/b de novo DNA methyltransferase

HDAC 1/2 Histone deacetylase

MBD2/3 Methyl DNA binding

DMAP1 Co-repressor

PCNA DNA replication factor

MeCP2 Methyl CpG binding

HP 1β Heterochromatin protein

Rb Tumor suppressor

RNA pol Transcription/ RNA processing

DNMT3a HDAC1 Histone deacetylase

DNMT1 Maintenance DNA methyltransferase

RP58 Co-repressor

HP 1β Heterochromatin protein

DNMT3b HDAC1 Histone deacetylase

DNMT1 Maintenance DNA methyltransferase

SUMO-1/Ubc9 Sumoylation

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acetylation을 유발하여 leukemogenesis를 유도한다. 또한, MOZ-TIF (transcription initiation factor) 2-induced AML (acute myeloid leukemia)의 경우는 aberrant histone acetylation과 밀 접한 관련이 있는 것으로 보고되었고, EP300 acetylase의 truncated mutation 또한 직장암이나 유방암을 포함한 다 양한 암에서 관찰되었다. 반면, HDAC은 RAR-α와의 fu- sion을 통해 corepressor complex를 형성하거나 비슷한 방 식으로 AML-ETO fusion 단백질과의 결합을 통해 AML에 서 transcriptional repression을 유발한다. 결국, HDAC의 비 정상적 관여는 특정 leukemia에서 transcriptional repression 을 유도하게 되는 것이다.

임상시험 단계의 다양한 치료제

여러 기초 및 임상연구를 토대로 epigenetic 기작에 관 여하는 다양한 요소를 작용점으로 하는 small molecule의 inhibitor 개발이 진행되고 있고, HDAC inhibitor로는 잘 알려진 TSA (trichostatin A)뿐만 아니라 임상 I단계와 II단 계에서 단독 혹은 다른 약제와의 복합제로서의 평가가 진행되고 있는 depsipeptide FR-901228, benzamide MS-275, N-acetylamide CI-994, hydroxamic acid base HDAC inhibitor 인 SAHA (suberoylanide hydroxamic acid), LAQ-824 그리고 short chain 지방산, phenylacetate, phenylbutyrate, valproic acid들이 있고, 임상 III단계에서는 carboplatin/paclitaxel와 N-acetylamide CI-994의 복합효과를 NSCLC (non-small cell lung cancer)환자에서 시험하고 있는 중이다. HDAC inhi- bitor는 cardiac hypertrophy, heart failure, Huntington’s dis- ease, 유방암의 예방 및 치료에도 잠재적 가치를 가지는 것으로 보고되고 있다.

대표적인 DNA methyltransferase의 inhibitor로는 현재 nucleoside deoxycytidine 유도체 4가지가 있다. 이중 5-aza- cytidine과 5-aza-2’-deoxycytidine (decitabine) 2가지는 leuke- mia 환자에 있어서 증세완화의 작용이 증명된 바 있고, 비록 독성(toxicity)이 있기는 하지만 임상 II단계에서 acute leukemia 환자를 대상으로 그 신뢰성이 평가되고 있 는 중이다. Antisense oligonucleotide MG98은 DNMT1에 특 이성을 가지는 것으로 임상 I단계에서 그 평가가 진행되

Fig. 2. DNA demethylating agent 와 histone deacetylase inhibitor 같은 epigenetic inactivation을 작 용점으로 하는 drug들은 제어되었 던 유전자의 발현을 회복시키는 역할을 한다(Esteller, 2003).

Fig. 1. DNA metylation과 histone modification (acetylation/dea- cetylation)에 관여하는 각 구성요소들에서 발생하는 다양한 변화 는 chromatin 구조에 있어서 active와 silent 형태 간의 불균형으로 인한 전이를 가져온다(Jaenisch and Bird, 2003).

고 있다. 또한, methyltransferasae cofactor에 대한 화합물로 서 Sinefungin, S-adenosylhomocysteine등이 연구되고 있다.

다수의 결과들이 암 환자나 암 세포에 hypomethylating agent와 HDAC inhibitor를 복합해서 처리하면 silenced 유 전자의 재발현이 유도될 뿐만 아니라 세포의 분열이 촉 진된다고 보고하고 있다. Epigenetic 변화를 작용점으로 하게 되면, 암 치료 이외에도 다른 다양한 질병으로도 그 영역을 확대할 수 있을 것이다. 이를테면, X-linked MECP (methyl-CpG-binding protein) 2의 돌연변이와 H3의 hyperacetylation에 의해 야기되는 Rett Syndrome의 경우 정 확한 epigenetic 균형을 회복시키는 것을 치료의 목표로 삼을 수 있을 것이다(Fig. 2).

진단 표지자

진단 표지자(biomarker)를 확인하고 이들의 기능 및 활 성을 측정하는 것은 drug이 얼마나 효율적으로 그 작용 점에 도달했는지를 말해 주며, 체계적인 biomarker의 평 가는 drug에 대한 반응성, 적정 dose와 독성에 대한 정보 를 제공하여 보다 향상된 치료를 위한 토대로 이용될 수 있다.

각 유전자의 methylation 정도와 genome의 다양한 위치 에서의 methylation status를 말하는 methylation profile이 암 발생의 진단 표지자로 사용되고 있다. CpG hypermethyla- tion은 tumor, serum, plasma, urine, saliva, sputum 등에서 유 래된 소량의 DNA를 사용해서 쉽게 측정할 수 있는 매우 유용한 molecular biomarker이다. CpG island의 methylation pattern을 토대로 새로운 colon tumor의 소분류가 제안되 기도 하였고, hMLH1, IGF-2, BRCA, E-cadherin, DAPK, p14, p15, p16, p53, p73, LKB1/STK11, APC와 같은 methylated marker들의 임상적 유용성도 여러 연구에서 언급되었다.

HDAC inhibitor의 효율성을 확인하기 위해서는 H3과 H4의 acetylation 정도가 주요한 biomarker로 사용되고 있 다. HDAC inhibitor에 의한 histone acetylation의 증가는 p21, cyclin A, cyclin E, Bcl (B cell chronic lymphoblastic leuke- mia/lymphoma)-2/Bcl-x, c-Jun/AP1, caspase-3, CD (cluster of differentiation) 95, NF-κB와 같이 cell cycle 조절, apoo- ptosis, angiogenesis, differentiation에 관여하는 다양한 bio- marker와 관련되어 있다.

현재, HDAC inhibitor와 hypomethylating agent의 복합적 사용에 대한 유전자 발현 조절과 epigenetic 변화를 평가 하는 새로운 시도들이 급속히 진행되고 있다.

맺 음 말

DNA methylation과 histone modification 특히, histone acetylation은 chromatin structure의 변형, gene transcription, genomic imprinting, X chromosome inactivation 등 다양한 분 자기작에 관여한다. 따라서 methylation과 histone acetyla- tion의 조절을 작용점으로 하는 drug의 개발은 종양학분 야는 물론 다양한 분야로 치료의 적용성을 확대할 수 가 능성을 제시하고 있다. Drug의 특이성을 향상시키고 적 절한 복합적 약제의 사용은 drug의 efficacy를 보다 더 향 상시키면서 toxicity는 감소시키는 효과를 가져 올 수 있 을 것이다. Epigenetic controller에 관한 보다 심도 있는 연 구와 기술의 개발은 명확한 표지자(biomarker)의 발굴과 더불어 epigenetic 균형과 유전자 발현을 회복시킬 수 있 는 drug의 개발을 가능하게 할 것이다.

참 고 문 헌

1) Robert MF, Morin S, Beaulieu N. DNMT1 is required to maintain CpG methylation and aberrant gene silencing in human cancer cells. Nat Genet 33, 61-65, 2003.

2) Robertson KD, Ait-Si-Ali S, Yokochi T, Wade PA, Jones PL, Wolffe AP. DNMT1forms a complex with RB, E2F and HDAC1 and represses transcription from E2F responsive promoters. Nat Genet 25, 338-342, 2000.

3) Pradhan S, Kim GD. The retinoblastoma gene product interacts with maintenance human DNA (cytosine-5) methylt- ransferase and modulates its activity. EMBO J 21, 779-788, 2002.

4) Kim GD, Ni J, Kelesoglu N, Roberts RJ, Pradhan S. Co- operation and communication between the human main- tenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases.

EMBO J 21, 4183-4195, 2002.

5) Okano M, Xie S, Li E. DNMT2 is not required for de novo and maintenance methylation of viral DNA in embryonic stem cells. Nucleic Acids Res 26, 2536-2540, 1998.

6) Cai S, Han HJ, Kohwi-Shigematsu T. Tissue-specific nuclear architecture and gene expression regulated by SATB1. Nat

Genet 34, 42-51, 2003.

7) Roth SY, Denu JM, Allis CD. Histone acetyltransferases. Annu

Rev Biochem 70, 81-120, 2001.

8) Wang C, Fu M, Angeletti RH. Direct acetylation of the estrogen receptor a hinge region by p300 regulates transa- ctivation and hormone sensitivity. J Biol Chem 276, 18375- 18383, 2001.

9) Lagger G, O’Carroll D, Rembold M, Khier H, Tischer J, Weitzer G, Schuettengruber B, Hauser C, Brunmeir R, Jenuwein T, Seiser C. Essential function of histone deacetylase

1 in proliferation control and CDK inhibitor repression.

EMBO J 21, 2672-2681, 2002.

10) Patel A, Groopman JD, Umar A. DNA methylation as a cancer-specific biomarker: from molecules to populations. Ann

NY Acad Sci 983, 286-297, 2003.

11) Gayther SA, Batley SJ, Linger L, Bannister A, Thorpe K, Chin SF, Daigo Y, Russell P, Wilson A, Sowter HM, Delhanty JD, Ponder BA, Kouzarides T, Caldas C. Mutations truncateing the EP300 acetylase in human cancers. Nat Genet 24, 300- 303, 2000.

12) Chambers AE, Banerjee S, Chaplin T. Histone acetylation- mediated regulation of genes in leukemic cells. Eur J Cancer 39, 1165-1175, 2003.

13) Wang J, Hoshino T, Redner RL, Kajigaya S, Liu JM. ETO, fusion partner in acute myeloid leukemia, represses transcrip- tion by interaction with the human N-CoR/mSin3/HDAC1 complex. Proc Natl Acad Sci USA 95, 10860-10865, 1998.

14) Brown R, Strathdee G. Epigenomics and epigenetic therapy of cancer. Trend Mol Med 8, S43-S48, 2002.

15) Turner ML, Altemus R, Bates SE. Inhibitor of histone deacetylation, depsipeptide (FR901228), in the treatment of peripheral and cutaneous T-cell lymphoma: a case report.

Blood 98, 2865-2868, 2001.

16) Goffin J, Eisenhauer E. DNA methyltransferase inhibitors-state of the art. Ann Oncol 13, 1699-1716, 2002.

17) Amir RE, Zoghbi HY. Rett syndrome: methyl-CpG-binding protein2 mutations and phenotype-genotype correlations. Am

J Med Gent 97, 147-152, 2000.

18) Laird PW. The power and the promise of DNA methylation markers. Nat Rev Cancer 3, 253-266, 2003.

19) Toyota M, Ahuja N, Ohe-Toyota M, Herman JG, Baylin SB, Issa JP. CpG island methylator phenotype in colorectal cancer.

Proc Natl Acad Sci USA 96, 8681-8686, 1999.

20) Chen LF, Greene WC. Reglation of distinct biological activities of the NF-κB transcription factor complex by acetylation. J

Mol Med 81, 549-557, 2003.

21) Shi H, Wei SH, Leu YW, Rahmatpanah F, Liu JC, Yan PS, Nephew KP, Huang TH. Triple analysis of the cancer epi- genome: an integrated microarray system for assessing gene expression, DNA methylation, and histone acetylation. Cancer

Res 63, 2164-2171, 2003.

22) Kaneda A, Takai D, Kaminishi M, Okochi E, Ushijima T.

Methylation-sensitive representational difference analysis and its application to cancer research. Ann NY Acad Sci 983, 131-141, 2003

23) Esteller M. Relevance of DNA methylation in the management of cancer. Lancet Oncol 4, 351-358, 2003.

24) Jaenisch R, Bird A. Epigenetic regulation of gene expression:

how the genome integrates intrinsic and environmental sig- nals. Nat Genet 33, 245-254, 2003.