핵산과DNA의구조및복제 Chapter 4

핵산과 DNA의 구조 및 복제

생명과학의 기초 생화학

Chapter 4

4장의 개요

4.1 핵산 및 구성성분의 화학구조 4.2 DNA와 RNA의 입체구조

4.3 DNA의 복제, 수선 및 재조합

4.1 핵산 및 구성성분의 화학구조

소개

- 핵산의 발견: 100년 전 미셀(Michelle) - 유전정보: 보존 및 전달체

- 기본단위: 모노뉴클레오타이드

- 라이보핵산(RNA)  D-라이보퓨라노스 - 데옥시라이보핵산(DNA)

- 질소 포함  염기  퓨린과 피리미딘

그림 4-1.

DNA와 RNA의 구조.

퓨린과 피리미딘 염기의 구조

- 아덴닌과 구아닌

- t-RNA에 변형된 퓨린:

하이포잔틴, 메틸하이포잔틴,

N

N

Δ

트레오닌 카바모일-아데닌 퓨린의 구조

- DNA  타이민 - RNA  유라실

- 케토형  pH에 따라 에놀형,

생리적인 pH에 따라 락탐형 - 정제된 DNA:

흉선, 맥아, 식물  5-메틸사이토신

- T-짝수 파아지: 5-하이드록시메틸사이토신 - tRNA: 다이하이드로유라실, 유사유리딘,

4-타이오유라실

피리미딘의 구조

피리미딘의 구조

뉴클레오사이드의 구조 - 퓨린과 피리미딘:

D-라이보스 또는 2-데옥시-D-라이보스의

N

β

- 핵산중합체 일차구조의 구성성분

뉴클레오타이드의 구조

- 뉴클레오타이드(nucleotide): 뉴클레오사이드의 인산에스터

- 중요한 뉴클레오타이드:

아데노신 -5’-일인산(AMP), ADP, ATP, 고리형인산

글루코스의 공여체: UDPG

DNA 및 RNA

- 진핵세포의 DNA의 98% 이상이 핵안에 압축

 히스톤  염색질(chromatin)

 마이토콘드리아, 엽록소

- RNA · 전달RNA(tRNA), 분자량 25,000

 아미노산의 전달, 세포의 10~15%

· 라이보솜RNA  세포의 75~80%,

· 전령 RNA(mRNA)  세포의 5~10%

핵산의 화학

1. 핵산의 분리 및 정제

- 세포분쇄물  계면활성제와 페놀의 추출 - 핵산은 수용액  에탄올 침전

- 라이보핵산가수분해효소처리(DNA분리) - 데옥시라이보핵산가수분해효소처리

(RNA분리)

- 액성 페놀  단백질 변성

- 순수한 DNA  다시 에탄올 침전 - 아세톤 건조  유리봉으로 휘감음

- 하이드록시아파타이트 칼럼크래마토그래피

2. 핵산의 광학적인 성질

- 퓨린, 피리미딘 염기들은 파장 260nm의 자외선 흡수  핵산의 정량 측정

- 높은 분자량을 갖는 DNA

 개개의 흡수총화보다 35~40% 적은 광학밀도

 하이포크롬 영향(hypochromiac effect)

 염기내부 π-전자들 사이의 상호작용으로 흡수의 감소

그림 4-2.

같은 농도의 DNA-Na염과 소의 혈청 알부민(BSA)의 자외선 흡수 스펙트럼들.

나선의 풀리는 온도(

T

 이중나선은 풀리게 됨  흡수 증가

- 나선의 풀리는 온도(melting temperature) 

T

그림 4.3.

송아지 흉선 dna의 열분해곡선

그림 4.4.

왓슨-크릭의 염기쌍들의 수소결합.

그림 4.5. 핵산에서 G-C 쌍의 양에 따른 여러 DNA의

T

핵산의 이중구조

- G-C염기쌍은 A-T염기쌍보다 DNA의 안정성에 더욱 기여

- 이중가닥의 RNA: 일부 바이러스의 유전물질로 기능 - 대부분이 단일가닥

- DNA 풀리기  pH를 극단으로 했을 때도 일어남

· 낮은pH(4이하)  아데닌, 구아닌, 사이토신의 아미노그룹의 수소결합붕괴

· pH11 이상  구아닌, 사이토신, 타이민,

하이드록실그룹의 프로톤은 수소결합의 붕괴와 해리

3. 핵산에서 몰비율의 결정

- 약한 알칼리  RNA 가수분해

 2’-알콕사이드이온의 인원자에 친핵성 공격 - 에스터결합 붕괴  확인 정량적

- 알칼리성 조건에서 DNA는 가수분해되지 않음 - 산성처리:

N

 탈퓨린지역(apurinic site)

그림 4-6. 췌장의 DNA가수분해효소와 뱀독의 인산다이에스터레이스의 혼합물에 의한 DNA의 효소적인 가수분해지역.

그림 4-7.

RNA의 효소가수분해지역.

4.2 DNA와 RNA의 입체구조

DNA의 이차구조

- 샤갑(Chargaff): A/T = G/C = 1 - 윌킨스: DNA의 X-선 회절

 모든 유기체에서 같은 data  DNA사슬

 나선구조예측

- 왓슨과 크릭이 DNA구조의 모델 구축

왓슨과 크릭의 DNA구조의 모델 - 두 개의 폴리뉴클레오타이드 사슬

 이중나선으로 오른쪽으로 감아 돌아감 - 염기는 중심축을 향함

 타이민은 평행인 사슬에서 아데닌을 향함 - 두 사슬이 공통축을 중심으로 꼬여진 공간구조 - 사슬들이 서로 상보적  두 사슬이 서로 역방향 - 유전정보  복제메커니즘 설명

그림 4-8.

DNA의 두 가닥의 진행방향.

1. 이중가닥의 선형: 많은 바이러스나

진핵세포의 염색체 DNA 2. 이중가닥 고리형(마이토콘드리아, 엽록체) 3. 폐쇄된 고리형

4. 이중가닥 선형

5. 단일가닥: 담배모자익바이러스,

인플루엔자 및 몇몇 박테리아의 바이러스 6. 레트로바이러스: 이중가닥 RNA

DNA의 입체모양 및 변화

그림 4-9.

여러 종류 DNA의 가능한 이차구조.

- 히스톤: 염색체의 안정화

진핵세포의 유전체

- 유전체(genome)  몇 개의 염색체로 포장

 단백질 + DNA  크로마틴(염색질)

 핵산내부가수분해효소 처리

 뉴클레오솜(100Å  200bp) - 뉴클레오솜: 166개 염기

 8개체의 히스톤을 거의 두 번 감고 돔

- 원핵세포: Mg⁺⁺, 카데버린, 퓨트레신, 스퍼민

그림 4-10.

뉴클레오솜의 구조.

DNA의 삼차구조 및 초코일화

- B-DNA는 두 개의 반대로 평행한

폴리뉴클레오타이드의 가닥이 공통축을 중심으로 오른쪽으로 감고 돔

- 염기들 나선축의 수직으로 놓여 있게 됨 - 큰 홈과 작은 홈

- 한번 회전에 10개 염기상, 36^o 기울임

그림 4-11.

B-DNA의 구조.

A-DNA의 삼차구조

- 탈수가 되는 조건에서 B-DNA  A-DNA로 가역적인 입체모양의 변화를 일으킴

- A-DNA는 한번 회전에 11.6염기쌍 관여, 축의 구멍을 만드는 높이 34Å

- 더욱 깊은 큰 홈, 대단히 움푹 패인 작은 홈

그림 4-12. B-DNA와 A-DNA의 구조.

Z-DNA의 삼차구조

- 왼쪽으로 회전, 한 번에 12개의 염기쌍 - 드릴 모양

- d(CG CG CG)

- 기능: 어떤 조건에서 B-DNA가 Z-DNA로

전환됨으로써 유전자 표현의 조절과정에서 스위치 기능을 할 것

그림 4-13. Z-DNA의 구조.

DNA의 초코일화

- 고리형DNA분자(바이러스, 염색체)

 초코일화

- 코일의 수는 한 가닥을 절단해야 변경

그림 4-14.

음 및 양의 초코일화.

초코일화의 위상수학(topology) - 연결수, L:

한 가닥이 다른 가닥을 감고 돌아가는 횟수 - 가닥꼬임수, T: 이중가닥의 축을 따라 도는 수 - 몸체꼬임수, W:

이중축이 초나선의 축을 도는 회전수

L(연결수) = T(가닥꼬임수) + W(몸체꼬임수)

그림 4-15.

가닥꼬임수(T), 몸체꼬임수(W)와 연결수(L)의 관계.

토포아이소머레이스(topoisomerase)

- 고리형의 DNA의 연결수(L)를 변형시켜 초코일화된 DNA의 스트레스를 이완시키는 기능

- 토포아이소머레이스 I:

DNA의 일시적인 단일가닥의 절단을 수행

- IA형: 음으로 초코일화된 DNA의 단일가닥의 절단

 얻어지는 틈새를 통하여 단일가닥 통과시킨 다음 L을 한 개 줄여 DNA의 이완

- IB: 조절된 회전으로 음과 양의 초코일 둘 다 이완 - II형: DNA 두 가닥을 절단하는 반응회로

 음 또는 양의 초코일 이완

- 원핵세포 DNA자일레이스(zyrase)

 음의 초코일화 도입

그림 4-16. 토포아이솜머레이스 II의 메커니즘.

토포아이솜머레이스의 방해제

전달RNA

- 단백질 합성과정에서 아미노산의 전달 - 사슬길이, 75~88 nb

- tRNA메틸화효소

- 같은 아미노산에 여러 개의 코돈

 중복성(multiplicity)

- 한 아미노산에 한 개 이상의 코돈

 유전자 코드의 퇴화(degeneracy) - 구조의 특징:

안티코돈지역, 아미노산 부착지역, 3’말단 CCA지역, 라이보솜인식지역

그림 4-17.

tRNA분자의 일반적인 구조

전령RNA

- 번역과정의 유전정보 보유

- 원핵생물의 mRNA는 높은 전환율을 가짐 - 대장균 mRNA 폴리시스트론성

- HnRNA  진핵세포의 전구체 - 진핵세포

 한 개의 폴리펩타이드만 코드

그림 4-18. 원핵생물의 mRNA.

- 자메닉(Zamecnik):

방사선으로 표지된 아미노산 쥐에 투여

 쥐 간에서 분리  마이크로솜의 분획에서 가장 높은 방사성 활성띰

- 세포에서 가장 큰 기능을 수행하는 분자인 라이보핵산단백질 입자

- 하나의 라이보솜이 붙어 있는 모노솜(monosome) 또는 mRNA에 연결된 여러 개의 라이보솜을 갖는 폴리솜(polysome)

- 진핵세포  핵소체에서 합성 라이보솜RNA

4.3 DNA의 복제, 수선 및 재조합

유전정보의 흐름

- 기본정설(central dogma)

- 복제(replication):

DNA 정보가 상보적인 새로운 뉴클레오타이드의 염기쌍으로 복사되는 과정

- 전사(transcription):

DNA의 유전정보가 하나의 RNA사슬로 복사되는 과정 - 번역(translation): mRNA로 전사된 유전정보가

아미노산들을 질서정연하게 중합시키는 복잡한 과정

- 정확한 정보를 마련해 주는 DNA

 주형(template) DNA

- 출발점으로서 작용하는 짧은 폴리뉴클레오타이드 사슬

 프라이머(primer)

- RNA중합효소: 프라이머 필요없음

- DNA중합효소, 역전사효소  프라이머 필요

그림 4-19. 복제의 시작, 프라이머의 합성.

DNA의 복제

- 복제의 형식:

어버이가닥의 순서  얻어진 상보적인 DNA가닥

 반보존적(semi-conservative)

그림 4-20. 복제의 방법.

- 메셀슨(Meselson)과 스탈(Stahl) 실험:

대장균 배양액 ¹⁵NH₄Cl  여러 세대 배양

 ¹⁴NH₄Cl 첨가  짧은 간격으로 세포 제거

 DNA추출, 원심분리(평형밀도 기울기)

그림 4-21. 메셀슨-스탈의 실험.

1. 복제의 개시

- 복제의 눈: 세타(Θ) 구조

- 복제의 눈에서 갈라진 부분:

복제분기점(replication fork) - 복제는 양방향(bidirectional)

- 대장균의 경우 oriC라고 부르는 245bp지역에서 복제 시작

그림 4-22.

대장균의 θ복제의 구조 및 양방향성.

DNA복제 메커니즘

- 이중가닥의 풀림: A-T염기쌍이 풍부한 지역 - 복제의 시작점 oriC에 DnaA이 부착

- DnaB 두 개의 육합체는 가닥이 풀린 지역의 끝의 각각에 보충(대장균의 DnaB, 헬리케이스

 푸는 기능) - 단일가닥부착단백질(SSB):

분리된 가닥이 재결합되지 않도록 잡아주는 기능 - 녹는과정:

ATP의 가수분해에 의한 자유에너지 필요 - 토포아이소머레이스II(자일레이스):

음으로 초코일화된 고리형 염색체를 품

RNA프라이머의 확인

- 리펨피신(rifampicin)  RNA중합효소방해제 - 실험관이나 생체내부에서 복제과정 방해

- RNA중합효소의 돌연변이체  방해 안 됨

- RNA중합효소  DNA주형으로 짧은 RNA합성 - DNA가닥에 붙어 50~100잔기 RNA

복제분기점에서 복제의 시작

- 선도가닥(leading strand), 지연가닥(lagging)

 모두 프라이머의 합성 필요 - 대장균에서 프라이머 합성체계

 프라이모솜(primosome)

 DnaB(헬리케이스), DnaG(프라이메이스) - 대장균에서 두 개의 pol III(레플리솜)

- 진핵세포 3~300kb마다 한 개의 복제 시작점

- 레플리콘: 복제의 시작점(근처의 20~80개의 묶음이 동시에 활성화)

그림 4-23. 복제분기점에서 복제의 시작.

2. 복제의 연장

- 복제의 연장  DNA중합효소 III의 존재하에 일어남 - 가닥을 푸는 단백질, DnaA 필수

- 말단 3’-OH에 친핵성 공격

- 중합보조효소III  12개의 잔기 복제 - DNA중합효소 III 완전효소의

β소단위체 500~1000bp 연장

 움직일 수 있는 고정나사(clamp)

 효소가 고정됨 중합효소의 진행을 증진 - 대장균의 DNA ~1000nt/s의 속도로 복제

- Pol III의 γ복합체  DNA주형 이중 β-고정나사(clamp)

 가닥을 푸는 장치  고정나사배치자

- γ복합체  DnaB, 헬리케이스에 부착된 두 개의 τ소단위체 - 진핵세포의 RNA프라이머 제거:

RNaseH1, 플랩핵산내부가수분해효소-I(FEN1)

그림 4-24. 오가자끼조각에서의 DNA의 복제.

3. 복제의 종결

- 대장균:

· oriC에서 시작, 시계반대방향

 TerG, F, B, C를 거쳐 TerA, D, E에서 정지

· 시계방향

 TerE, D, A를 지나 TerC, B, F, G에서 정지 - Tus단백질: Ter지역에 부착,

DnaB(헬리케이스)가닥의 이전을 방해

 시작점의 움직임 방해

그림 4-25.

대장균의 염색체지도상에서 복제의 종결점.

DNA접합효소(ligase) - 대장균  NAD⁺

 5’아데닐산 + 니코틴아마이드모노뉴클레오타이드 - 동물세포: ATP를 필요

- T4 DNA접합효소:

이중가닥이 수직으로 잘린 DNA(blunt end)를 연결

그림 4-26.

대장균 DNA접합효소의 반응 메커니즘.

진핵세포의 DNA종결(terminanation) - RNA프라이머  주형 3’말단까지 쌍을 이룸

 지연가닥 5’말단까지 합성 못함 - 복제 될 때마다, 프라이머 있던 부분이 잘림

- 진핵세포의 염색체말단  텔로미어

 텔로머레이스(합성유지)

- 텔로미어의 DNA는 각 염색체 끝 3’말단가닥에 1000개나 그 이상의 짧은 G-가 풍부한 직렬로 되풀이되는 순서를 가짐

진핵세포의 DNA종결(terminanation)

- 사람의 경우 TTAGGG  텔로머레이스(라이보핵 단백질)는 역전사효소활성의 활성을 갖음

- 반복해서 DNA가닥의 새로운 3’말단으로 이전, DNA에 다중의 텔로미어의 순서 첨가

- 노쇠현상: 텔로머레이스가 약화

 염색체의 끝부분이 잘려짐 - 암세포는 높은 활성의 텔로머레이스

 조절이 불가능한 지속적인 복제

- 세포는 20~60회의 제한된 증식(배양세포가 제한된 증식)  텔로머레이스  항암제의 우수한 목표물질

DNA중합효소

- 네 개의 데옥시라이보뉴클레오타이드들이 부착되는 한 개의 부착지역

- 주형 DNA의 부착지역 - 프라이머의 부착지역

- 말단 뉴클레오타이드 3’OH그룹의 부착지역 - 3’-5’, 5’-3’-핵산말단가수분해효소

- 클레노우(Klenow)조각: 중합효소의 공통구조

그림 4-27.

대장균 DNA중합효소 I의 클레노우조각의 삼차구조.

클레노우조각부위 - 두 개의 Mg²⁺  활성부위

- 한 개의 Mg²⁺

 dNTP와 프라이머의 –OH을 활성화

 dNTP의 α-인산그룹의 공격 - 다른 금속: 3’-OH에만 작용

그림 4-28.

DNA중합효소의 반응 메커니즘.

고등생물의 DNA중합효소

- DNA중합효소 α : 세포질 또는 핵에서 발견된 주된 중합반응

- DNA중합효소 β : 주로 핵에서 발견되는 효소

- DNA중합효소 γ : 세포질과 핵에 모두 들어있는 효소 - 마이토콘드리아의 DNA중합효소

- 바이러스에 감염에 의해서 유도된 중합효소 - RNA종양바이러스  RNA  DNA 역전사

유전자의 돌연변이와 수선

- 점 돌연변이(point mutation):

· 피리미딘이 다른 피리미딘으로 등 같은 염기 사이의 치환  전이(transition)

· 퓨린이 피리미딘으로 치환  전위(transversion)

- 한 개 또는 두 개 이상의 염기쌍의 삽입 또는 결손이 발생하는 돌연변이 가능

1. 물리적 또는 화학적인 돌연변이 유발(생성)

- 물리적, 화학적인 돌연변이

 DNA염기의 손실, 부가, 변형

 해독구조(reading frame)의 코돈의 이동 (1)아질산(HNO₂): 염기의 탈아미노화,

아데닌 하이포잔틴, 사이토신 유라실, 구아닌 잔틴

(2)하이드록실아민:

사이토신과 분리된 체계(in vitro)에서 특수하게 반응

(3)알킬화 시약: 다이메틸설페이트(DMS), 에틸메테인설포네이트(EMS)

염기의 메틸화  데옥시라이보사이드

 사차질소형성  데옥시라이보스의 배출

 염기의 교체  DNA사슬의 손상

(4)메틸화 시약:

N

N

N

그림 4-29. 두 타이민 염기의 이합체의 구조.

2. 수선의 메커니즘

- 절단수선(excision-repair)

 타이민이합체의 제거

- 색소성 건피증(xeroderma- pigmentosum) - 자외선에 민감한 유전병

 절단에 필요한 핵산내부가수분해효소의 결핍

그림 4-30.

절단수선 메커니즘.

유전자재조합

1. 유전자재조합

- 유전자 운반체(vector)

 DNA의 정제 및 절단에 의한 열기 - 연구대상 유전자의 획득

- 원하는 크기로 절단 및 운반체에 삽입(Cloning) - 클론된 유전자의 숙주에 삽입(transformation)

 원하는 DNA가 포함된 세포의 확인

그림 4-31.

유전자재조합방법.

2. 재조합운반체 및 재조합된 클론의 선별방법

- 비염색체 DNA, 플라스미드

- 레플리콘(replicon)을 갖는 독자적인 유전체

 대장균

- 숙주세포에 진입가능

- 쉽게 선별가능  병원의 증상(phetogenic trait)

유전자운반체 pBR322 - Ap^R유전자 RSF2124

- Tc^R유전자 pSC101 - 플라스미드 Col E1 - pMB1 복제인자

- 4363 염기쌍

- Tc^R 여섯 개의 제한효소

- Ap^R유전자에 세 개의 제한효소 - Ap^R 유전자삽입

 테트라사이클린에 살아남고 Ap^R에 살아남지 못하는 형질전환딘 대장균의 칼러니를 선별

그림 4-32.

유전자운반체 대장균 플라스미드 pBR322.

pUC18 플라스미드

- β-갈락토시데이스 유전자  lacZ - 효소의 기질 X-gal 절단  푸른색 - 효소유전자 절단  무색

그림 4-33.

pUC18 플라스미드.

3. 제한효소

- 제한된 절단부위

 큰 크기의 유전자로 절단

- 절단면  접착성(cohesive, sticky)

그림 4-34. 접착성 말단에 의한 DNA의 연결.

4. 유전자의 획득(DNA libraries)

- mRNA로부터:

· 다량 생산하는 조직(인슐린, 렝거헨섬 세포)

· mRNA 분리(polydT 칼럼)

· 세포외 전사기구(밀 배아)

· 해당단백질 확인  mRNA  cDNA - 유전체의 문고

· 제한효소사용: 염색체 DNA절단  분류

· 숙주세포에서 단백질의 확인

그림 4-35. 대장균에서 사람의 인슐린 제조.

5. 트랜스포메이션(형질전환)

- 1970년 하이가(Higa)가 대장균에 CaCl₂ 처리

 박테리아파지 λ DNA의 내부진입 - 코헨(Cohan) CaCl₂ 처리한 대장균

 플라스미드 DNA 내부진입

- RecB^- 선형박테리아 DNA의 진입 - RecB⁺  10%의 효율로 진입

- 적정전환효율



μg

6. 포유류에서 유전자의 재조합

- 유전자 기능의 이해,

유전적 질병의 치료방법의 개발

- 태아줄기세포  상동재조합  특정유전자

 양쪽 말단에 상보적인 유전자

- 대리모자궁에 착상  유전자 도입난자

그림 4-36.

상동재조합에 의한 고등생물에 변형된 유전자의 도입.

녹아웃쥐(knock-out mouse) - 특정유전자 손상  유전자 손실 쥐

- 쥐의 유전자는 사람의 유전자와 같은 26,383개 - 현재 10,000개의 유전자 기능 상실

- 당뇨병, 심장질환, 암, 노화의 원인, 희귀한 유전병 치료

그림 4-37. 녹아웃쥐의 생산.

재조합 관련기술

1. 아가로스 젤 전기영동법

- 1%의 아가로스 사용

- DNA의 절단 및 접합 확인 방법 - 수 백개 염기 ~ 20,000개

- 이티듐브로마이드(ethidium bromide) 0.05

μ

그림 4-38.

DNA의 아가로스 젤 전기영동.

2. 서던 및 노던흡입법

- DNA염기 순서에서 10 ~ 20개 방사선 표지

 탐침(probe)

- 서던흡입법:확인하려는 DNA분리(젤전기영동)

 알칼리처리  단일가닥

- 나이트로셀룰로스 여과지로 이동 - DNA는 80^oC로 구워 고정

- 탐침이든 용액에 넣게 되면 DNA와 혼성화 - 노던흡입법: RNA 확인

 아미노벤질옥시메테인 여과지

 DNA탐침

그림 4-39.

서던흡입법에 의한 DNA의 제한효소 절단조각의 확인.

3. PCR 방법

- 증폭시키려는 연구대상의 DNA정제 - 짧게 가열하여 이중가닥을 분리

- 서로 반대방향의 탐침

- 담금질  dNTP + 과량 탐침

- 가열  냉각  복제: 25~30번 되풀이 - Tag DNA중합효소를 사용

그림 4-40.

반복된 중합효소 사슬반응(PCR).

4. DNA서열분석

- 다이데옥시방법(dideoxy method):

1975년 생거(Federick Sanger)

- 이중가닥 DNA  단일가닥 DNA(주형)

- 합성된 방사성 표지, 프라이머 + DNA pol I - 2’,3’-ddNTP 사용(3’-OH없음, 합성 정지) - 적은 양의 ddATP

 dC가 나타난 곳에 미성숙된 종결

그림 4-41.

생거-쿨손 방법에 의한 DNA의 연기순서분석.