Chapter 4

Chapter 4

Deoxyribonucleic Acid Structure

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4.1 DNA의 크기의 다양성

DNA는 옆의 표에서 보는 것처럼 크기와 염기 구성이 다양하다. 원핵 세포에서 DNA는 하나의 단일

분자이며 진핵 세포에서는 여러 개의 염색체에 나뉘어 있다. 또한 histone이라는 단백질이 결합됨.

DNA의 염기 간의 길이는 0.34nm, DNA 분자의 폭은 2.0nm이다. 표에 있는 DNA 의 길이는 1.7μm에서 8.3cm임.

4.2 연약성

DNA는 일상적인 작용에 의하여 생기는 유체 역학적인 절단력에 의하여 쉽게 부서진다.

그럼으로 진핵세포의 DNA를 분리 할 때는 각별한 주의를 필요로 한다.

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4.3 DNA conformations (형태)

A-DNA B-DNA Z-DNA

선형 이중가닥 DNA는 A-DNA, B-DNA, Z-DNA 중의 하나로 존재한다.

A형과 B형의 차이점;

1) A는 나선 회전당 11bp, B는 10.2 – 10.5bp 2) A의 염기쌍의 평면은 나선축의 수직에서 20도 B형은 -6도 기울음

3) A는 구멍이 있으나 B는 없다.

4) A는 깊은 주홈과 얕은 부홈, B는 거의 비슷 B-DNA는 왓슨과 크릭의 DNA의 기본적인 모델 살아 있는 생명체는 거의 B 형임.

A형은 살아있는 생명체의 습한 환경에 간혹 존재하나 이중나선 RNA나 DNA-RNA 교잡 시 존재함

A-DNA, B-DNA 모두 우회전 나선이나 특별한 환경하에서는 좌회전 나선을 나타냄.

알렉산더 리치는 특정 서열을 합성하여 조사하던 중 새로운 형태의 Z-DNA를 발견함 5’ - CGCGCG – 3’

3’ - GCGCGC – 5’ ³

그림; 지그재그 당인산 골격을 갖는 Z-DNA와 Z-DNA에 항체가 결합하여 흰색을 나타냄 단 Z-DNA는 높은 염의 농도를 갖는 용액 속에서만 존재. 5’- CGCGCG – 3’ 서열이 있는 경우 2M 이상의 염화 나트륨 속에서는 Z-DNA로 존재하나 나머지 DNA는 B 형태로 존재.

세포내의 염의 농도는 2M이 되지 않기 때문에 생체 내에서는 거의 존재를 하지 않으나 특정한 환경의 세포 내에 존재할 것으로 간주됨.

형광 항체법을 이용하여 동물 DNA의 일부 지역이 Z 형태라는 것을 알 수 있음. 초파리의 침샘 염색체를 이용함. Z-DNA에 대한 토끼의 항체가 가해지고 형광 염소 항-토끼-면역글로 블린을 가한 후 형광현미경으로 관찰.

그러나 B-DNA가 가장 흔하게 세포내에 존재 하기 때문에 앞으로는 B-DNA에 관하여 배움

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The A-, B-, and Z-DNA forms have different characteristics

Adapted from Ussery, D. W. Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley & Sons, Ltd., May 2002. [doi: 10.1038/npg.els.0003122].

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Figure 4.4

좌;The C₂’-endo conformation 우;The C₃’-endo

conformation

좌; Deoxyguanylate in B- DNA in anti conformation

우; Deoxyguanylate in Z- DNA in syn conformation Polydeosyribonucleotide 사슬이 자연적인 회전이 가능하기 때문에 다른 DNA의 형태를 갖게됨. 당에서 4개의 원자는 거의 동일한 평면상에 존재하나 5번 탄소는 0.05nm 벗어남 C-2’ 혹은 C-3’도 이처럼 고리의 면에서 어긋날 수 있다. (좌)의 C₂’ -endo는 B-DNA,

(우)의 C₃’-endo 는 A-DNA이고 Z-DNA는 두 가지가 섞여 있다.

다음은 C₁’과 푸린 염기를 연결하는 N-글리코시드 결합의 변화가 중요함.

Pyrimidine deoxynucleotide는 syn의 형태에 있으면 당과 피리미딘 사이에 입체적 간섭이 있어 항상 anti로 존재. Purine deoxynecleotide는 A-, B-DNA에서는 anti(좌), Z-DNA에서는 syn(우)으로 존재함.

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염기 서열이 DNA의 구조에 영향을 미친다.

회문구조 (역의 반복)는 어느 쪽으로 읽으나 서열이 동일한 경우를 말하며 약 50bp까지 계속되기도 한다. 이들이 간격을 두고 분리된 경우 십자구조를 이루기도 한다.

5‘-CCGCCAGTTCCGCTGGCGG-5' 3'-GGCGGTCAAGGCGACCGCC-5'

역반복

십자구조

RNA등은 자체 내에서 동일 가닥 내에 수소 결합을 만들어 머리핀 (hair pin 혹은 stem-loop)구조를 만든다

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4.4 DNA denaturation (변성)

absorbances of 50 mg/ml solutions dsDNA A₂₆₀ = 1.0

ssDNA A₂₆₀ = 1.37 free bases A₂₆₀ = 1.60

자연 상태의 이중나선 구조가 열에 의하여 외가닥으로 변하는 현상을 변성 이라고 한다.

DNA 변성을 조사하는 간단한 방법은 파장이 260nm인 자외선을 흡수하는 능력을 조사 하는 것이다. 즉 더 질서가 잡힌 구조일수록 흡수되는 빛의 양이 적다.

이중 가닥 DNA를 저흡광성 (hypochromic), 자유 뉴클레오티드를 과흡광성 (hypercromic) 이라고함

0.15M 염화나트륨 용액에 있는 DNA를 서서히 가열 하면서 A₂₆₀을 측정

1) A₂₆₀은 살아있는 세포들이 만날수 있는 온도까지 일정하게 상승.

2) 6⁰C에서 8⁰C의 범위에서 A₂₆₀이 상승

3) 가장 높은 A₂₆₀ 값은 초기 값보다 37%가 높다.

용해온도 (Tm, melting temperature); A₂₆₀의 상승이 절반까지 이루어 졌을 때의 온도.

그러나 다시 실내온도까지 냉각이 된다면 A₂₆₀은 초기의 비변성 값까지 떨어진다. 이를 복원이라함

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수소결합은 이중 DNA 가닥을 안정화시킴

G+C의 양에 대하여 Tm이 어떻게 변하는가 조사 한 결과 G+C의 양에 비례하여 Tm이 증가함.

G+C에는 3개의 수소 결합이 있어 파괴시키는데 더 많은 에너지가 필요하기 때문임.

A+T는 2개의 수소결합을 갖음.

염기 중첩

중첩에는 정전기 상호 작용, 반데르 발스힘, 소수성 효과등이 작용하며 이는 DNA의 구조를 안정화 하는데 일조를 한다. 염기 중첩과 수소결합 모두 약한 비공유 결합으로 열에 의하여 파괴된다.

많은 염기 쌍을 갖고 있는 이중가닥 DNA 분자 보다는 적은 염기 쌍을 갖는 것의 Tm 값이 변화가 심하다.

선형 이중가닥 DNA의 끝은 염기 쌍이 풀어진 상태이나 어떤 것은 말단에서도 중첩이 되어있다.

15개 이하의 염기 쌍을 갖는 이중가닥은 특히 낮은 Tm 값을 갖는다.

쌍을 이루는 지역이 짧거나 그 옆의 지역은 생리적인 온도에서 존재하는 형태를 유지하지 못한다. ₉

Figure 4.11

이온의세기

DNA의 염기와 두 가닥 사이에는 서로 끌어 당기는 힘도 있지만 음으로 전하된 인산간에는 정전기적 반발력이 있어 두 가닥을 떨어지게 한다. 그러나 염이 가해질 경우 Na⁺ 같이 양 전하인 이온이 인산을 감싸서 반발력을 없앤다. 이는 0.2M의 생리적인 염농도 근처에서 일어남.

높은 염의 농도 (붉은 곡선) 혹은 낮은 염의 농도 (푸른 곡선)를 포함하고 있는 용액 속 에서 DNA 분자를 90도 까지 가열하여 두 가닥을 분리한 후 다시 25도까지 급격히 냉각하였다. 냉각 후 A₂₆₀을 측정하면 높은 높은 염농도의 값이 낮은 염농도에 비해서 훨씬 적다.

이는 높은 염 농도에 있는 DNA의 가닥 내에서 염기쌍을 형성하기 때문이다

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4. 5 Renaturation of DNA (복원)

Requirements for DNA renaturation:

• salt concentration must be high (0.15-0.5 M NaCl)

– to eliminate electrostatic repulsion between phosphates in the two strands

• temperature must be 20-25º below the T_m – allows stable interstrand base-pairing

Renaturation is a slow process compared to denaturation because precise collision between complementary sequences is required (상보적인 가닥이 정확히 만나야함)

그림과 같은 분자를 조사 함으로 변성과 복원에 관한 연구를 수행함. IA와 IC’의 만남은 염기쌍을 형성하나 주위의 염기쌍들이 불안하고 안정된 중첩이 일어나지 않아 오래가지 못함. IB와 IB’이 쌍을 이루자 마자 즉시 이중가닥 DNA가 생김.

변성된 DNA 용액에서 외가닥은 자유롭게 혼합되고 무 작위적으로 만난다. 예를 들어

14NH₄Cl와 ¹⁵NH₄Cl의 배지에서 균을 각각 키운 후 DNA를 추출한 후 이들을 혼합시켜서 변성, 복원 시키면 25% 는 양가닥에 ¹⁴N을 포함하고 50%는 한가닥은 ¹⁴N 다른가닥에는

15N을 갖으며 나머지 25%는 양가닥에 ¹⁵N을 갖는다 ₁₁

4.6 DNA helicases (풀기효소)

DNA helicase (풀기효소)는 초당 500-1000bp의 속도로 이중 가닥 DNA를 외가닥 DNA 중간 매개체로 만들기 위하여

nucleotide triphosphate와 결합하고 가수 분해를 한다.

E.coli에서 14 종, 효모에서 15종, 바이러스에서 6종, 사람에서 24종 등이 분류되었고 사람에서 풀기 효소에 돌연변이가

생기면 Werner syndrome이 생김. 풀기 효소는 보통 2 – 6개의 polypeptide subunit이 모인 oligomer로 작용함 .

그림처럼 어떤 풀기효소는 갈라진 DNA 분자를 요구하고 어떤 것은 3’ 혹은 5’ 꼬리에 작용하고 다른 것은 비점착 말단에

작용.

어떤 풀기 효소는 외가닥 DNA를 따라 3’에서 5’으로 이동하고 다른 것은 반대로 이동한다.

위 그림은 helicase의 기질중 (좌) 비점착 말단을 갖는 DNA 분자 기질이며

(우) 3’ 혹은 5’ 꼬리를 갖는 기질을 나타내며 A 분절은 5’ 에서 3’으로 이동한다는 것을 의미하며 B 분절은 3’에서 5’로 풀기효소가 이동한다는 것을 나타냄.

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DNA helicases의 구조

Figure 4.15

DNA helicase는 보통 6개의 동일한 subunit가 고리 같은 구조로 배열된 육합체이다.

현재 잘 연구된 육합체 풀기 효소는 T7 phage helicase와 E.coli DnaB helicase이다.

이들은 DNA 복제에 중요한 역할을 하며 갈라진 DNA 분자에 결합을 하고 결합된 단일 가닥을 따라서 5’-3’으로 이동하며 nucleoside triphosphate를 이용한다.

T7gp4 풀기효소/프리마제 육합체

풀기효소는 초록리본, 프리마제는 푸른색 리본으로 표시함. 5’에서 3’ 방향으로 중앙에 있는 외가닥을 따라서 이동함.

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4.7 Single-stranded DNA binding proteins

(a)낮은 농도의 SSB

(b)높은 농도의 SSB

외가닥 DNA 결합 단백질은 DNA 풀기효소에 의하여 생기는 일시적인 단일가닥을 안정화 시킨다.

그림 (b)에서 보는 것처럼 SSB는 하나가 결합하면 다른 것들이 협동적으로 결합을 하게 된다.

T4 phage의 SSB인 gp32는 첫번째 분자가 일시적인 용해 현상에 의하여 생긴 외가닥 DNA에 결합을하면 다음으로 부가적인 gp32가 결합을 한다. 이때 DNA의 분절과 gp32의 argine과 lysine이 나열된 틈과 결합을 한다

E. coli의 동형사합체 (분자량 75kDa)인 SSB. 각각의 세포는 800개의 SSB를 갖음. 협동적인 방법으로 외가닥 DNA에 결합을 하지만 반응하는 방법은 다르다.

즉 옆의 그림처럼 실패의 주위를 실이 감싸는 것 같이 외가닥 DNA가 하나 혹은 두개의 결합 단백질 사중합체의 중심부를 둘러싼다.

다른 SSB로는 효모나 사람에서 분리된 복제단백질 A (RPA, Replication protein A)이 있으며 이는 70, 30, 14kDa로 된 이형삼합체이다. 70kDa 소단위의 중간부위와 DNA가 결합을

한다. ¹⁴

Figure 4.18

4.8 topoisomer and topoisomerase (위상이성질체와 DNA 회전효소)

대부분의 박테리아 DNA 분자와 바이러스 DNA 분자는 환형이다. 예를 들어 E. coli는 길이가 약 1mm이며 자신보다 약 1000배 긴 이중 가닥 환형의 분자이다.

실험실에서는 박테리아의 chromosomal DNA 보다는 plasmid DNA를 이용하여 연구한다.

환형분자는 두개의 상보적이고 끊어지지 않은 covalently closed circle이거나 하나 혹은 그이상의 Nick가 있는 nicked circle(새김눈 고리)이다.

Closed covalent circle Singly & multiply- nicked & circle

폐 공유결합 환형분자 (covalently closed circle)는 축이 교차 되거나 비틀어져서 초나선 (superhelix 혹은 supercoil)으로 존재한다.

동일한 염기 서열을 갖고 있으나 다른 정도의 초나선을 갖는 두개의 이중 나선 환형 DNA분자를 위상이성질체 (topological isomer 혹은 topoisomer)라고 한다.

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Supercoiled DNA (초나선 DNA)

선형 이중가닥 DNA는 연결 되면 이완된 고리를 만든다.

선형 이중가닥이 연결전에 풀어지면 음성 초나선구조 (좌)를 갖고 만일 초기 회전이 더 많은 꼬임을 야기 시킨다면 연결된 고리는 반대로 비틀어져서 양성 초나선(우) 구조를 만들게 된다.

음성초나선 양성초나선

• Linking number (고리수)

– related to the number of times the two backbones wrap around each other – equals the sum of the twisting and writhing numbers

• Twisting number (꼬임수)

– determined from the total number of turns of the double stranded DNA – total base pairs divided by base pairs per turn

• Writhing number (초나선 회전수)

– number of times the helix crosses itself LK = Tw +Wr

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DNA topoisomerase (회전효소)

Figure 4.23

박테리아의 복제는 두 가지 점에서 위상학적인 문제가 야기된다.

1. 복제기간에 DNA 분자는 풀려야 하며 폐공유 결합고리이기 때문에 한 지역이 풀린다는 것은 다른 지역에 더 많은 꼬임을 야기 시킨다. 많은 꼬임은 복제를 불가능하게 한다.

2. DNA 복제가 끝난 후 두 개의 딸 DNA 가닥이 서로 맞물린 연쇄체를 형성하는데 이들이 풀려서 낭세포로 나뉘어져야 한다.

이러한 문제를 해결하는 것이 DNA topoisomerase이며 한 위성이성질체를 다른 위성이성 질체로 전환시킨다. 회전효소에는 두 가지가 있는데 I형 회전효소는 한 가닥과 일시적인 연결을 하고 II형 회전효소는 두 가닥과 일시적인 연결을 한다.

I형 회전효소는 두 개의 아형인 IA형과 IB형으로 나뉜다.

제임스 왕이 최초로 IA아형 회전효소인 E. coli 회전 효소를 발견하였다.

이들 효소는 활성화 부위의 티로신이 DNA 가닥의 5’-인산말단과 일시적인 결합을 하여 자른다. 다음으로 잘라진 부위가 봉합되기 전에 잘라지지 않은 가닥은 일시적으로 생긴 틈새를 통하여 움직인다.

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DNA topoisomerase I은 네가지의 위상학적인 변화를 촉매

Figure 4.24

옆의 그림처럼 회전효소 I은 네가지 변화를 촉매하며 어느 반응도 ATP를 요구하지 않는다.

1) 음성 초나선 DNA를 이완시킨다

2) 단일가닥 DNA 고리를 매듭짓고 푼다.

3) 두개의 상보적인 단일 가닥 고리를 이중가닥 DNA 고리로 연결한다

4) 최소한 하나의 새김눈을 갖는 이중 가닥 고리를 연쇄체로 전환하다.

E. coli 회전효소 I의 N-terminal 구조 (잔기 2-590)

단일 가닥이나 이중 가닥 DNA를 모두 에워싸는 직경 2.7nm 의 중앙 구멍을 중심으로 4개의 영역으로 구성됨.

영역 I, III, IV는 하부, II는 상부에 아치를 만든다. 영역 II와 III 는 경첩으로 연결된 것처럼 효소가 열리거나 닫힌 형태가 되게 한다. 영역 III의 티로신 319는 잘라진 가닥의 5’ 말단과 일시적인 인산디에스터 결합을 한다.

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Topoisomerase I의 작용기작

음성 초나선 플라스미드 DNA에서 한 회전을 이완 시키는 동안 발생한다고 제안된 과정.

DNA의 두 가닥은 푸른색이며 네 개의 영역은 앞장 그림과 동일. 회전효소의 형태는 닫힌 형 (패널 a, d, f) 과 중앙 구멍을 통하여 DNA가 들어갈 수 있는 열린 형 (패널 b, c, e)간에 변동이 되는 것으로 묘사되었다. 열린 형의 형태는 II/III과 II/IV 경첩 모두에서 움직일 수

있도록 모형이 만들어 졌다. ¹⁹

Topoisomerase II의 작용기작

II형 DNA 회전효소는 다른 이중 가닥을 통한 하나의 온전한

이중가닥 DNA 분자의ATP의존성 운반을 촉매.

진핵세포의 회전효소 II의기작을 그림으로 설명.

E. coli의 대표적 II형 효소는 DNA 자이레이즈이며 ATP의 존재하에 음성 초나선 구조를 공유결합된 폐환형 DNA로 바꾼다.

회전효소 II의 ATP 가수분해효소 부위와 핵심 영역은 각각 초록과 연한 푸른색으로 표시 되었다. (단계 1) 촉매적 순환은 회전효소가 두 가닥의 DNA 분절에 결합 할 때 시작되며 이 DNA 분절은 문 분절 혹은 G 분절 (붉은색)과 운반 분절 혹은 T 분절 (진한 푸른색)로 명명 되었다. (단계 2) ATP 분자가 ATP 가수분해효소 영역에 결합을 하여 영역들이 연관을 맺게 된다. (단계 3) G 분절이 잘라진다. (단계 4) T 분절이 G 분절에 있는 틈을 통하여 이동

하면서 동시에 하나의 ATP 분자를 가수분해 한다. (단계 5) G 분절이 재결합 되고 남아 있는 ATP 분자가 가수분해 된다. (단계 6) 두개의 ADP 분자가 떨어져 나간 후에 T 분절은 핵심 영역의 통로를 통하여 운반된다. (단계 7) 핵심 영역의 출구는 닫히고 ATP 가수분해 효소가 분리되면서 효소를 DNA로부터 분리시킨다.

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