The Physiological Changes in the Olive Flounder Paralichthys olivaceus Caused by a Diet Containing CaO

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Kor J Fish Aquat Sci 47(5),567-576,2014 한수지 47(5), 567-576, 2014

Original Article

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서 론

칼슘은척추동물내에서뼈및치아의형성, ^신경전달^활성근 육의수축및이완, ^혈액^응고, ^체액의^산, ^알칼리성^평형, ^호르 몬과여러효소들의활성, 세포분열등에중요한역할을하는물 질로알려져있다(Paterson, 1978; NRC, 1993).

어류는지속적인성장을위해살아가는동안계속해서체내 에칼슘을축적하고, ^수중에^녹아있는^칼슘을^아가미를^통하여 흡수한다. ^아가미는^어류와^물^사이의^접촉점이^되는^가장^중요 한부위이며(Parry, 1966), 수중칼슘을흡수하는데있어가장 중요한기관이다(Herrmann-Erlee and Flik, 1989; Flik et al.,

1993). 어류는아가미를통해수중에존재하는칼슘을직접적

으로흡수하며, ^그^중^일부는^장을^통하여^흡수된다. ^칼슘^배설 은주로소변을통해이루어진다(Flik et al., 1993). ^{해산어류는} 상당한양의칼슘(약 10 mmol 1^-1)이용해되어있는해수를마 시기때문에고농도의뇨를배출하여수분이유출되는것을방

지하고동시에현저한칼슘을축적하므로, ^장^{상피세포의}^칼슘 투과유량이담수어류에비해낮은편이다(Flik et al., 1996). 반 면담수어류는주변이온농도보다체내삼투압이높아몸안으 로물이계속유입되기때문에이것에대응하기위해묽은뇨 를생산하며, 칼슘손실은칼슘의재흡수활동을통해최소화 시킨다(Hickman, 1968; Schmidet-nielsen et al., 1975; Renfro et al., 1982).

어류는번식시기에달하면평소보다더많은칼슘을필요로 하며, ^{무지개송어}(Oncorhynchus mykiss)^의 ^경우, ^성숙^시기 별혈중칼슘수치를비교한결과미성숙시기보다 성숙시기

에혈중칼슘농도가더욱높아지는것으로나타났다(Yeo and

Mugiya, 1998). 또한, 대서양대구(Gadus morhua)에서도생식 소를발달시키기위해산란전에장내의칼슘흡수량이급격히 증가하는것이보고되었다(Sundell and Björnsson, 1988). ^이 처럼어류에있어서성숙시기나빠른성장이요구되는어린시 기에서는외부로부터의칼슘흡수가매우중요한역할을할것

CaO (oxide calcium)가 첨가된 사료 공급이 넙치

(Paralichthys olivaceus)에 미치는 생리적 변화에 대한 연구

문혜나·남궁진·여인규*

제주대학교 해양생명과학과

The Physiological Changes in the Olive Flounder Paralichthys olivaceus Caused by a Diet Containing CaO

Hye-Na Moon, Jin Namgung and In-Kyu Yeo*

Department of Marine life Science, Jeju National University, Jeju 690-756, Korea

This study investigated the physiological effects of a diet containing calcium oxide (CaO) on the olive flounder,

Paralichthys olivaceus

. The results indicate that the amount of calcium in the blood was higher in the calcium group compared with the controls. The aspartate amino transferase (AST) and alanine amino transferase (ALT) levels were lower in the calcium group, while lysozyme activity was higher in the calcium group. Histologically, fish in the calcium group had more hepatocytes in the liver and more intact scales. In addition, an attack experiment using

Vibrio anguillarum

(KCTC-2711) and

Edwardsiella tarda

(KCTC-3657) showed that the survival was higher in the calcium group compared with the controls. These results suggest that feeding fish CaO when they require it, such as during periods of gonadal maturation and rapid growth, will increase their immunity and resistance to pathogens.

Key words: Oxide calcium, Feeding diets,

Paralichthys olivaceus

, Physiology, Immunity

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http://dx.doi.org/10.5657/KFAS.2014.0567 Kor J Fish Aquat Sci 47(5) 567-576, October 2014

Received 17 June 2014; Revised 6 August 2014; Accepted 12 September 2014

*Corresponding author: Tel: +82. 64.754. 3474 Fax: +82. 64. 756. 3493 E-mail address: [email protected]

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문혜나

ㆍ

남궁진

ㆍ

여인규

568

이라고여겨진다(Flik et al., 1993).

어류는일반적으로사육수로부터의칼슘흡수에의존하는것 으로알려져있으나, ^사료를^통해^칼슘을^{추가적으로}^공급했을 때 아메리칸 시클리드(Cichlasoma urophthalmus) (Chavez- Sanchez et al., 2000) ^등의^어종에서^성장에^좋은^영향을^나타 내는것으로보고되고있다. ^또한, ^자주복(Takifugu rubripes), 큰민어(Nibea japonica) 및가숭어(Chelon haematocheilus)와 같은일부어류들에서는성장및성숙에필요한체내의칼슘 요구량을사육수로부터충분히공급을받지못하는것으로보 고되었다(Furuichi et al., 1997; Hossain and Furuichi, 1999 ; 2000). ^한편, ^해산어류^중^감성돔(Acanthopagrus schlegelii) ^및 참돔(Pagrus major)은해수에서칼슘을충분히이용할수있으 나, ^넙치(Paralichthys olivaceus) 및숭어(Mugil cephalus) 등 은해수로부터충분한칼슘이흡수되지않기때문에적절한칼 슘보충제를이용하여칼슘을공급하여야한다고보고되고있 다(Hossain and Furuichi, 2000a; 2000b; 2009). ^이처럼^칼슘의 농도가높은해수에서식하는어종에있어서도칼슘흡수기작 의차이를나타내며, ^특히^치어의^{성장시기나}^성어의^성^성숙시 기또는외부로부터많은스트레스를받는사육환경하에서는 외부로부터의칼슘공급이추가적으로필요한것으로판단되고 있다. ^따라서^본^{연구에서는}^{양식넙치에}^생리활성^및^면역력^증 대에미치는효과를조사하기위하여패류의패각을고온, 고전

압으로소성하여생산된고농도산화칼슘(CaO)^용액을^습사료

(MP)에첨가하여현장실험을실시하였다.

재료 및 방법

실험동물 및 산화칼슘의 첨가 농도

어체내의 칼슘흡수율과체내활성을살펴보기 위한실험은 2012^년 6^월부터 7^월까지^약 1^개월간^진도의^{양식장에서}^사육 중인넙치(Paralichthys olivaceus)^를^{사용하였으며}, ^각^실험군 당 10×10 m의수조에서약 2,500마리씩사육하였다. 사육기

간동안의수온은 20.43±1.8℃^로^{자연수온에}^{의존하였으며}^환

수는 1일약 30회실시되었다.

칼슘섭이군과대조군의사육수조는각각 3^개의^수조로^구분 하여사육하였으며, ^{칼슘섭이군에는}^사료에 1,500 mg/ton^의^농 도가되도록 CaO를첨가하여실험을실시하였다.

CaO^의^제작은^패각류를^고온(1,500-5,000℃)^에서^극도로^높 은전압으로고온소성통전하는방법으로제작된제주에코바이 오텍의제품을사용하였으며, ^사료에^첨가된 CaO^의^농도는^미 성숙시기의넙치를이용한예비실험을통하여 CaO^를^공급시

넙치의혈중칼슘농도가 50% 전후상승하는농도를기준으로

설정하였다. ^실험어는^성숙기의^평균^전장 34.1±1.3 cm ^및^평 균체중 410.5±50 g의넙치성어와평균전장 18.83±0.29 cm 및평균체중 70±10 g^의^넙치^치어를^각각^{사용하였다}.

한편, ^넙치의^면역력에^미치는 CaO^의^영향을^조사하기^위해

제주도내의양식넙치치어를대상으로 사료내 CaO^가 2,000

mg/ton 이되도록첨가하여 1개월간사육한후병원균의공격실

험을 3^반복^{실시하였다}. ^사육기간^동안의^수온은 24.68±1.3℃

였고, 실험어의평균전장은 19.6±1.7 cm 및평균체중 69±17 g^이었으며^각^수조당 20^마리씩^수용하여^대조군, PBS (phosphate buffered saline) ^투여군, Vibrio anguillarum (KCTC- 2711) 투여군및 Edwardsiella tarda (KCTC-3657) 투여군을

설정하여 CaO ^공급에^따른^면역력의^차이를^{관찰하였다}.

혈액성상 분석

혈액분석을 실시하기 위하여 실험넙치를 0.01%^의 2-Phe- noxy-Ethanol^로^마취한^뒤, ^항응고제^처리를^하지^않은 3 mL 주사기를 사용하여 미부 정맥에서 혈액을 채혈하였다. 채취 된혈액은상온에서 2^시간^보관^후에, ^{원심분리기를}^이용하여 12,000 rpm에서 10분간혈청을분리하였다. 이후분리된혈청 을사용하여 aspartate amino transferase (AST), alanine amino transferase (ALT) ^및^혈액^내^칼슘^양을^{측정하였다}. ^칼슘분석 은자동분석기용 Ca²⁺측정용시약(아산제약)을사용하였으며, AST ^와 ALT^는 stanbio laboratory ^에서^제조된^키트를^사용하 였다. 모든혈액성상분석은혈액자동분석기(CH 100 PLUS) 로측정하였다.

Lysozyme 활성

넙치에서분리한혈청, 아가미점액및체표점액을각각 15 μL^씩 96 well plate^에^분주한^후 150 μL Micrococcus lysodeik- ticus solution (0.1 M phosphate buffer saline, pH=6.8)을넣 고, 25℃ ^에서 5 ^분간^반응^후 450 nm^에서^흡광도를^측정하고, 다시 5^분^간^반응^시킨^뒤^동일한^파장에서^흡광도를^측정하여 lysis 전후의흡광도차를비교하여측정하였다. Lysozyme의 활성단위(U)^는^흡광도 0.001/min^의^감소치를 1 unit^으로^정의 하였다.

간 및 혈중 단백질 함량

간의단백질함량은 Lowry et al. (1951)^의^방법에^따라 bo- vine serum albumin (BSA)을사용하여 750 nm에서흡광도를 측정하였다.

혈중단백질함량은 stanbio laboratory에서제조된키트를사 용하여혈액자동분석기(CH 100 PLUS)^로^{측정하였다}.

비늘 외형 관찰

CaO 급이후의성숙시기와성장시기넙치의비늘의외형상

태를파악하기위하여 Zu (2004)^의^실험^방법을^이용하여^채취

및염색을실시하였다. 채취는핀셋으로비늘이상하지않게비 늘안쪽을잡아채취하였으며, ^비늘^염색은^조직^염색^시에^사용 되는 eosin^에^약 5^초간^담가두어^색을^{침적시키고}, 95% ethanol 에서잔여물을제거한뒤슬라이드에염색된비늘을올려놓고, 광학현미경을사용하여관찰하였다.

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CaO 급이에 따른 넙치의 생리적 변화

569 간 외형 및 조직 관찰

간의외형평가는 Tanaka et al. (2013)^의^연구에서^사용된^간 의출혈정도를육안으로판단하는실험방법에따라대조군과 칼슘섭이군넙치의간외관컨디션을비교하기위하여해부를 통해육안으로간의상태를확인하였다.

조직관찰은어체로부터간을절개하여, bouin’s solution^에 24 시간고정한후수세와탈수과정을거쳐파라핀에포매후, ^박 절기로 5 μm ^절편을^제작하여 hematoxylin-Eosin (H&E) ^염 색하였다.

공격실험

CaO ^공급이^넙치의^면역력에^미치는^영향을^조사하기^위하

여병원균을이용한공격실험을실시하였다. ^실험은^일반사료 만급이한대조군과 CaO 2,000 mg/ton^의^농도로^첨가한^사료 를한달간급이한칼슘섭이군넙치를사용하였으며, ^각^그룹당 20마리로나누어 3반복실험을실시하였다.

공격실험은 PBS (phosphate buffered saline)^와 ^병원균V.

anguillarum (KCTC-2711) ^및 E. tarda (KCTC-3657)^를^사용 하여진행하였으며, PBS^를 ^제외한^{병원균들은} 1% NaCl ^첨 가 tryptic soy Agar (TSA, Difco) ^배지에서 25℃, 24^시간^배양 한후시험에사용하였다. V. anguillarum는 1×10³ cfu/mL, E.

tarda는 1×10⁵ cfu/mL ^로^현탁하여^{복강주사를}^통해^공격실험 을실시하였다. ^각^실험군당 20^마리로^수온은 23-25℃^로^유지 하였으며복강주사후 14^일간^살펴보며^폐사율을^{측정하였다}.

통계처리

SPSS (Ver.21) 통계분석프로그램을활용하여 t-test로분석하 였으며, P<0.05에서유의성을판단하였다.

결 과

혈액성상 분석

성숙기와미성숙기넙치의혈액내칼슘분석결과, ^성숙기^대

조군의혈중칼슘량은 165.9±5 mg/L, ^성숙기^{칼슘섭이군의}

혈중칼슘량은 195.27±9 mg/L ^으로^대조군에^비하여^칼슘섭 이군의혈중칼슘량이유의적으로높게나타났다(P<0.05) (Fig.

1A). 미성숙기대조군의혈중칼슘량은 105±7 mg/L이며미성 숙기칼슘섭이군의혈중칼슘량은 162.73±4 mg/L^으로^칼슘 섭이군의혈중칼슘량이유의적으로높았다(P<0.05)(Fig. 1B).

ALT/AST ^측정은 ^성숙기 ^성어만을 ^대상으로 ^{측정하였다}.

AST ^측정결과^대조군 26.38±4 U/L, ^{칼슘섭이군} 10.88±2 U/

L으로대조군보다칼슘섭이군에서유의적으로낮게나타났으 며(P<0.05), ALT 측정결과역시대조군 5.63±1 U/L, ^칼슘섭

이군 5.13±1 U/L^로^{대조군보다}^{칼슘섭이군에서}^더^낮게^나타

났으나유의적인차이는나타나지않았다(Fig. 2).

Lysozyme 활성

비특이적면역활성 중하나인 lysozyme ^활성^측정^결과^혈

청에서의 lysozyme 활성은대조군 10±0.1 U/mL, 칼슘섭이

군 50±0.5 U/mL^로 ^{칼슘섭이군이}^{유의적으로}^더^높은^활성

을나타냈으며(P<0.05), 체표점액 lysozyme 활성역시대조군 32.5±2.5 U/mL, ^{칼슘섭이군} 83±2.5 U/mL^로^{유의적으로}^더 높게나타났다(P<0.05). ^또한^아가미^{점액에서의} lysozyme ^활 성이대조군 7.5±0.3 U/mL, 칼슘섭이군 25±0.2 U/mL 로칼 슘섭이군이유의적으로높은활성을가졌다(P<0.05)(Fig. 3).

간과 혈액의 단백질 함량

간내의단백질대조군의단백질함량은 41.6±1 mg/mL, ^칼

슘섭이군의단백질함량은 45.9±3 mg/mL^이었으며^칼슘섭이 구의간단백질함량이유의적으로높은것을확인할수있었 다(P<0.05).

Days

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80

Control CaO diet (A)

Days

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80 100 120

Control CaO diet (B)

(C)

Days

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80 100 120

Control CaO diet

Mortality (%)Mortality (%)Mortality (%)

0 1 2 3 4 5 6 7 (B)

ALT (unit/L)

0 10 20 30 40 50 60 (B)

Lysozyme activity in skin (U/mL)

0 10 20 30 40 50 60 (A)

Lysozyme activity in serum (U/mL)

40 45 50 55 60 (B)

Protein level of serum (mg/ml)

0 5 10 15 20 25 30 35 (A)

AST (unit/L)

0 5 10 15 20 25 30 (C)

Lysozyme activity in gill (U/mL)

20 25 30 35 40 45 50 (A)

Protein level of liver (mg/ml)

(B)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Calcium concentration in serum (mg/L)

0 50 100 150 200 250 (A)

Control CaO diet

Fig. 1. Analysis of calcium concentration in serum of olive flounder Paralichthys olivaceus, (A), mature stage; (B), immature stage.

*Significant difference between control group and CaO diet group based on the t-test (P<0.05).

(4)

문혜나

ㆍ

남궁진

ㆍ

여인규

570

혈액내의대조군의단백질함량은 51.3±1 mg/mL, ^칼슘섭이

군의단백질함량은 51.8±1 mg/mL로대조군과칼슘섭이군에

서의유의적인차이는발견할수없었다(Fig. 4).

비늘 외형

미성숙기의대조군과칼슘섭이군넙치의비늘을채취하여염 색한결과대조군의비늘끝은요철모양으로비늘사이의틈이 갈라져있는형태였으나(Fig. 5A), 칼슘섭이군의비늘은갈라 짐없는일정한형태를나타내었다(Fig. 5C). ^이후^성숙기의^대 조군과칼슘섭이군넙치의비늘염색결과또한대조군의비늘

끝이심하게불균형한것에비해(Fig. 5B) ^{칼슘섭이군의}^비늘

끝은일정한형태를나타내었다(Fig. 5D).

간 외관 및 조직학적 분석

대조군과칼슘섭이군넙치의간을해부하여육안으로확인해

본결과대조군(Fig. 6A)의간은출혈이일어나서붉게된반면

Days

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80

Days

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80 100 120

(C)

Days

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80 100 120

Control CaO diet

0 1 2 3 4 5 6 7 (B)

ALT (unit/L)

0 10 20 30 40 50 60 (B)

0 10 20 30 40 50 60 (A)

40 45 50 55 60 (B)

0 5 10 15 20 25 30 35 (A)

AST (unit/L)

0 5 10 15 20 25 30 (C)

20 25 30 35 40 45 50 (A)

(B)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

0 50 100 150 200 250 (A)

Control CaO diet

Fig. 2. Analysis of AST (A) and ALT (B) in serum of olive flounder Paralichthys olivaceus. *Significant difference between control group and CaO diet group based on the t-test (P<0.05).

Days

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80

Days

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80 100 120

(C)

Days

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80 100 120

Control CaO diet

0 1 2 3 4 5 6 7 (B)

ALT (unit/L)

0 10 20 30 40 50 60 (B)

0 10 20 30 40 50 60 (A)

40 45 50 55 60 (B)

0 5 10 15 20 25 30 35 (A)

AST (unit/L)

0 5 10 15 20 25 30 (C)

20 25 30 35 40 45 50 (A)

(B)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

0 50 100 150 200 250 (A)

Control CaO diet

Fig. 3. Lysozyme activity in serum (A), skin (B) and gill (C), of olive flounder Paralichthys olivaceus. *Significant difference between control group and CaO diet group based on the t-test (P<0.05).

에칼슘섭이군에서는출혈이관찰되지않았다(Fig. 6B).

또한조직학적방법으로간조직을확인해본결과칼슘섭이군

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571

의간세포간의조밀도가대조군에비해조밀한것을확인할수 있었다(Fig. 6C, 6D).

공격실험

PBS^군의^환경변화^및^절식에^따른^폐사율을^관찰한^결과^칼

슘섭이군이대조군에비해폐사율이적은것으로나타났다(Fig.

7A).

V. anguillarum 을복강주사하여인위감염을시킨후폐사율

을관찰한결과대조군에서는 10일째 100% 폐사하였으나칼슘 섭이군은약 70%^의^폐사에^그쳐^대조군에^비해^높은^질병^내성 을보였다(Fig. 7B).

E. tarda 를복강주사하여인위감염시킨결과대조군에서는 9

일째 100% ^{폐사하였으나}, ^{칼슘섭이군에서는}^{실험종료시점인}

12일째까지도약 50%의생존율을나타내어질병에대한내성

이강하게나타났다(Fig. 7C).

고 찰

칼슘은어류의면역력과성장에중요한역할을하는물질로서 사람과어류뿐만아니라식물등다방면에서중요성이대두되 고있다. ^{어류양식에서도}^칼슘을^이용한^실험은^연구되고^있으 나산화칼슘인 oxide calcium (CaO)을이용한연구는거의진 행되지않았다.

어류의혈액은생리상태의변화를파악할수있는요인이며, 성숙시기에는혈중칼슘요구량이급격히증가하는것으로알 려져있다(Yeo and Mugiya, 1998; Chen et al., 2004). ^본^연구

에서 CaO 공급이넙치의혈액내칼슘흡수량에미치는영향을

확인하기위하여미성숙기와성숙기넙치의혈중칼슘농도를 측정한결과대조군에비하여칼슘섭이군의혈중칼슘량이유 의적으로높았음을확인할수있었으며(P<0.05), 앞에서언급 되었던 Hossain and Furuichi (2009)^의^{연구결과와}^유사한^결 과를나타내고있다. 이것은넙치와같이해수내에서칼슘을 충분히흡수하지못하는어종의경우사료내칼슘첨가가어류 체내의칼슘을보충해줄수있다는것을시사한다. ^또한^이전 의넙치사료내칼슘첨가시에사용되는 tricalcium phosphate (TCP)^는^흡수율이^높지^않은^것으로^{나타났으나}(Hossain and Furuichi, 2000), CaO의경우대조군에비하여칼슘섭이군의 체내칼슘농도가증가된것으로보아 CaO^가^이온화된^형태로 존재하여어류의장내칼슘흡수에용이하게작용한것으로여 겨진다.

AST^와 ALT^는^간을^비롯한^체내의^장기에^존재하는^아미노

산합성효소로서, 간과특정장기가손상을입을시에수치가 상승하는것으로알려져있으며, ^간^기능^검사시에^주로^사용되 고있다. ^어체의^{생리상태가}^좋지^않을수록^간의^장애(Gordon,

1968)^가^일어나고^활성이^높아져^혈중^농도가^증가하는^것이^보

고되었다(Casilas and Ames, 1985; Rao et al., 1990). ^본^연구 에서의대조군과칼슘섭이군의 AST 측정결과대조군보다칼 슘섭이군에서유의적으로낮게나타났으며(P<0.05), ALT는두 실험구간유의적인차이는없었지만칼슘섭이군이낮아지는결

과를나타내어칼슘섭이가 AST, ALT^를^감소시켜^간^기능^개선

에효과가있는것으로여겨진다.

비특이적면역활성중하나인 lysozyme은자연계에넓게분

포하는효소로서, peptidoglycan^이^주성분인^세균의^세포벽^성 분을분해하는작용을가지고있으며, ^이외에도^보체의^옵소닌 화, ^{항바이러스}, ^항암작용^등에도^관여를^하는^것으로^보고^되었 다(Jolles and Jolles, 1984). Lysozyme^은^어류의^점액, ^림프조 직, 혈장및기타체액에존재하는데(Hikima, 2001), 어류의피

부표면과아가미에주로존재하는점액 lysozyme^은^세균^침입

에대한초기방어역할을수행한다고알려져있으며, ^성별, ^수온, pH, ^독성물질^노출, ^감염^및^스트레스^정도에^따라 lysozyme ^활 성이다양하게나타난다(Saurabh and Sahoo, 2008).

Days

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80

Days

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80 100 120

(C)

Days

0 2 4 6 8 10 12 14

0 20 40 60 80 100 120

Control CaO diet

0 1 2 3 4 5 6 7 (B)

ALT (unit/L)

0 10 20 30 40 50 60 (B)

0 10 20 30 40 50 60 (A)

40 45 50 55 60 (B)

0 5 10 15 20 25 30 35 (A)

AST (unit/L)

0 5 10 15 20 25 30 (C)

20 25 30 35 40 45 50 (A)

(B)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

0 50 100 150 200 250 (A)

Control CaO diet

Fig. 4. Protein level of liver (A) and serum (B) in olive flounder Paralichthys olivaceus. *Significant difference between control group and CaO diet group based on the t-test (P<0.05).

(6)

문혜나

ㆍ

남궁진

ㆍ

여인규

572

동물에서 lysozyme은 c-type (chicken or conventional type), g-type (goose-type) ^그리고 i-type (invertebrate type)^으로^세 종류의 lysozyme이존재하며, 그중어류에는 c-type과 g-type 의 lysozyme^이^존재한다(Hikima, 2000). ^이 c-type^과 g-type

lysozyme^은 ^그람^양성균^및 ^음성균에^{항균효과가} ^있는^것으

로알려졌으며(Itami et al., 1992; Yousif et al., 1994; Hikima et al., 2001; Minagawa et al., 2001; Zheng et al., 2007), ^특히 c-type lysozyme은 calcium-binding lysozyme으로불리며칼 슘과결합하는특징이있다(Saurabh and Sahoo, 2008). ^따라서 칼슘이선천면역인 lysozyme ^활성에^있어^중요한^역할을^하는

것으로판단되어본실험에서 lysozyme 활성측정을통한면역

력을평가하였다. ^넙치의^혈청, ^아가미^점액, ^체표^점액의 lyso-

zyme 측정결과모두대조군에비해칼슘섭이군의 lysozyme

활성이유의하게 증가했음을확인할수있었다. ^이는 CaO^가

lysozyme^을^비롯한^면역^기능^활성을^{증가시켰기}^때문으로^여

겨지며따라서 CaO의급이가넙치의체내면역을증가시키는 효과가있는것으로판단된다.

간외형평가는일반적으로포유동물과사람의컨디션을확인 하기위하여이루어지며, ^대상이^간^주변에^외상을^당하거나^질 병성또는스트레스성징후를보였을때간출혈이일어나는것 으로알려져있다(Tanaka et al., 2013). 본실험의결과, 칼슘섭 이군의간출혈이대조구에비해거의일어나지않았으며, ^간^조 직또한조밀한형태를가지는것으로확인되었다. 어류가 CaO 를충분히흡수하였을경우외부스트레스에대한저항성을강 화시켜스트레스성간출혈을저하시켰기때문으로사료되며, 간조밀도가대조군에비해높게나온것은면역력이증가함에 따라외부자극에대한저항성이강해졌기때문으로판단된다. 간이손상을입을시에수치가상승하는것으로알려진 AST와 ALT ^결과^또한^본^실험에서^대조군에^비해^{칼슘섭이군에서}^활 성이낮게나타나 CaO^가^{외부스트레스}^저항성을^높여주는^것 Fig. 5. Staining results of scales in olive flounder Paralichthys olivaceus (A, control in immature stage; B, control in mature stage; C, calcium diet in immature stage; D, calcium diet in mature stage).

(7)

573

으로판단된다.

또한 CaO^의^첨가에^따른^넙치의^{면역활성기능을}^조사하기^위 하여어류병원성세균인 V. anguillarum 과 E. tarda를인위감 염시킨실험에서대조군의경우높은폐사율을보였지만칼슘 섭이군에서는폐사율이낮은결과를보임으로써칼슘이넙치의

비특이적면역계중체액성면역계를담당하는 lysozyme^과^보

체의활성에영향을미쳐외부스트레스와병원균저항력이향 상에도도움을주는것으로여겨진다.

경골어류의칼슘은약 95%^가^뼈와^비늘에^포함되어^있으며 (Flik et al., 1986), 이부위들은성성숙기와초기성장시기와같 이칼슘수요가높아지는기간에대체적으로칼슘을공급해주 는저장소의역할로작용한다. ^특히^어류의^{산란기에는}^칼슘수 요가급격히증가되기때문에외부또는뼈와비늘에서부족한 칼슘을보충하게되는데금붕어, ^송사리(Mugiya and Watabe, 1977) 및무지개송어(Carragher and Sumpter, 1991; Persson et al., 1994; 1995; 1997)^의^연구에^따르면^이와^같은^시기의^초

기칼슘동원은주로뼈보다비늘에서이루어지는것으로다수 보고되어있다. ^이처럼^산란기와^{초기성장기에}^많은^양의^칼슘 이비늘에서동원되게되므로이시기에는어류에서비늘에서 의칼슘재흡수가높아져비늘의연륜이옅어지고두께도얇아 지는현상을보여체표에서의면역력이약화될가능성이높아 진다.

Mugiya and Watabe (1977)^는^칼슘^요구량이^높아지는^시기 에넙치의비늘에서칼슘방출이이루어져체내로칼슘이동원 되는것으로보고하고있으며, ^본^실험^{결과에서도}^{양식넙치의} 사육중비늘로부터칼슘의재흡수가이루어지는것으로나타 났다. ^이에^본^{실험에서와}^같이 CaO^의^섭취를^{인위적으로}^유도 할경우장관으로부터충분한칼슘이넙치의체내로흡수되어 비늘에서의칼슘재흡수가이루어지지않고비늘의모습이일 정한형태를유지하는것으로판단된다.

상기의결과를미루어보아산란기나초기성장기같이많은양

의칼슘을필요로하는시기에 CaO ^형태의^칼슘을^사료나^사육

Fig. 6. Liver appearance and histological analysis of olive flounder Paralichthys olivaceus (A, C, control; B, D, calcium diet).