유전정보의 흐름
- 기본정설(central dogma)
- 복제(replication):
DNA 정보가 상보적인 새로운 뉴클레오타이드의 염기쌍으로 복사되는 과정
- 전사(transcription):
DNA의 유전정보가 하나의 RNA사슬로 복사되는 과정 - 번역(translation): mRNA로 전사된 유전정보가
아미노산들을 질서정연하게 중합시키는 복잡한 과정
- 정확한 정보를 마련해 주는 DNA
주형(template) DNA
- 출발점으로서 작용하는 짧은 폴리뉴클레오타이드 사슬
프라이머(primer)
- RNA중합효소: 프라이머 필요없음
- DNA중합효소, 역전사효소 프라이머 필요
그림 4-19. 복제의 시작, 프라이머의 합성.
DNA의 복제
- 복제의 형식:
어버이가닥의 순서 얻어진 상보적인 DNA가닥
반보존적(semi-conservative)
그림 4-20. 복제의 방법.
- 메셀슨(Meselson)과 스탈(Stahl) 실험:
대장균 배양액 15NH4Cl 여러 세대 배양
14NH4Cl 첨가 짧은 간격으로 세포 제거
DNA추출, 원심분리(평형밀도 기울기)
그림 4-21. 메셀슨-스탈의 실험.
1. 복제의 개시
- 복제의 눈: 세타(Θ) 구조
- 복제의 눈에서 갈라진 부분:
복제분기점(replication fork) - 복제는 양방향(bidirectional)
- 대장균의 경우 oriC라고 부르는 245bp지역에서 복제 시작
그림 4-22.
대장균의 θ복제의 구조 및 양방향성.
DNA복제 메커니즘
- 이중가닥의 풀림: A-T염기쌍이 풍부한 지역 - 복제의 시작점 oriC에 DnaA이 부착
- DnaB 두 개의 육합체는 가닥이 풀린 지역의 끝의 각각에 보충(대장균의 DnaB, 헬리케이스
푸는 기능) - 단일가닥부착단백질(SSB):
분리된 가닥이 재결합되지 않도록 잡아주는 기능 - 녹는과정:
ATP의 가수분해에 의한 자유에너지 필요 - 토포아이소머레이스II(자일레이스):
음으로 초코일화된 고리형 염색체를 품
RNA프라이머의 확인
- 리펨피신(rifampicin) RNA중합효소방해제 - 실험관이나 생체내부에서 복제과정 방해
- RNA중합효소의 돌연변이체 방해 안 됨
- RNA중합효소 DNA주형으로 짧은 RNA합성 - DNA가닥에 붙어 50~100잔기 RNA
복제분기점에서 복제의 시작
- 선도가닥(leading strand), 지연가닥(lagging)
모두 프라이머의 합성 필요 - 대장균에서 프라이머 합성체계
프라이모솜(primosome)
DnaB(헬리케이스), DnaG(프라이메이스) - 대장균에서 두 개의 pol III(레플리솜)
- 진핵세포 3~300kb마다 한 개의 복제 시작점
- 레플리콘: 복제의 시작점(근처의 20~80개의 묶음이 동시에 활성화)
그림 4-23. 복제분기점에서 복제의 시작.
2. 복제의 연장
- 복제의 연장 DNA중합효소 III의 존재하에 일어남 - 가닥을 푸는 단백질, DnaA 필수
- 말단 3’-OH에 친핵성 공격
- 중합보조효소III 12개의 잔기 복제 - DNA중합효소 III 완전효소의
β소단위체 500~1000bp 연장
움직일 수 있는 고정나사(clamp)
효소가 고정됨 중합효소의 진행을 증진 - 대장균의 DNA ~1000nt/s의 속도로 복제
- Pol III의 γ복합체 DNA주형 이중 β-고정나사(clamp)
가닥을 푸는 장치 고정나사배치자
- γ복합체 DnaB, 헬리케이스에 부착된 두 개의 τ소단위체 - 진핵세포의 RNA프라이머 제거:
RNaseH1, 플랩핵산내부가수분해효소-I(FEN1)
그림 4-24. 오가자끼조각에서의 DNA의 복제.
3. 복제의 종결
- 대장균:
· oriC에서 시작, 시계반대방향
TerG, F, B, C를 거쳐 TerA, D, E에서 정지
· 시계방향
TerE, D, A를 지나 TerC, B, F, G에서 정지 - Tus단백질: Ter지역에 부착,
DnaB(헬리케이스)가닥의 이전을 방해
시작점의 움직임 방해
그림 4-25.
대장균의 염색체지도상에서 복제의 종결점.
DNA접합효소(ligase) - 대장균 NAD+
5’아데닐산 + 니코틴아마이드모노뉴클레오타이드 - 동물세포: ATP를 필요
- T4 DNA접합효소:
이중가닥이 수직으로 잘린 DNA(blunt end)를 연결
그림 4-26.
대장균 DNA접합효소의 반응 메커니즘.
진핵세포의 DNA종결(terminanation) - RNA프라이머 주형 3’말단까지 쌍을 이룸
지연가닥 5’말단까지 합성 못함 - 복제 될 때마다, 프라이머 있던 부분이 잘림
- 진핵세포의 염색체말단 텔로미어
텔로머레이스(합성유지)
- 텔로미어의 DNA는 각 염색체 끝 3’말단가닥에 1000개나 그 이상의 짧은 G-가 풍부한 직렬로 되풀이되는 순서를 가짐
진핵세포의 DNA종결(terminanation)
- 사람의 경우 TTAGGG 텔로머레이스(라이보핵 단백질)는 역전사효소활성의 활성을 갖음
- 반복해서 DNA가닥의 새로운 3’말단으로 이전, DNA에 다중의 텔로미어의 순서 첨가
- 노쇠현상: 텔로머레이스가 약화
염색체의 끝부분이 잘려짐 - 암세포는 높은 활성의 텔로머레이스
조절이 불가능한 지속적인 복제
- 세포는 20~60회의 제한된 증식(배양세포가 제한된 증식) 텔로머레이스 항암제의 우수한 목표물질
DNA중합효소
- 네 개의 데옥시라이보뉴클레오타이드들이 부착되는 한 개의 부착지역
- 주형 DNA의 부착지역 - 프라이머의 부착지역
- 말단 뉴클레오타이드 3’OH그룹의 부착지역 - 3’-5’, 5’-3’-핵산말단가수분해효소
- 클레노우(Klenow)조각: 중합효소의 공통구조
그림 4-27.
대장균 DNA중합효소 I의 클레노우조각의 삼차구조.
클레노우조각부위 - 두 개의 Mg2+ 활성부위
- 한 개의 Mg2+
dNTP와 프라이머의 –OH을 활성화
dNTP의 α-인산그룹의 공격 - 다른 금속: 3’-OH에만 작용
그림 4-28.
DNA중합효소의 반응 메커니즘.
고등생물의 DNA중합효소
- DNA중합효소 α : 세포질 또는 핵에서 발견된 주된 중합반응
- DNA중합효소 β : 주로 핵에서 발견되는 효소
- DNA중합효소 γ : 세포질과 핵에 모두 들어있는 효소 - 마이토콘드리아의 DNA중합효소
- 바이러스에 감염에 의해서 유도된 중합효소 - RNA종양바이러스 RNA DNA 역전사
유전자의 돌연변이와 수선
- 점 돌연변이(point mutation):
· 피리미딘이 다른 피리미딘으로 등 같은 염기 사이의 치환 전이(transition)
· 퓨린이 피리미딘으로 치환 전위(transversion)
- 한 개 또는 두 개 이상의 염기쌍의 삽입 또는 결손이 발생하는 돌연변이 가능
1. 물리적 또는 화학적인 돌연변이 유발(생성)
- 물리적, 화학적인 돌연변이
DNA염기의 손실, 부가, 변형
해독구조(reading frame)의 코돈의 이동 (1)아질산(HNO2): 염기의 탈아미노화,
아데닌 하이포잔틴, 사이토신 유라실, 구아닌 잔틴
(2)하이드록실아민:
사이토신과 분리된 체계(in vitro)에서 특수하게 반응
(3)알킬화 시약: 다이메틸설페이트(DMS), 에틸메테인설포네이트(EMS)
염기의 메틸화 데옥시라이보사이드
사차질소형성 데옥시라이보스의 배출
염기의 교체 DNA사슬의 손상
(4)메틸화 시약:
N
-메틸-N
’-나이트로-N
-나이트로소구아니딘(MNNG)그림 4-29. 두 타이민 염기의 이합체의 구조.
2. 수선의 메커니즘
- 절단수선(excision-repair)
타이민이합체의 제거
- 색소성 건피증(xeroderma- pigmentosum) - 자외선에 민감한 유전병
절단에 필요한 핵산내부가수분해효소의 결핍
그림 4-30.
절단수선 메커니즘.
유전자재조합
1. 유전자재조합
- 유전자 운반체(vector)
DNA의 정제 및 절단에 의한 열기 - 연구대상 유전자의 획득
- 원하는 크기로 절단 및 운반체에 삽입(Cloning) - 클론된 유전자의 숙주에 삽입(transformation)
원하는 DNA가 포함된 세포의 확인
그림 4-31.
유전자재조합방법.
2. 재조합운반체 및 재조합된 클론의 선별방법
- 비염색체 DNA, 플라스미드
- 레플리콘(replicon)을 갖는 독자적인 유전체
대장균
- 숙주세포에 진입가능
- 쉽게 선별가능 병원의 증상(phetogenic trait)
유전자운반체 pBR322 - ApR유전자 RSF2124
- TcR유전자 pSC101 - 플라스미드 Col E1 - pMB1 복제인자
- 4363 염기쌍
- TcR 여섯 개의 제한효소
- ApR유전자에 세 개의 제한효소 - ApR 유전자삽입
테트라사이클린에 살아남고 ApR에 살아남지 못하는 형질전환딘 대장균의 칼러니를 선별
그림 4-32.
유전자운반체 대장균 플라스미드 pBR322.
pUC18 플라스미드
- β-갈락토시데이스 유전자 lacZ - 효소의 기질 X-gal 절단 푸른색 - 효소유전자 절단 무색
그림 4-33.
pUC18 플라스미드.
3. 제한효소
- 제한된 절단부위
큰 크기의 유전자로 절단
- 절단면 접착성(cohesive, sticky)
그림 4-34. 접착성 말단에 의한 DNA의 연결.
4. 유전자의 획득(DNA libraries)
- mRNA로부터:
· 다량 생산하는 조직(인슐린, 렝거헨섬 세포)
· mRNA 분리(polydT 칼럼)
· 세포외 전사기구(밀 배아)
· 해당단백질 확인 mRNA cDNA - 유전체의 문고
· 제한효소사용: 염색체 DNA절단 분류
· 숙주세포에서 단백질의 확인
그림 4-35. 대장균에서 사람의 인슐린 제조.
5. 트랜스포메이션(형질전환)
- 1970년 하이가(Higa)가 대장균에 CaCl2 처리
박테리아파지 λ DNA의 내부진입 - 코헨(Cohan) CaCl2 처리한 대장균
플라스미드 DNA 내부진입
- RecB- 선형박테리아 DNA의 진입 - RecB+ 10%의 효율로 진입
- 적정전환효율
μg
플라스미드 DNA당107~108 세포수6. 포유류에서 유전자의 재조합
- 유전자 기능의 이해,
유전적 질병의 치료방법의 개발
- 태아줄기세포 상동재조합 특정유전자
양쪽 말단에 상보적인 유전자
- 대리모자궁에 착상 유전자 도입난자
그림 4-36.
상동재조합에 의한 고등생물에 변형된 유전자의 도입.
녹아웃쥐(knock-out mouse) - 특정유전자 손상 유전자 손실 쥐
- 쥐의 유전자는 사람의 유전자와 같은 26,383개 - 현재 10,000개의 유전자 기능 상실
- 당뇨병, 심장질환, 암, 노화의 원인, 희귀한 유전병 치료
그림 4-37. 녹아웃쥐의 생산.
재조합 관련기술
1. 아가로스 젤 전기영동법
- 1%의 아가로스 사용
- DNA의 절단 및 접합 확인 방법 - 수 백개 염기 ~ 20,000개
- 이티듐브로마이드(ethidium bromide) 0.05
μ
g/띠그림 4-38.
DNA의 아가로스 젤 전기영동.
2. 서던 및 노던흡입법
- DNA염기 순서에서 10 ~ 20개 방사선 표지
탐침(probe)
- 서던흡입법:확인하려는 DNA분리(젤전기영동)
알칼리처리 단일가닥
- 나이트로셀룰로스 여과지로 이동 - DNA는 80oC로 구워 고정
- 탐침이든 용액에 넣게 되면 DNA와 혼성화 - 노던흡입법: RNA 확인
아미노벤질옥시메테인 여과지
DNA탐침
그림 4-39.
서던흡입법에 의한 DNA의 제한효소 절단조각의 확인.
3. PCR 방법
- 증폭시키려는 연구대상의 DNA정제 - 짧게 가열하여 이중가닥을 분리
- 서로 반대방향의 탐침
- 담금질 dNTP + 과량 탐침
- 가열 냉각 복제: 25~30번 되풀이 - Tag DNA중합효소를 사용
그림 4-40.
반복된 중합효소 사슬반응(PCR).
4. DNA서열분석
- 다이데옥시방법(dideoxy method):
1975년 생거(Federick Sanger)
- 이중가닥 DNA 단일가닥 DNA(주형)
- 합성된 방사성 표지, 프라이머 + DNA pol I - 2’,3’-ddNTP 사용(3’-OH없음, 합성 정지) - 적은 양의 ddATP
dC가 나타난 곳에 미성숙된 종결