전통발효식품들에서 독소 생성 곰팡이를 억제하는 식용에 안전한 균들 분리 및 이들이 만드는 항진균물질 특성 연구
김정환 경상대학교 식품공학과
1. 서 론
김치, 청국장을 포함한 전통 발효식품에는 곰팡이, 효모, 세균을 망라하는 다양한 미생물이 존재 한다. 이들은 식품의 원재료나 주위 환경에서 유래하며 이들의 종류와 이들 간 상호작용은 발효식 품 품질에 큰 영향을 미친다. 발효식품에 존재하는 미생물에 관한 연구는 오래전부터 진행되어 왔 지만 발효환경에 따른 종류별 증식 차이나 항균물질 생산을 통한 미생물 간의 상호작용이 해당 발효식품 품질에 어떤 구체적인 영향을 미치는지에 대해서는 여전히 많은 부분이 알려져 있지 않다.
전통발효식품들의 기능성과 기능성을 부여하는 성분들의 분석에 관해서는 많은 연구들이 활발 히 진행되고 있다. 하지만 기능성 생성에서 중요한 한 축이 되는 미생물의 역할에 관해서는 앞으로 보다 집중적인 연구가 요망된다. 미생물의 역할이나 상호작용에 대한 이해가 깊어지는 만큼 이들이 관여하는 발효식품의 품질개선이 가능하기 때문이다.
최근 활발한 전통식품의 과학화, 현대화 연구의 목표는 전통식품의 건강 기능성은 최대한 높이 면서 동시에 유해한 오염과 그로 인한 독성물질 생성은 최대한 줄이는 것이라 하겠다. 전통발효식 품은 자연발효 방식으로 제조되어서 식품재료과 주위 환경에 따라서 품질이 다르고 발효과정이 조 절되지 않아서 기능성 물질 생성면에서 최적화가 어렵다. 또한 원료나 제조과정에서 오염되는 유해 균에 의한 독소생성은 신속히 해결해야 할 심각한 문제점이다.
Aflatoxin, deoxynisins, fumonisins, zearalenone 등과 같은 곰팡이 독소를 생성하는 곰팡이에 의 한 식품원료나 식품오염은 전 세계적으로 큰 경제적 손실과 함께 식중독 사고를 초래하고 있다.
독소생성 진균에 의한 식품오염을 방지하며 오염이 일어나더라도 곰팡이 증식을 억제하는 식용미 생물들을 찾아서 발효식품 제조에 종균으로 사용하거나, 이들이 만드는 항진균물질을 첨가제로 사용하는 방안들은 보다 철저한 위생적인 제조공정 도입과 함께 좋은 방안이 될 수 있다. 만약 이 들 균주들이 항진균 활성 외에 발효특성도 우수하다면 안전성 제고뿐 아니라 품질이나 기능성도
개선된 발효식품을 얻을 수 있을 것이다. 본 연구의 목표는 김치, 청국장, 젓갈 등 여러 전통발효 식품에서 항진균 활성을 지닌 균주들을 찾아서 이들을 정확히 동정하는 것이고 나아가 이들이 만 드는 항진균물질의 특성을 조사하고 정제하는 것이다. 예상되는 결과들은 장기적으로 발효식품 제조에 적합한 종균 선발에 이용될 수 있고 또 첨가제로 개발 가능한 물질들의 선발에도 도움이 될 것이다. 전통발효식품에서 증식하는 미생물들이 생산하는 항균물질의 종류와 분포를 알게 해 주며 나아가 발효식품에서 여러 미생물 간의 상호작용 이해라는 중요한 기초연구에 크게 기여할 것이다.
유해 미생물에 의한 식품이나 식품원료들의 오염은 막대한 경제적 손실뿐 아니라 심할 경우 인 명 손실도 초래한다. 최근 일련의 식중독 사고들에서 알 수 있듯이 사회적 파장이나 생산업체의 경 제적 피해도 매우 심각한 수준이다. 때문에 식품제조에서 미생물학적 안전성을 확보하는 방안들은 매우 중요하게 고려되어야 한다. 특히 화학합성보존제 사용이 기피되는 상황에서 식용미생물 중에 서 항진균, 항균물질을 생산하는 균주들을 찾아서 발효식품 제조용 종균으로 혹은 항균물질을 첨가제로 사용하는 방안들은 적극 검토되어야 한다.
식품에 첨가할 수 있는 안전한 미생물을 이용하여 독소 생성 곰팡이들을 저해하는 방안은 전 세 계적으로 아직 연구가 많지는 않지만 식품 안전성 확보라는 측면에서 개발의 필요성이 크다. 특히 항생제나 합성의약품이 내성 문제나 잔류 독성으로 인해 사용에 제약이 커지고 있는 점과 신선한 최소 가공식품(minimally processed fresh foods)을 선호하는 소비자들의 요구를 고려할 때 식용 미 생물들이 만든 천연항균물질들은 곰팡이 억제를 위한 효과적인 대안이 될 수 있다. 박테리오신 같 은 단백질성 항균물질을 단독으로 식품에 사용할 경우 효과가 제한적이지만 다른 처리들과 함께 사용하면 항균력에서 상승효과를 기대할 수도 있다. 이런 측면에서 박테리오신을 포함한 천연항 균물질에 대한 체계적인 그리고 지속적인 연구는 중요하다. 식용 미생물에 의한 유해 곰팡이 저해 현상 연구는 미생물 간의 상호작용 이해라는 기초연구로서 시작되겠지만 그 결과들의 산업적 응용 가능성이 크다. 특히 외국에서 거의 연구되지 않은 김치나 청국장 같은 전통발효식품에서 보고되지 않은, 항진균능이 우수한 균주들이 분리되고 이들이 만드는 항균물질이 동정된다면 이들은 신규 물질일 가능성도 있다.
전통발효식품의 세계화를 위해서는 기능성 제고, 품질 개선 등과 함께 식품안전성 확보가 필수 적이다.
진균독소 생성 곰팡이 오염이 문제가 된다면 아무리 우수하더라도 소비자들이 해당식품을 섭취 하지 않을 것이고 특히나 우리의 전통발효식품에 익숙하지 않은 외국인들이라면 더욱 그럴 것이다.
때문에 항진균, 항균능력을 지닌 식용미생물들의 탐색과 이들의 접종을 통해서 독소 생성 진균이 나 유해 세균 오염을 줄이는 연구는 매우 중요하다.
다양한 전통발효식품을 조사하면 바람직한 항진균, 항균활성을 지닌 균들을 찾을 가능성이 크
다. 항진균, 항균물질 생산균주들을 얻은 다음 종균으로서의 적합성, 즉 식품에서 빠른 증식과 바 람직한 대사물 생성 등을 항진균, 항균 활성과 함께 조사할 필요가 있다. 이런 특성들을 지닌 바람 직한 균주들이 얻어지면 이들의 개량 노력과 함께 이들을 이용한 발효식품 제조가 진행되어야 할 것이다. 전통발효식품의 품질개선과 세계화는 궁극적으로 식품안전성과 기능성 제고 측면에서 이 루어져야 하고 이런 점에서 본 연구의 의의가 있다. 즉 본 연구를 통해서 독소생성 곰팡이나 유해균 을 억제하는 식용에 안전한 균들이 확보되고 이들의 특성과 이들이 만드는 항진균, 항균물질에 대 한 이해가 이루어진다면 장기적으로 안전하면서도 품질이 우수한 전통발효식품 제조에 활용될 것 이다. 기초연구 측면에서 볼 때 식품에서 미생물들 사이에서 일어나는 상호작용을 이해하는 데 도 움이 되고 이를 통해서 발효식품 품질에 근본적인 영향을 미치는 미생물들에 대한 이해가 깊어질 것 이다.
식용 미생물들이 만드는 항진균물질은 사람이 섭취하더라도 안전하여 각종 식품에 첨가되어 저 장성을 높이는 보존제로 개발될 수 있다.
항진균 식용균주 혹은 이들이 만드는 항진균물질을 과실이나 채소에 살포할 경우 독성이 우려 되는 인공합성 진균제를 대체할 수 있어 보다 안전한 식품 생산에 기여할 것이다.
항진균, 항균 물질은 식품 외에 사료 첨가용으로 또는 가축의 건강증진을 목적으로 하는 제품 들 개발에 적용될 수 있다.
전통발효식품에서 유래한 항진균 균주들의 탐색과 동정 및 배양 특성 조사 결과를 통해서 발효 식품들의 품질에 영향을 미치는 미생물들의 역할에 대한 기본 이해를 높일 수 있다.
항진균, 항균능을 지닌 균주들의 선발과 이들의 특성조사 결과들은 고품질 전통발효식품들의 제조에 종균으로 접종 가능한 균주들의 확보와 균주 pool을 넓히는 데 기여할 것이다.
이에 우리나라 재래식 메주로부터 항진균 및 항세균 활성을 나타내는 Bacillus amyloliquef aciens 균주를 분리하였으며 그 미생물학적 특성과 이 분리균주가 생산하는 bacteriocin-like substances와 bio-surfactant를 부분정제하고 그 특성을 규명하고자 하였다.
2. 연구방법
2.1 전통발효식품에서 균주 분리
실험실에서 메주와 청국장에서 균을 분리하였다. 이들 시료를 10gr 이상 일정량 취해서 0.1% 펩톤수 와 혼합한 다음 Stomacher를 사용하여 균질화한다. 균질액을 0.1% 펩톤수(BactoTM pepton, BD) 를 사용하여 10배씩 단계적으로 희석한 후 0.1ml씩을 LB (Nacl, trypton, yeast extract) 한천배지들에
도말한다. 배양기를 이용하여 37℃, 48시간 배양하여 독립된 균락들을 얻는다. 생성된 균락들의 형 태를 보고 Bacillus 등을 일차로 선발한다. 이들을 LB 배지에 접종하여 보관용 stock을 먼저 확보한 다. 이 균들은 LB 배지에 접종하여 37℃에서 진탕 배양한다.
2.2 전통발효식품에서 항진균능을 지닌 균주 탐색
실험실에서 메주와 청국장에서 분리하여 보관 중인 300여 Bacillus 균주들을 대상으로 항진균능을 탐색하였다. 곰팡이 포자가 섞여 있는 굳기 전인 potato dextrose agar(DifcoTM potato dextrose agar, BD, 이후 PDA)를 Petri-dish에 부어 굳힌 후 LB 배지에서 18시간 배양한 Bacillus 균주 배양액 2µl spot하여 항진균 능력이 있는 균들을 선발하였다. 곰팡이 포자는 KACC, KCCM에서 분양받은 곰 팡이(Rhizopus microsporus var. oligosporus ATCC 22959, Aspergillus oryzae ATCC 11493, Aspergillus sojae ATCC 9362)들을 PDA 배지에서 접종하여 25℃ incubator에서 5일간 배양한 후 멸균한 나무젓 가락을 사용하여 포자를 긁어 약 5ml의 멸균한 3차 증류수가 들어 있는 tube에 포자를 모아 멸균 한 깔데기와 거즈를 사용하여 여과하여 준비하였다.
2.3 항진균능을 지닌 균주의 특성 확인
동정
recA gene sequencing
동정을 위해 recA gene primer[1]를 사용하여 PCR을 실시하였다. 프라이머로 recA R-3(5’
-CYTBRGATAAGARTACCAWGMACCGC-3’)와 recA F(5’-TGAGTGATCGTCAGGCA- GCCTTTAG-3’)를 사용하였다. 프라이머 농도는 10ppm, template로 chromosomal DNA 1µl, ExTaqTM(Takara, Japan) 2.5units, 10X buffer 5µl, dNTP 12.5mM, 전체 50µl 부피로 PCR을 실시하 였다. 증폭된 0.8 kb에 대해 염기서열을 결정하였고 염기서열을 NCBI BLAST를 통해서 database에 등록된 유전자들과 상동성을 조사하여 동정하였다. PCR 증폭에 사용한 chromosomal DNA는 Martinez [4]의 방법으로 준비하였다.
RAPD-PCR analysis
종 수준에서 구별이 가능한 RAPD-PCR 방법[1]을 사용하여 분리균들을 동정하였다. 분리균들을 18 시간 배양 후 cell로부터 chromosomal DNA를 얻고 1µl를 template DNA로 하여 15µl GoTaq green master mix(Promega, USA)와 1µl S30(5’-GTGATCGCAG-3’) primer를 사용하여 RAPD-PCR을 실 시하였다. 변성(denaturation)은 94℃에서 15초, 결합(annealing)은 35.5℃ 15초, 신장(extension)은 72℃
2분으로 총 40cycle 실행하였다. 증폭된 band 크기는 agarose gel 전기영동으로 확인하였다.
Fibrinolitic activity 측정
Antifungal 능력이 높았던 4개 균의 fibrinolytic activity를 fibrin plate[3]를 사용하여 확인하였다. 5ml 의 LB 배지에서 18시간 배양 후 상등액을 filtering(syringer type, 0.45μm)하여 fibrin plate에 10µl spot 하고 37℃에서 6시간 반응시킨 후 분해환 생성 여부를 확인한다. Fibrin plate는 PBS 7ml, fibrinogen 0.5% 35mg(MP, USA), agarose solution 8ml-2% agarose 0.14g + ddH2O, 100 NIH trombin(MP, USA) 100µl를 혼합하여 만든다.
Plasmid profile 조사
Antifungal 능력이 높았던 4개 균주들의 plasmid profile을 확인하였다. PALminiprep(1993) 방법[2]으 로 실시하였다. 얻어진 plasmid DNA 1µl를 전기영동을 수행하여 1% agarose gel상에서 band를 확인 하였다. Size maker는 MBI(USA)의 1 Kb DNA size maker를 사용하였다.
2.4 Indicator 균주에 대한 저해 관찰
항진균력 검증
Aflatoxin 생성균인 Aspergillus 속 곰팡이와, ochratoxin 생산균인 Penicillium 속 곰팡이, Rhizopus microsporusvar. oligosporus(KACC 41363, ATCC 22959), Aspergillus awamori(KACC 41844, ATCC 14331), Aspergillus niger(KACC 40280, ATCC 4695), Aspergillus oryzae(KCCM 60166, ATCC 11493), Aspergillus sojae(KCCM 60354, ATCC 9362)를 indicator로 사용한다. LB 한천 배지 위에 1×107/ml 의 포자가 섞여 있는 굳기 전의 PDA를 부어 굳힌 후 모세관을 사용하여 구멍을 뚫는다. 항진균력 이 있었던 균(4개의 Bacillus strains)과 청국장에서 분리한 2개 균(CH 51, CH 86-1), Bacillus subtilis 168의 배양액 8µl를 spot한 후 25℃에서 5일간 배양하였다. 포자는 앞서 설명한 방법으로 준비하여 얻어진 포자액 10µl를 Haemocytometer에 분주하여 커버글라스로 덮어 현미경으로 관찰하여 포자 수를 측정한다. Haemocytometer의 25개의 square 중 임의로 5개의 square의 포자수를 counting하여 평균을 구하여 평균값에 1 square의 부피(0.2mm×0.2mm×0.1mm)를 나누고 단위변환 factor(1mm3= 10-3ml)로 환산해 주어 포자수를 얻었다.
cell의 수5 × 250 × 103/ml
그리고 저해능을 나타낸 표에서 단위는 저해 영역의 크기를 측정한 다음, 균의 colony의 크기를
뺀 후 2로 나누어 주어 나온 숫자로 비교하였다. 0.5mM 이하는 +, 2~4mM는 ++, 4mM 이상은 +++
로 표시하였다.
항균력 검증
여러 다양한 균을 사용하여 실험을 실시하였다. 총 18개(Lb. caesei ATCC 4646, Lb. pentosus ATCC 8041, Lb. f ermentum ATCC 14931, Lb. delbrueckii subsp. lactis ATCC 4797, Listeria monocytogenes ATCC 19111, Streptococcus mutans ATCC 25175, Enterococcus f aecium ATCC 19953, Enterococcus f aecalis ATCC 29212, Salmonella typhimurium TA98, Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 25923, Bacillus coagulans ATCC 7050, E. coli 0157: H7 ATCC 43894, B. licheniformis ATCC 21415, B. amyloliquef aciens ATCC 23845, B. thuringiensis ATCC 33679, B. subtilis ATCC 14593, B. circulans ATCC 4513, B. cereus ATCC 14579)의 균을 사용하였고 유산균의 경우 MRS에서 Listeria의 경우 BHI 배지를, 나머지 균들은 LB에서 배양하였다.
실험방법은 다음과 같다. LB 한천 배지 위에 OD 0.5~0.8까지 자란 배양액 100µl를 굳기 전의 각 균에 맞도록 한 agar 배지에 섞어 굳힌 후 모세관을 사용하여 구멍을 뚫는다. 항진균력이 있는 균(4 개의 Bacillus strains)과 청국장에서 분리한 2개의 균(CH 51, CH 86-1), Bacillus subtilis 168의 배양액 8µl를 spot한 후 37℃에서 하루 배양하였다. 역시 항진균과 같이 사용한 단위로 항균능력을 나타낸 표에 표시하였다.
2.5 80% ammonium sulfate에 의한 항진균물질
항진균물질 준비
48시간 배양한 CH51과 MJ1-4의 배양 상등액을 filter를 사용하여 여과한 후 80% ammonium sulfate (Amresco, USA)를 사용하여 농축한 후 투석하여 100mM Tris-Hcl pH 8.0에 녹여 준비[7]하였다. 농 도 측정은 Bradford(Bio-Rad, USA) 법[5]으로 실시하였다.
항진균력 확인
준비된 항진균물질 사용하여 실험을 실시하였다. LB 한천 배지 위에 모세관을 사용하여 구멍을 뚫 은 후 항진균물질 80µg을 spot한 후 1×107/ml의 포자가 섞여 있는 굳기 전의 PDA를 부어 굳힌 후 25℃에서 5일간 배양하였다.
2.6 산 침전에 의한 항세균물질
항균물질 준비
48시간 배양한 MJ 1-4, CH 51의 배양 후 얻는 상등액을 여과(0.45μm)한 후 pH 2가 될 때까지 HCl 을 가하였다. 4℃에서 하룻밤 두어서 덩어리들이 생성되게 하였다. 원심분리를 실시하여 덩어리들을 모은 후에 5ml의 물에 녹여(NaOH를 가하여 pH 7.5로 맞춤) 투명한 용액을 얻었다[8].
항균력 확인
LB agar 배지에 구멍을 뚫어 준비된 용액을 spot(300µl)한 후 건조시켰다. 여기에 굳기 전인 agar 배지 에 Indicator 균으로 B. cereus ATCC 14579와 Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 25923의 배양 액 100µl를 섞어서 overlay하였다. 37℃에서 하루 동안 배양한 후 저해를 확인하였다.
항진균력 확인
LB agar 배지에 구멍 뚫어 준비된 용액을 spot(250μl)한 후 건조시켰다. 여기에 굳기 전인 PDA 배지 에 포자(AFB1을 생성하는 Aspergillus 속, OTA를 생성하는 Penicillium 속) 1×107/ml를 섞어 부은 후 25℃ incubate에서 5일간 배양하였다.
2.7 MJ 1-4의 항진균물질 준비 및 저해 spectrum
지금까지의 실험 결과를 바탕으로 항진균력이 높은 것으로 생각되는 균주 MJ 1-4로 항진균에 관 한 실험을 진행하였다.
항진균물질의 준비
- 80% ammonium sulfate에 의한 항진균물질(Bacteriocin-like substances) 농축
MJ 1-4 균주를 2l의 LB 배지에서 48시간 배양하여 상등액을 filter(srynger filter, 0.45μm)를 사용하여 여과한 후 80% ammonium sulfate(Amresco, USA)를 사용하여 농축한 후 투석하여 100mM Tris-Hcl pH 8.0에 녹여 준비[7]하였다. 농도 측정은 Bradford(Bio-Rad, USA) 법[5]으로 실시하였다.
- 산 침전에 의한 항균물질(crude bio-surfactant) 농축
MJ 1-4 균주를 2l의 LB 배지에서 48시간 배양하여 상등액을 filter(srynger filter, 0.45μm)를 사용하여 여과한 후 pH 2가 될 때까지 HCl을 가하였다. 4℃에서 하룻밤 두어서 덩어리들이 생성되게 하였다.
원심분리를 실시하여 덩어리들을 모은 후 NaOH를 가하여 pH 7.5로 맞추어 투명한 용액을 얻었 다[8]. 얻어진 crude bio-surfactant를 멸균한 증류수에 녹여서 실험에 사용하였다.
저해 spectrum
Aflatoxin 생성균인 Aspergillus 속 곰팡이와, Ochratoxin 생산균인 Penicillium 속 곰팡이, Rhizopus microsporus var. oligosporus(KACC NO: 41363, ATCC: 22959), Aspergillus awamori(KACC NO:
41844, ATCC: 14331), Aspergillus niger(KACC NO: 40280, ATCC: 4695), Aspergillus oryzae(KCCM NO : 60166, ATCC: 11493), Aspergillus sojae(KCCM NO: 60354, ATCC: 9362)를 indicator로 사용하 였다. 1×105/ml의 포자를 petri-dish에 부은 후 굳기 전의 PDA를 부어 petri-dish를 흔들어 주어 섞은 후 굳혔다. 포자가 포함된 굳어진 배지 위에 핀셋을 사용해 paper disc를 올려놓고 그 위에 항진균 물질(80% ammonium sulfate에 의한 침전물, 산침전물에 의한 침전물)을 spot한 후 25℃에서 3~5일 간 배양하였다(paper disk method)[9].
80% ammonium sulfate에 의한 침전물은 102μg(Bradford 법으로 농도 측정), 산침전물에 의한 침 전물은 3.8mg을 사용하였다.
그리고 저해능을 나타낸 표에서 단위는 저해 영역의 크기를 측정하여 측정한 저해 영역의 크기를 기준으로 저해 영역이 나타나지 않은 것은 -, 5~10mm는 +, 10.1~15mm는 ++, 15mm 이상은 +++로 표 시하였다.
2.8 MJ 1-4의 항진균물질 저해 기작 확인
80% ammonium sulfate 침전으로 생성된 Bacteriocin-like substances를 준비하였다. 각 효소 10mg을 준비된 30μl(58.35μg)의 Bacteriocin-like substances에 넣어서 녹였다. Ochratoxin 생산균인 Penicillium 속 곰팡이 1×105/ml의 포자를 petri-dish에 부은 후 굳기 전의 PDA를 부어 petri-dish를 흔들어 주 어 섞은 후 굳혔다. 포자가 포함된 굳어진 배지 위에 핀셋을 사용해 paper disc를 올려놓고 그 위 에 효소가 처리된 항진균물질(80% ammonium sulfate에 의한 침전물)을 spot하였다. 그리고 25℃에 서 5일간 배양하였다. 각 효소는 Protease(Sigma, EC. 232.909.5, XIV type), Proteinase K(AmrescoⓇ), Pepsin(Sigma, EC. 232.629.3), Trypsin(Sigma, EC. 3.4.21.4)을 사용하였다.
2.9 MJ 1-4의 항진균물질의 부분 정제 및 활성 확인
Bacteriocin-like substances의 gel chromatography - 정제
MJ 1-4의 항진균물질의 정제를 위해 상등액을 80% ammonium sulfate에 침전시켜 생성된 Bacteriocin-like substances로 gel chromatography(gel filtration)를 실시하였다. 100mM Tris-HCl(pH
8.0) buffer를 사용하였고, SephadexⓇ-G75(Pharmacia Fine Chemicals, 1.5×45cm)를 사용하였다[10].
1ml씩 각 60개의 fraction을 얻었다.
- 분획의 흡광도
정제하여 얻어진 각 fraction의 100μl와 100mM Tris-HCl(pH 8.0) 600μl를 섞어 OD 280nm에서 흡광 도를 측정하였다.
- 활성 확인
활성 확인은 1×105/ml의 Ochratoxin 생산균인 Penicillium 속 곰팡이를 감수성 곰팡이로 사용하 였고 paper disk method로 실시하였다. Gel chromatography(gel filtration)하여 얻어진 각 fraction의 100μl로 활성을 측정하여 항진균력을 보였던 fraction을 모아 동결 건조 후 20μg의 농도로 다시 활 성을 확인하였다.
3. 연구 결과
3.1 전통발효식품에서 항진균능을 지닌 균주 탐색
실험실에서 메주와 청국장에서 분리하여 보관중인 300여 Bacillus들을 대상으로 항진균능을 탐색 하였다. 이들로부터 항진균성이 높은 것으로 여겨지는 4개의 균주를 선발하였다. 이들을 각각 MJ 1-4, 3-6, 5-48, 7-66이라 명명하였다.
그림 1은 메주와 청국장에서 분리한 300개의 Bacillus 분리균으로 Aspergillus oryzae와 Aspergillus sojae의 곰팡이 포자가 섞여 있는 굳기 전인 PDA(DifcoTM potato dextrose agar, BD)를 Petri-dish에 부
A B
1-2 1-4 1-2 1-4
7-32 7-66 9-22 7-32 7-66 9-22
3-1 3-1
3-6 3-21 3-129 5-48
3-6 3-21 3-129
5-48
그림 1 Antifungal activities of Bacillus spp, from Meju against Aspergillus oryzae (A) and Aspergillus sojae (B).
어 굳힌 후 LB 배지에서 18시간 배양한 Bacillus 균주 배양액 2µl를 spot하여 항진균 능력이 있는 균 들을 탐색한 사진이다. 그림에서 밑줄로 표시된 균들이 항균력이 크다고 생각되는 균들이다.
3.2 항진균능을 지닌 균주의 특성 확인
선발된 4개 균의 특성을 알아보기 위해 이들을 동정하고 또 이들의 혈전용해능과 plasmid profile을 알아보았다. 실험 결과는 다음과 같다.
동정
선발균들의 동정을 위해 recA gene sequencing과 RAPD-PCR을 실시하였다.
recA gene sequencing
선발균들로부터 recA 유전자를 증폭한 후 이들의 염기서열을 결정하였다. 그림 2는 Bacillus의 recA gene 증폭을 위해 제작된 primer를 사용하여 증폭한 PCR product들의 전기영동 사진이다. 0.8kb 조 각들이 증폭되었다. 0.8kb 조각들을 정제한 후 Cosmo genetech Co.에 의뢰하여 염기서열을 조사하 였다. 밝혀진 염기서열을 대상으로 NCBI BLAST Database상의 유전자들과 상동성을 조사하였다.
그 결과는 표 1과 같다. 표에서 보듯 이들 4개 균주는 모두 Bacillus amyloliquef aciens와 99% 상동 성을 보여서 이들은 모두 B. amyloliquef aciens로 동정이 되었다. 이 표에는 나타내지 않았지만 1-4의 경우 Enterococcus malodoratus와는 74% 상동성을, 그리고 LactoBacillus diolivorans와는 73% 상동성 을 보이는 데 그쳐서 99% 상동성을 보인 Bacillus amyloliquef aciens와는 큰 차이를 보였다. 나머지
그림 2 recA gene amplification from 4 isolates. These strains were isolated from Meju and the amplified fragments were sequenced. Lanes: 1. MJ 1-4, 2. MJ 3-6, 3. MJ 5-48, and 4.
MJ 7-66.
표 1 Identification of four isolates by recA gene sequencing
Strain Identification by recA gene sequencing(identity)
MJ1-4 Bacillus amyloliquef aciens FZB42 (99%)
MJ3-6 Bacillus amyloliquef aciens FZB42 (99%)
MJ5-48 Bacillus amyloliquef aciens FZB42 (99%)
MJ7-66 Bacillus amyloliquef aciens FZB42 (99%)
균주들도 Enterococcus malodoratus와는 75%, LactoBacillus diolivorans와 73% 상동성을 보여 1-4와 거의 동일한 결과를 보였다. 이상 결과들은 분리균들이 확실히 B. amyloliquef aciens 임을 보여주는 것이다.
그림 3 Alignment of selected recA gene sequences from Bacillus sp.
그림 4 RAPD-PCR of Bacillus reference strains and Bacillus strains from Meju.
Lanes: 1. MJ 1-4, 2. MJ 3-6, 3. MJ 5-48, 4. MJ 7-66, 5. B. subtilis CH 3-5, 6. B.
licheniformis CH 3-17, 7. B. subtilis CH 3-25, 8. B. amyloliquef aciens CH 51, 9. B.
amyloliquef aciens CH 86-1, 10. B. subtilis CH 97.
RAPD-PCR analysis
동정의 정확성을 높이기 위해 다른 Bacillus strains들과 비교하여 RAPD-PCR을 실시하였다. 그림 4 는 RAPD-PCR 결과를 보여주는 agarose gel 전기영동 사진이다. 다른 Bacillus 종에 속하는 균들과 비교해본 결과 1-4의 경우 대조구로 사용한 CH 51과 CH 86-1의 2개의 major band인 1.1kb와 1.5kb 크기의 밴드 그리고minor band인 0.5kb 크기의 밴드와 일치하였지만 다른 균들의 경우에는 Bacillus sp.의 경우 나타나는 0.5kb band만 일치하였다. 하지만 대조구로 사용한 다른 Bacillus sp.(B. subtilis 의 0.5와 0.88kb, B. licheniformis 1.1, 1.5, 1.7kb)의 패턴과는 다른 결과를 보였다.
Fibrinolitic activity
혈전용해능이 있을 경우 Fibrin plat상에서 fibrin 분해 환이 생성되는데 그림 5가 fibrin plat 결과이 다. 항진균능력이 가장 컸던 4개 균과 청국장에서 분리한 CH 51, 86-1, 그리고 대조구로 plasmin을 사용하였다. 1번 MJ 3-6을 제외하고는 대조구인 plasmin(p, 3mU)보다 높은 역가를 보였다. 3번 MJ 7-66의 경우 가장 큰 역가를 보였다. 이상의 결과로 이 균들은 높은 항진균력뿐만 아니라 혈전용해 능도 지니고 있는 것을 확인하였다.
Plasmid profile
4개의 균들이 모두 점질물질을 생성하였지만 점질물질의 생성 정도는 다르게 나타났다. 가장 점질 물질을 적게 생성한 균은 1-4였으며, 가장 많은 점질물질을 생성한 균은 3-6이다(관찰사항). 그림 6은 항진균 능력이 높았던 4개 균주들의 plasmid profile을 확인한 전기영동 사진이다. 그림에서처럼 4개 균 모두에서 plasmid를 확인할 수 없었다. 이는 항진균능이 염색체상에 위치한 유전자(들)에 기 인함을 보여주는 결과이다.
그림 5 Fibrin plate analysis of fibrinolytic activity in supernatant of Bacillus sp.
cultures with high antifungal activities from Meju ; P. plasmin (10µl, 3mU), 1.
supernatant of MJ 3-6 (10µl), 2. supernatant of MJ 1-4 (10µl), 3. supernatant of MJ 7-66 (10µl), 4. supernatant of MJ 5-48 (10µl), 5. supernatant of MJ 9-20 (10µl), 6. supernatant of CH 51 (10µl), 7. supernatant of CH 86-1(10µl).
그림 6 Plasmid profiles of Bacillus amylolique f aciens strains showing antifungal activities.
3.3 Indicator 균주에 대한 저해 관찰
항진균 능력
표 2는 메주(항진균력이 높았던 4개의 선발균, 혈전용해능이 높았던 균 1개)와 청국장(CH 51, 86-1) 에서 분리한 Bacillus 균들과 B. subtilis 168의 배양액에서의 항진균 능력을 보여주는 표이다. 저해 영역의 크기를 측정한 다음, 균의 colony 크기를 뺀 후 2로 나누어 주어 나온 숫자로 비교하였다.
0.5mm 이하는 +, 2~4mm는 ++, 4mm 이상은 +++로 표시하였다. B. subtilis 168과 MJ 3-6, 7-66을 제 외한 대부분의 균들이 항진균 능력을 보였다. 하지만 Aspergillus oryzae ATCC 11493, Aspergillus sojae ATCC 9362, Rhizopus microsporus var. oligosporus ATCC 22959에 대해서는 MJ 1-4와 CH 51 외 에는 저해 효과를 보이지 않았다. 결론적으로 8개 균주들 중 MJ 1-4가 가장 큰 역가를 보였다. 그림 7이 항진균 능력을 보여주는 사진이다. OTA를 생성하는 Penicillium 속 곰팡이에 대해 저해 효과를 관찰하였다. MJ 1-4가 가장 큰 항진균 역가를 지님을 보여준다.
표 2 Antifungal activity spectrum of Bacillus sp. against a variety of fungi
Test strains Isolated strains
MJ 1-4 MJ 3-6 MJ 5-48 MJ 7-66 MJ 5-41 CH 51 CH 86-1 B. subtilis 168 Aspergillus oryzae
ATCC 11493 +1) - - - - + - -
Aspergillus sojae ATCC
9362 + - - - - + - -
Rhizopus microsporus var. oligosporus ATCC
22959
+ - - - - - - -
Aspergillus niger ATCC
4695 +++ - +++ - +++ +++ +++ -
Aspergillus awamori
ATCC 14331 +++ - +++ - +++ ++ ++ -
Aspergillus 속(AFB1) ++ - ++ - ++ ++ ++ -
penicillium 속(OTA) +++ - ++ - ++ ++ ++ -
1) inhibition zone size: +, 0.52) to 2mm; ++, 2 to 4mm; +++, more than 4mm.
2) The value equals to (diameter lf an inhibition zone inmM-diameter lf a colony)/2.
그림 7 Antifungal activities of Bacillus sp. against Penicillium spp.
producing OTA.
항균력 검증
표 3은 메주(항진균력이 높았던 4개 선발균, 혈전용해능이 높았던 균 1개)와 청국장(CH 51, 86-1)에 서 분리한 Bacillus 균들과 B. subtilis 168의 배양액들의 항균 능력을 보여주는 표이다. 저해 영역의 크기를 측정한 다음, 균의 colony의 크기를 뺀 후 2로 나누어 주어 얻은 숫자로 비교 하였다. 0.5mm 이하는 +, 2~4mm는 ++, 4mm 이상은 +++로 표시하였다. B. subtilis 168과 MJ 3-6, 7-66을 제외한 대 부분의 균들이 항균 능력을 보였다. 그중 CH 51이 가장 높은 항균 능력을 보였는데 특히 Gram 음 성 균에 대해서도 저해 효과를 보이는 것으로 나타났다.
표 3 Antibacterial activity spectrum of Bacillus sp. against a variety of bacteria Test strains
Isolated strains
MJ 1-4 MJ 3-6 MJ 5-48 MJ 7-66 MJ 5-41 CH 51 CH 86-1 B. subtilis 168
Lb. caesei ATCC 4646 ++1) - - - - ++ ++ -
Lb. pentosus ATCC 8041 - - - - - - - -
Lb. f ermentum ATCC
14931 - - - - - - - -
Lb. delbrueckii subsp.
lactis ATCC 4797 - - - - - - - -
Listeria monocytogenes
ATCC 19111 + - - - - - + -
streptococcus mutans
ATCC 25175 - - - - - - - -
Enterococcus f aecium
ATCC 19953 - - - - - _ - -
Enterococcus f aecalis
ATCC 29212 - - - - - - - -
salmonella typhimurium
TA98 - - - - - ++ - -
Test strains
Isolated strains
MJ 1-4 MJ 3-6 MJ 5-48 MJ 7-66 MJ 5-41 CH 51 CH 86-1 B. subtilis 168 Stapylococcus aureus
subsp. aureus ATCC 25923
- - - - - ++ - -
Bacillus coagulans
ATCC 7050 - - - - - +++ - -
E. coli 0157 : H7 ATCC
43894 - - - - - +++ - -
B. lichenif ormis ATCC
21415 + - ++ - + + + -
B. amyloliquef aciens
ATCC 23845 +++ - ++ - ++ ++ +++ -
B. thuringiensis ATCC
33679 - - - - - - - -
B. subtilis ATCC 14593 - - - - - - - -
B. circulans ATCC 4513 - - - - - - - -
B. cereus ATCC 14579 + - - - - ++ - +
1) inhibition zone size : +, 0.52) to 2mm; ++, 2 to 4mm; +++, more than 4mm.
2) The value equals to (diameter lf an inhibition zone inmM-diameter lf a colony)/2.
그림 8 Antibacterial activities of Bacillus sp. against a variety of bacteria.
항진균력이 높았던 MJ 1-4도 CH 51번보다는 적은 저해 효과를 보이지만 저해 효과가 있는 균인 것으로 나타났다. 하지만 Gram 음성 균에 대해서는 저해 효과를 보이지 않았다. 그림 8은 항균 능 력을 보여주는 결과 사진이다. CH 51이 여러 균에서 항균 능력을 보이는 것을 보여준다. CH 51이 B.
cereus에서 뚜렷한 저해 효과를 나타내었고, 음성 균인 E. coli 0157에 대해서도 저해 효과를 나타내 는 것을 확인할 수 있다.
표 3 계속
3.4 80% ammonium sulfate에 의한 항진균물질
항진균력 확인
곰팡이에 대해 가장 높은 저해 능력을 보였던 MJ 1-4와 세균에 대해 가장 높은 저해 효과를 보였던 CH 51의 배양 상등액을 80% ammonium sulfate로 침전시켜서 농축을 시켰다. 침전액의 항진균 효 과를 보기 위해 실험을 실시하였다. 곰팡이의 경우 MJ 1-4의 침전액이 CH 51보다 더 저해 정도가 컸 다. 이는 앞서 실험한 배양액을 이용한 실험결과와도 일치한다. 하지만 항균의 경우 뚜렷한 저해 효 과를 나타내지 않았다(no data). 그림 9는 침전액의 독소생성 곰팡이들(AFB1을 생성하는 Aspergillus 속, OTA를 생성하는 Penicillium 속)에 대한 저해 효과를 보여주는 사진이다. MJ 1-4 침전액의 항 진균력이 CH 51보다 높은 것을 알 수 있다. MJ 1-4는 두 독소생성 곰팡이를 저해하나 CH 51은 Penicillium만 저해함을 보여준다.
그림 9 Antifungal activities of concentrated culture supernatant of Bacillus sp. Aspergillus spp. producing AFB1 (left) and Penicillium spp. producing OTA (right) were used as indicators.
3.5 산 침전에 의한 항세균물질
항균력 확인
CH 51과 MJ 1-4의 배양상등액에 HCl을 첨가하여 침전시켜 얻은 산 침전물은 항균 효과를 나타 내었다. 그림 10에 나타난 것처럼 B. cereus는 두 균의 산 침전물에 의해 저해되었으나 Stapylococcus aureus subsp. aureus는 CH 51의 산 침전물에서만 저해되었다.
그림 10 Antibacterial activities of acid precipitates from culture supernatant of Bacillus species. B. cereus (left) and Staphylococcus aureus subsp. aureus
(right) were used as indicators.
항진균력 확인
CH 51과 MJ 1-4의 배양 상등액을 HCl로 침전시켜 얻은 산 침전물은 항진균 효과도 나타내었다.
그림 11에 나타낸 것처럼 OTA를 생성하는 Penicillium 속 곰팡이는 CH 51과 MJ 1-4에 의해 뚜렷히 저해를 보였다. 하지만 AFB1을 생산하는 Aspergillus 속 곰팡이는 Penicillium 속보다는 저해 정도가 작았다. 즉, CH 51과 MJ 1-4 두 균주의 산 침전물들은 Penicillium 속 곰팡이를 더 저해하였다. 그리 고 항균력 측정 결과와 비교했을 때 민감한 곰팡이에서 더 큰 저해환을 보였다. 이를 바탕으로 추 정할 때 산 침전물이 세균보다는 곰팡이에 대한 억제력이 더 크지 않나 추정된다. 하지만 보다 자세 한 저해 정도는 항균물질의 특성 파악을 통해서 가능할 것으로 앞으로 연구가 필요하다. 또 이들 산 침전물질은 Bio-surfactants인 것으로 여겨지나 구체적으로 어떤 물질이고 어떤 특성들을 지녔는 지는 더 연구되어야 한다.
그림 11 Antibacterial activities of acid precipitates from culture supernatant of Bacillus species. Aspergillus spp. producing AFB1 and Penicillium spp.
producing OTA were used as indicators.
3.6 MJ 1-4의 항진균물질 저해 spectrum
지금까지의 실험 결과를 바탕으로 항진균력이 높은 것으로 생각되는 균주 MJ 1-4로 항진균에 관 한 실험을 진행하였다. 80% ammonium sulfate로 침전시킨 bacteriocin-like substance와 HCl을 이용 하여 침전시킨 crude bio-surfactant를 이용해 저해 spectrum을 작성해 보았다.
표 4는 항진균력이 높았던 MJ 1-4의 bacteriocin-like substance의 항진균 능력을 보여준다. 측정 한 저해 영역의 크기를 기준으로 저해 영역이 나타나지 않은 것은 -, 5~10mm는 +, 10.1~15mm는 ++, 15mm 이상은 +++로 표시하였다. 그리고 polyene계 항진균제로서 진행성이거나 치명적인 진균 감 염의 치료에 사용되는 amphotericin B를 control로 사용하여 0.2mg을 처리하였다. AFB1을 생산하 는 Aspergillus 속 곰팡이를 제외한 6가지의 곰팡이에 대한 저해 능력을 보였다. 특히 OTA를 생성 하는 Penicillium 속 곰팡이에 대한 저해 능력이 뛰어났다. amphotericin B는 7개의 모든 곰팡이 균 주에서 안정적인 저해 효과를 보였다. 결론적으로 amphotericin B보다는 다양한 곰팡이 대한 능력 을 보이지는 않지만 OTA를 생성하는 Penicillium 속 곰팡이에 대한 저해 능력이 뛰어났다. 그림 12 는 bacteriocin-like substanc의 저해 spectrum을 작성하기 위해 실시하였던 7가지의 곰팡이 균들에 대 한 항진균 능력을 보여주는 사진이다. 이 실험 결과를 바탕으로 저해 spectrum을 작성하였다. 각 곰팡이에 대한 정보는 표에서 표시한 번호로 나타내었다. 1은 bacteriocin-like substance이고, 2는 amphotericin B이다. OTA를 생성하는 Penicillium 속 곰팡이에 대해서 가장 큰 항진균 역가를 지님 을 보여준다.
표 4 Inhibitory spectrum of a bacteriocin-like substance produced
번호 균이름 1 2
activities control activities2)
(A)3) Aspergillus oryzae ATCC 11493 +1) ++
(B) Aspergillus sojae ATCC 9362 ++ ++
(C) Rhizopus microsporus var. oligosporus ATCC 22959 + ++
(D) Aspergillus niger ATCC 4695 + ++
(E) Aspergillus awamori ATCC 14331 ++ ++
(F) Aspergillus 속(AFB1) - ++
(G) penicillium 속(OTA) +++ ++
1) -, no inhibition zone, +, 5~10mm, ++, 10.1~15mm, +++, above 15mm.
2) amphotericin B, 0.2mg(10μl).
3) fungal reference strains number.
그림 12 Samples of a bacteriocin-like substance tested for antimicrobial activity against variety fungi. 1. bacteriocin-like substance, 2. amphotericin B.
표 5는 항진균력이 높았던 MJ 1-4의 crude bio-surfactant의 항진균 능력을 보여주는 표이다. 측 정한 저해 영역의 크기를 기준으로 저해 영역이 나타나지 않은 것은 -, 5~10mm는 +, 10.1~15mm 는 ++, 15mm 이상은 +++로 표시하였다. 역시 마찬가지로 amphotericin B를 control로 사용하였다.
Aspergillus niger ATCC 4695, Aspergillus awamori ATCC 14331, OTA를 생성하는 penicillium 속 (OTA) 곰팡이에 대한 저해 능력을 보였다. Aspergillus niger ATCC 4695에 대해 가장 높은 저해력을 보였다. 두 번째로 높은 능을 보였던 것은 OTA를 생성하는 penicillium 속(OTA)이었고 Aspergillus awamori ATCC 14331의 순이었다. amphotericin B 역시 7개의 모든 곰팡이 균주에서 안정적인 저해 효과를 보였다. 비록 bacteriocin-like substance와 amphotericin B에 비해 다양한 곰팡이에 대한 저해 능력을 보이지 않았지만 Aspergillus niger, OTA를 생성하는 Penicillium 속 곰팡이에 대한 저해 능력 으로 보아 특정 균들에 대한 저해 능력은 뛰어난 것으로 여겨진다. 그림 13은 crude bio-surfactant의 저해 spectrum을 작성하기 위해 실시하였던 7가지의 곰팡이 균들에 대한 항진균 능력을 보여주는 사진이다. 이 실험결과를 바탕으로 저해 spectrum을 작성하였다. 각 곰팡이에 대한 정보는 표에서 표시한 번호로 나타내었다. 1은 bacteriocin-like substance이고, 2는 amphotericin B이다. OTA를 생성 하는 Penicillium 속 곰팡이에 대해서 가장 큰 항진균 역가를 지님을 보여준다.
표 5 Inhibitory spectrum of the crude bio-surfactant produced
번호 균이름 1 2
activities control activities2)
(A)3) Aspergillus oryzae ATCC 11493 -1) ++
(B) Aspergillus sojae ATCC 9362 _ ++
(C) Rhizopus microsporus var. oligosporus ATCC 22959 _ ++
(D) Aspergillus niger ATCC 4695 +++ ++
(E) Aspergillus awamori ATCC 14331 ++ ++
(F) Aspergillus 속(AFB1) - ++
(G) penicillium 속(OTA) ++ ++
1) -, no inhibition zone, +, 5~10mm, ++, 10.1~15mm, +++, above 15mm.
2) amphotericin B, 0.2mg(10μl).
3) fungal reference strains number.
그림 13 Samples of the crude bio-surfactant tested for antimicrobial activity against variety fungi. 1. bacteriocin-like substance, 2. amphotericin B.
두 가지의 항진균물질의 저해 spectrum의 결과를 종합적으로 보면 bacteriocin-like substanc와 crude bio-surfactant 모두 뛰어난 항진균 능력을 보였다.
bacteriocin-like substance의 경우 OTA를 생성하는 Penicillium 속 곰팡이에 대해서는 뛰어난 능력
을 보여 저장 곡류, 빵과 밀가루를 주재료로 하는 식품, 땅콩, 호두와 같은 건과류 등에서 오염되 어 식중독 사고를 일으키는 Ochratoxin에 대한 식품오염을 줄이는 데 이용될 수 있을 것이다. crude bio-surfactant에 비해 다양한 곰팡이 균주들에 대한 저해 능력을 보였기 때문에 좀더 광범위한 항곰 팡이 효과를 발휘하여 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
또한 crude bio-surfactant의 경우 특정 균들에 대한 저해 효과가 큰 것으로 여겨지는데, 이 중 높은 과당 옥수수 시럽을 만드는 데 이용되며, 사이다와 포도주 정화에도 유익하게 이용되기도 하지만 포도, 양파, 땅콩과 같은 특정 과일 등에 검은곰팡이 등을 피워 질병을 일으키는 원인이 되는 일반 적인 음식 오염물질이며, 식물 등에는 치명적인 검은곰팡이류 식물병을 일으키지만 인간에게는 그 다지 피해를 주지 않는(다량의 포자를 흡입하는 경우에, 심각한 폐병, 아스페르길루스증은 생길 수 있는 것으로 알려진) Aspergillus niger에 대한 저해 능력을 보여 이를 방지하는 데 이용될 수 있을 것 으로 여겨진다.
3.7 MJ 1-4의 항진균물질 저해 기작 확인
Bacillus amyloliquef aciens MJ 1-4의 Bacteriocin-Like Substances(상등액을 80% ammonium sulfate 침 전시켜 생성)를 얻어 효소 처리에 따른 반응으로 저해 기작을 조사하였다. 각 효소 10mg을 준비된 30μl(58.35μg)의 Bacteriocin-like substances에 넣어서 녹여 사용하였으며 paper disc method로 실험을 진행하였다. Indicator로는 Ochratoxin 생산균인 Penicillium 속 곰팡이 1×105/ml의 포자를 사용하였 다. 다양한 단백질 가수분해효소를 첨가 시 항진균 활성은 뚜렷한 저해 효과 상실을 보이지는 않 았으나 proteinase K 처리 시 효소 처리를 하지 않은 control 시료와 비교했을 때 감소됨을 확인하였 다. 하지만 저해 효과가 완전히는 상실되지 않은 점으로 볼 때 항진균물질은 단백질로만 구성된 것 은 아니고 다른 화합물들의 관여도 있으리라 추정된다. 그림 15는 단백질 가수분해효소 처리 후의 저해능 변화를 알아본 사진이다.
그림 14 Stability of the concentrated supernatant (40µg) from MJ 1-4 against proteolytic enzyme treatment. Penicillium spp.
producing OTA was used as an indicator, 1. control (no enzyme treatment), 2. concentrated supernatant treated with proteinase K, 3.
treated with protease, 4. treated with trypsin, 5. treated with pepsin.
B. subtilis가 생산하는 항진균 활성 물질들은 대부분 polypeptides로서 열에 매우 안정하며, 구조 내에 자연계에 존재하지 않는 D형 아미노산을 가지거나 cyclic peptide의 구조를 가지므로 단백질 가수분해효소에도 영향을 받지 않는 것으로 알려져 있다[11, 12, 13]. Bacillus amyloliquef aciens 또한 같은 Bacillus 속으로서 이들이 생산하는 항진균물질도 이와 유사한 특징을 나타낼 것으로 생각 된다. 이들의 자세한 특성이나 종류 및 비율 등은 앞으로 연구가 되어야만 한다. 이와 더불어 열 처 리 및 pH 등에 대한 영향에 대해서도 연구할 예정이다.
3.8 MJ 1-4의 항진균물질의 부분 정제 및 활성 확인
Bacteriocin-like substances의 gel chromatography
MJ 1-4의 항진균물질의 정제를 위해 상등액을 80% ammonium sulfate 침전시켜 생성된 Bacteriocin- like substances로 gel chromatography(gel filtration)를 실시하였다. 100mM Tris-HCl(pH 8.0) buffer를 사용하였고, SephadexⓇ-G75(Pharmacia Fine Chemicals, 1.5×45cm)를 사용하였다. 1ml씩 각 60개의 fraction을 얻었다.
- 흡광도 측정
gel chromatography(gel filtration)를 실시하여 얻어진 각 fraction의 100μl와 100mM Tris-HCl(pH 8.0) 의 600μl를 섞어 OD 280nm에서 흡광도를 측정하였고 그 결과를 그림 15에 나타내었다.
그래프에서 두 개의 특정적인 peak를 보였다. 처음 보였던 peak의 경우 분리가 일어난 것으로 여겨지나 두 번째 피크의 경우 뚜렷한 peak라고는 여겨지지 않는다. 다만 앞쪽 peak의 경우 gel chromatography(gel filtration)의 특성상 큰 분자 크기의 물질로 여겨지고 뒤쪽의 peak 물질의 경우 작은 분자 크기의 물질로 여겨진다. 비교적 큰 분자의 물질은 잘 분리가 되는 것으로 여겨지고 작은 분자의 물질은 잘 분리가 되지 않는 것으로 여겨진다.
- 활성 확인
gel chromatography(gel filtration)를 실시하여 얻어진 각 fraction의 활성을 확인하였다. 활성 확인은 1×105/ml의 Ochratoxin 생산균인 Penicillium 속 곰팡이를 감수성 곰팡이로 사용하였고 paper disk method로 실시하였다. Gel chromatography(gel filtration)하여 얻어진 각 fraction의 100μl로 활성을 측정하였다. 60개의 각 fraction 중 66, 67 fraction에서 약하지만 저해 효과를 보였다. 그림 16이 이 저 해 효과 실험 결과이다.
이렇게 저해 효과를 보였던 66, 67 fraction을 모아 동결 건조 후 20μg의 농도로 다시 활성을 확인 하였다. 좀 더 뚜렷한 저해 효과를 관찰할 수 있었다. 그림 17이 실험 결과이다.
Absorbance (280nm)
Fractionnumber 0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
-0.10
1 7 13 19 25 31 37 43 49 55 61 67 73 79 85 91 97
그림 15 Purification of the bacteriocin-like substances by size exclusion chromatography using Sephadex G-75 matrix.
그림 16 Antibacterial activities of purified bacteriocin- like substances Penicillium spp. producing OTA were used as indicators. 1. 67 fraction, 2. 66 fraction, 3. 69 fraction, 4. 68 fraction.
그림 17 Antibacterial activities of Lyophilized 66, 67 fraction Penicillium spp. producing OTA were used as indicators.
4. 요 약
메주와 청국장에서 항균력을 지닌 Bacillus 균주들을 분리하였다. 이들은 recA gene sequencing과 RAPD-PCR 방법에 의해 Bacillus amyloliquef aciens 균주들로 동정되었다. 이들 중 MJ 1-4와 CH 51 의 배양 상등액의 80% ammonium sulfate 침전과 산 침전물에서 강력한 저해 효과를 보였다. 80%
ammonium sulfate 침전의 경우 MJ 1-4가 강력한 항진균력을 나타냈다. 하지만 세균에 대한 저해력 을 보이지 않았다. 산 침전의 경우 CH 51이 세균 및 곰팡이에 대한 저해 효과를 보였다. 결론적으로 CH 51의 경우 여러 다양한 세균에 대한 저해 효과가 크고, MJ 1-4의 경우 다양한 곰팡이에 대한 저 해 효과가 큰 것으로 나타났다. 이를 바탕으로 곰팡이에 대한 강력한 저해 효과를 보였던 MJ 1-4로 실험을 진행하였다. MJ 1-4의 80% ammonium sulfate 침전에 의해 생성된 bacteriocin-like substance 는 7가지 곰팡이균들 중 OTA를 생산하는 Penicillium 속 곰팡이에 강력한 저해 효과를 보였고 산 침전에 의해 생성된 bio-surfactants의 경우 Aspergillus niger에 대해 강력한 저해 효과를 보였다. 이들 저해물질들은 곰팡이들에 의한 식중독 사고를 줄이는 데 기여할 수 있을 것으로 여겨진다. MJ 1-4 가 생산하는 항진균물질, bacteriocin-like substance에 대해서 단백질 가수분해효소들로 처리할 경우 항진균 활성은 뚜렷한 저해 효과 상실을 보이지는 않았으나 proteinase K 처리 시 control과 비교했 을 때 저해 효과가 감소됨을 확인하였다. 하지만 저해 효과가 완전히 상실되지는 않은 점으로 볼 때 항진균물질은 단백질로만 구성된 것은 아니고 다른 화합물들의 관여도 있으리라 추정된다. MJ 1-4가 생산하는 항진균물질의 부분 정제를 위하여 배양상등액을 80% ammonium sulfate로 침전시 켜 bacteriocin-like substance로 gel chromatography를 이용해 얻은 분획에서 항진균 활성을 지닌 분획 을 얻었다. 이 항진균물질의 분자량은 Tricine-SDS-PAGE 및 direct detection의 방법으로 실험이 진행 중이다. Bio-surfactant 역시 정제가 시도 중이다. Bacillus amyloliquef aciens MJ 1-4는 항진균 활성을 갖는 bacteriocin-like substances 생산 이외에도 산 침전에 의해 얻은 bio-surfactant 역시 항진균 활성 을 보였다. Bio-surfactant는 미생물이 생성하는 표면장력조절물질로 화학적 계면활성제와 비슷한 작용을 한다. 생물분자로 친수기와 소수기를 지니고 있는 것으로 알려져 더 친환경적이다. 이와 같 은 물질들은 천연식품 보존제 및 사료 보존제뿐만 아니라 항생제 대체 의약품으로도 활용이 기대 되며, 이를 위하여 향후 이 물질들의 보다 정확한 구조 및 특성을 규명하기 위한 연구가 필요하다.
참고문헌
1. Kwon, G. H., H. A. Lee, J. Y. Park, J. S. Kim, J. Lim, C. S. Park, D. Y. Kwon, Y. S. Kim, and J. H. Kim. 2009.
Development of a RAPD-PCR method for identification of Bacillus species isolated from Cheonggukjang. Int. J.
Food Microbiol. 129: 282-287.
2. Voskuil, M. I. and G. H. Chambliss. 1993. Rapid isolation and sequencing of purified plasmid DNA from Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 59: 1138-1142.
3. Astrup, T. and S. Mullertz. 1952. The fibrin method for estimating fibrinolytic activity. Arch. Biochem. Biophys.
40: 346-351.
4. Martinez, M. A., O. D. Delgado, J. D. Breccia, M. D. Baigori, and F. Sineriz. 2002. Revision of the taxonomic position of the xylanolytic Bacillus sp. MIR32 reidentified as Bacillus halodurans and plasmid-mediated transformation of B. halodurans. Extremophiles 6: 391-395.
5. Bradford, M. M. 1976. Rapid and sensitive methods for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.
6. Maeng, K.-H., J.-S. Kim, G.-E. Ji, and J.-H. Kim. 1997. Isolation of bacteriocin-producing lactic acid bacteria from human intestines and the characteristics of their bacteriocins. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 26: 1228-1236.
7. 박석민, 김현수, 유대식. 2006. 잿빛 곰팡이병원균 Botrytis cinerea에 대한 Bacillus sp. KMU-1011의 항진균활 성. Kor. J. MIcrobiaol. Biotechnol. 1: 63-69.
8. Mukherjee S., P. Das, C. Sivapathasekaran, and R. Sen. 2009. Antimicrobial biosurfactants from marine Bacillus circulans: extracellular synthesis and purification, Lett Appl Microbiol. 48: 281-288.
9. Kim, S. I., I. C. Kim, and H. C. Chang. 1999. Isolation and identification of antimicrobial agent producing microorganisms and sensitive strain from soil. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 28: 526-533.
10. Márcia P. Lisboa, Diego Bonatto, Delmar Bizani, João A. P. Henriques, Adriano Brandelli. 2006. Characterization of a bacteriocin-like substance produced by Bacillus amyloliquef aciens isolated from the Brazilian Atlantic forest. Int. Microbiol. 9: 111-118.
11. Katz, E. and A. L. Demain. 1977. The peptide antibiotics of Bacillus: chemistry, biogenesis, and possible function.
Bacteriol. Rev. 41: 449-474.
12. Lebbadi, M., A. Gálvez, M. Maqueda, M. Martínez-Bueno, and E. Valdivia. 1994. Fungicin M4: a narrow spectrum peptide antibiotic from Bacillus licheniformis M-4. J. Appl. Bacteriol. 77: 49-53.
13. Stein, T. 2005. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions. Mol. Microbiol. 56: 845- 857.
