대한소화기학회지 2000;36:214 - 223
만성 B형 간질환에서 Hepatitis B Virus Enhancer II 영역의 변이
- B a s ic C or e P r om ot e r 및 P r e cor e 변이와의 상관관계 -
순천향대학교 의과대학 내과학교실・소화기연구소
김연수・이진우・김영석・문종호・조영덕・이문성・심찬섭
Mu tations o f He pa titis B Virus Enha nce r II in Chron ic He patitis B Viru s In fe ction
- Co m p a r is o n w it h B a s i c Co re P ro m o t e r a n d P re c o r e Mu t a t i o n -Yu n Soo Kim , M.D., J i n Woo Le e , M.D., You n g Se ok Ki m , M.D., J on g Ho Moon , M.D., Young De ok Cho, M.D., Mo o n S u n g Le e , M.D. a n d Ch a n S u p S h i m , M.D.
Institute for Digestive Research, Soon Chun Hyang University College of Medicine, Seoul, Korea
Background/Aims: Transcriptional activity of the basic core promoter (BCP) in hepatitis B virus (HBV)
is influenced by several regulatory sequences including enhancer II (EN II), and mutation in the EN II (T1653) was reported to be frequent in fulminant hepatitis B. This study was carried out to identify the frequency of mutations in the EN II, BCP and preC regions according to activity of liver disease and HBeAg status in chronic HBV infection. Methods: Forty-two chronic HBV carriers were included in this study. We assigned ten HBeAg-positive asymptomatic HBV carriers to group I, eighteen HBeAg-positive patients with chronic liver disease to group II, and fourteen HBeAg- negative patients with chronic liver disease to group III. The mutations in EN II, BCP and preC regions were analysed from serum DNA by the PCR and direct sequencing method. Results: In group I, there was no mutation in EN Ⅱ (T1653) or PreC (A1896), but mutations in BCP (T762 and A1764) were observed in one case (10%). In group II, 8 (44%) cases had mutation in EN Ⅱ (T1653), 17 (94%) cases had mutations in BCP (T1762 and A1764), and 4 (22%) cases had mutation in PreC (A1896). In group III, 9 (64%) cases had mutation in EN Ⅱ (T1653), 12 (86%) cases had mutations in BCP (T1762 and A1764), and 11 (79%) had mutation of PreC (A1896) (p<0.05). Most of the patients who showed mutation of EN Ⅱ (T1653) in group II had liver cirrhosis. Conclusions: In view of the HBeAg status, mutation in EN Ⅱ as well as mutations in BCP might decrease the transcription of preC mRNA. Additionally, it seems that mutations in EN Ⅱ and PreC follow mutations in BCP as HBeAg-suppressive mutations during the course of chronic HBV infection. (Kor J Gastroenterol 2000;36:214 - 223)Key Words: Hepatitis B virus, Mutation, Enhancer II, Core promoter, Precore, HBeAg
접수: 2000년 4월 12일, 승인: 2000년 7월 5일
연락처: 김연수, 140-743, 서울시 용산구 한남동 657번지, 순천향대학교 의과대학 부속병원 내과 소화기연구소 Tel: (02) 709-9863, Fax: (02) 749-1968, E-mail: schkys@hosp.sch.ac.kr
※ 본 논문의 요지는 1999년 제38차 대한소화기학회 추계학술대회 및 2000년 Digestive Disease Week (San Diego, U.S.A.) 에서 발표되었음.
김연수 외 6인. 만성 B형 간질환에서 Hepatitis B Virus Enhancer II 영역의 변이 215
서 론
만성 B형 간질환의 자연 경과 중 basic core pro- moter (BCP)나 precore (preC) 변이의 출현은 모두 HBeAg의 음전에 기여하며 HBeAg 음성인 B형 간 염 바이러스(hepatitis B virus, 이하 HBV) 만성 보유 자에서는 두 영역의 변이가 흔히 관찰된다.1-3 이중 BCP 변이형은 preC mRNA의 전사를 억제하여 HBeAg의 생성을 저해시키리라 생각되며, preC 변 이형은 preC 영역에 stop codon을 형성하여 HBeAg 의 합성을 차단하므로 HBeAg을 소실시키는 기전에 는 서로 차이가 있다.
한편 BCP의 기능에 영향을 미칠 수 있는 조절유 전자 부위(regulatory sequence)로 enhancer I, Ⅱ 그 리고 NRE (negative regulatory element) 등을 들 수 있으며4-8 이중 enhancer Ⅱ (EN Ⅱ)는 HBV의 core, S 그리고 X promoter를 활성화시킨다고 보고되고 있다.4-6,8 EN Ⅱ는 BCP의 상류(upstream)에 존재(nt 1636-1741)하며 내부에는 hepatocyte nuclear factor 4 (HNF-4)와 C/EBP (CCAAT/enhancer binding pro- tein) 등이 결합되는 α box (nt 1646-1668)와 β box (nt 1704-1715)가 존재한다. 따라서 α box 내의 변 이는 상기 전사인자(transcription factor)의 결합에 영 향을 미칠 수 있어 결과적으로 EN Ⅱ의 변이가 BCP 의 활성도 변화를 초래할 수 있으리라 추측된다.
최근 HBV 감염으로 인한 전격성 간염 환자에서 α box 내에 위치한 nt 1653 cytosine이 thymine으로 치환되는 변이가 흔하였다고 보고9,10된 바 있으며, HBeAg 음성인 간경변증11 혹은 원발성 간암 환자12 에서도 이 변이가 빈번하다고 보고되고 있어 이 변
이가 바이러스 증식에 관계되거나 HBeAg의 표현에 영향을 미칠 가능성이 시사된다.
저자들은 만성 B형 간질환에서 HBeAg 양성 여 부나 간질환의 진행에 따른 EN Ⅱ의 변이 양상을 확인하고 이 부위의 변이가 BCP (T1762, A1764)나 preC (A1896) 영역의 변이와 상관관계가 있는지 비 교 분석하고자 하였다.
대상 및 방법
1. 대 상
총 42예의 만성 HBV 보유자를 대상으로 하였다.
이중 10예는 HBeAg 양성인 무증상 보유자였으며 18예는 HBeAg 양성인 만성 간질환 환자였다. 나머 지 14예는 HBeAg 음성인 만성 간질환 환자였다. 무 증상 보유자는 최근까지 간기능 검사상 혈청 ALT (alanine aminotransferase)치가 상승되지 않았던 예 들이었다. HBeAg 양성인 만성 간질환 환자 18예 중 11예는 만성 간염 환자였으며 나머지 7예는 간경변 증 환자이었다. 반면 HBeAg 음성자에서는 14예 중 9예는 간경변증 환자였고 나머지 5예는 만성 간염 으로 HBeAg 양성자에 비해 간경변증 환자의 비율 이 높았다(Table 1). 만성 간질환의 진단은 간생검과 임상소견에 의하였다.
2. 방 법
1) H B V DN A의 추출 및 중합효소연쇄반응 (poly m er a s e c ha in r ea ct ion ; P CR) 환자의 혈청 100 μL와 SDS (sodium dodecyl sul- fate) buffer 500 μL (0.5% SDS, 10 mg/ml pro- teinase K, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA
Table 1. Characteristics of the Patients
Groups No. Sex (M/F) Age (yr) ALT (IU/L) CH/LC ASCs, HBeAg (+)
CLD, HBeAg (+) CLD, HBeAg (-)
10 18 14
8/2 11/7 12/2
25±6 37±15 46±9
19±7 179±142 132±145
- 11/7
5/9 ALT, alanine aminotransferase; CH/LC, chronic hepatitis/liver cirrhosis; ASCs, asymptomatic HBV carriers;
CLD, chronic liver disease.
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pH 8.0, 150 mM NaCl)를 56℃에서 2시간 반응시킨 후 동일 부피의 phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) 처리하여 상층액을 취하고 isopropanol을 이용하여 DNA를 침전시켰다.
HBV DNA의 EN Ⅱ, BCP 그리고 preC 영역을 증폭하기 위하여 시발체(primer)는 ENⅡUP 5′- TTCTCATCTGCCGGACCGTG-3′(sense; nt. 1560- 1579)와 DNI 5′-AAAGAATTCAGAAGGCAAAAA- AGA-3′(antisense; nt. 1949-1972)를 사용하고 추출 된 DNA에 primer set(각각 10 pmol), 2.0 mM MgCl2, 250 μM dNTP 그리고 Taq polymerase (Ex Taq, 2.5 U, TaKaRa, Japan)를 첨가하였다. PCR은 thermal cycler (TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP3000, Japan)에서 94℃에서 3분간 pre-denaturation 한 후 94℃에서 1분, 56℃ 1분 그리고 72℃ 1분간 40회 반응시키고 72℃에서 10분간 연장시켰다.
PCR 산물은 QIAX ⅡTMGel Extraction Kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 elution하였다.
2) DN A s eque n c in g
Elution한 PCR 산물은 dideoxy-chain termination 방법으로 TopTMDNA sequencing kit (Bioneer, Korea) 를 이용하여 sequencing 반응을 실시하였고 Silver Staining SystemTM (Bioneer, Korea)을 이용하여 염 기서열을 확인하였다. 시발체는 중합효소연쇄반응 에 이용하였던 ENIIUP과 DNI을 이용하였다.
Sequencing 반응은 thermal cycler를 이용하여 9 5℃에서 3분간 pre-denaturation 시킨 후 95℃에서 45초, 56℃로 30초 그리고 72℃에서 60초간 45회 반 응시키고 72℃에서 10분간 반응을 연장한 후 5%
polyacrylamide sequencing gel에서 전기영동하였다.
염기서열은 Kim 등13이 보고한 HBV adr의 서열과 비교 분석하였다. 양군간의 변이 빈도는 Student' s t-test를 이용하여 비교하였다.
결 과
1. H B eA g 양성인 무증상 H B V 보유자에서 E N Ⅱ, B CP , 그리고 pr e C 부위의 변이 nt 1727 guanine 등 EN Ⅱ 부위에 다양한 유형의 염기서열이 관찰되었으나 nt 1653 cytosine의 thy- mine으로의 변이는 1예에서도 관찰되지 않았다. 또 한 preC 영역의 nt 1896 guanine이 adenine으로 치환 된 변이도 전 예에서 관찰되지 않았다.
반면 BCP 영역에서는 nt 1762 adenine이 thymine으 로 치환과 nt 1764 guanine이 adenine으로 치환된 변이 가 10예 중 1예에서 관찰되었다(Table 2, Fig. 1, 4).
2. H B eA g 양성인 만성 간질환 환자에서의 변이 양상
HBeAg 양성인 만성 간질환 환자 18예 중 8예 (44%)에서 T1653 변이가 관찰되었다. 질환별로 빈 도 차이를 비교하였을 때 만성 간염 환자에서는 11 예 중 3예(27%)에서 나타난 반면 간경변증에서는 7 예 중 5예(71%)에서 나타나 간경변증 환자에서 이 변이가 고빈도로 관찰되었다. nt 1762와 1764의 변 이는 1예를 제외한 모든 환자(94%)에서 존재하였다.
T1653 변이가 관찰된 8예 모두에서 T1762와 A1764 변이가 존재하였다. A1896 변이는 18예 중 4예(22%) 에서 관찰되었는데 이중 2예는 만성 간염이었고 나 머지 2예는 간경변증이었다(Table 2, Fig. 2, 4).
Table 2. Frequency of EN Ⅱ, BCP and preC Mutations in the Patients
GRoups EN Ⅱ (T1653) BCP (T1764) preC (A1896) ASCs, HBeAg (+) (n=10)
CLD, HBeAg (+) (n=18) CLD, HBeAg (-) (n=14)
0 8 (44%) 9 (64%)
1 (10%) 17 (94%) 12 (86%)
0 4 (22%) 11 (79%) EN Ⅱ, enhancer Ⅱ; BCP, basic core promoter; preC, precore; ASCs, asyptomatic HBV carriers; CLD, chronic liver disease
Kim, et al. Mutations of Hepatitis B Virus Enhancer II in Chronic Hepatitis B Virus Infection 217
3. H B eA g 음성인 만성 간질환 환자에서의 변이 양상
HBeAg 음성인 만성 HBV 보유자에서는 14예 중
9예(64%)에서 T1653 변이가 관찰되었다. nt 1762와 1764의 변이는 14예 중 12예(86%)에서 확인되었고 A1896 변이는 11예(79%)에서 관찰되어 세 영역 모 두에서 고빈도의 변이를 보였다(Table 2, Fig. 3, 4).
Fig. 2. EN Ⅱ sequences from the HBeAg-positive patients with chronic liver disease. T1653 mutation was frequent, especially in the patients with LC. T1762 and A1764 mutation were most frequent. Bold letter indicates the nucleotide which is different from the prototype (13). -//-; skipped sequence which is same with the prototype. BCP (nt. 1762 and 1764) and preC (nt 1896) sequences are also shown. CH, chronic hepatitis; LC, liver cirrhosis.
Fig. 1. EN Ⅱ sequences from HBeAg-positive asymptomatic HBV carriers. T1653 or A1896 mutation was not found in any of the subjects. On the other hand, T1762 and A1764 mutations were found in one case.
Bold letter indicates the nucleotide which is different from the prototype (13). -//-; skipped sequence which is same with the prototype. BCP (nt. 1762 and 1764) and preC (nt 1896) sequences are also shown.
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질환별로는 만성 간염 5예 중 3예(60%), 그리고 간 경변증 9예 중 6예(67%)에서 T1653 변이형이 검출 되었다. T1653 변이가 관찰된 9예 중 8예에서 T1762와 A1764 변이가 존재하였으며 nt 1762와 1764가 야생형이었던 1예는 nt 1653에 변이형과 야
생형이 공존하였다. A1896 변이형은 만성 간염 전 예 (5예)와 간경변증 9예 중 6예(67%)에서 관찰되었다.
HBeAg 음성자에서 EN Ⅱ, BCP 그리고 preC 세 영역의 변이 양상을 비교하였을 때 세 영역 모두 변 이가 있었던 환자가 14예 중 6예(43%)로 가장 흔하 였으며, EN Ⅱ의 변이 없이 BCP와 preC의 변이가 존재하였던 환자도 3예(21%) 관찰되었다. 또한 preC 의 변이 없이(G1896) EN Ⅱ와 BCP의 변이가 있었 던 경우가 2예(14%), 그리고 BCP 영역의 변이만 있 었던 경우도 1예(7%)에서 나타나 precore stop codon이 없는 예에서는 모두 BCP나 EN Ⅱ의 변이 가 존재함을 알 수 있었다. BCP 영역만 야생형이었 던 환자와 EN Ⅱ나 BCP 변이없이 PreC 변이만 있 었던 환자도 각각 1예씩 확인되었다(Table 3).
만성 간질환 환자 중 HBeAg 음성자에서는 양성 자에 비하여 T1653의 검출 빈도가 높은 경향이었으 나 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 그 러나 A1896의 빈도는 HBeAg 음성자에서 양성자에 비하여 유의하게 높았다(p<0.05)(Fig. 4).
만성 간질환 환자에서 EN Ⅱ나 preC 영역의 변 이 여부에 따른 연령 차이를 비교하여 보았을 때, EN Ⅱ나 preC 영역에 변이가 있었던 환자의 연령은 Fig. 3. EN Ⅱ sequences from the HBeAg-negative patients with chronic liver disease. Mutations in all the three regions (EN Ⅱ, BCP and preC) were frequent. Bold letter indicates the nucleotide which is different from the prototype (13). -//-; skipped sequence which is same with the prototype. BCP (nt. 1762 and 1764) and preC (nt 1896) sequences are also shown. CH, chronic hepatitis; LC, liver cirrhosis.
Fig. 4. Frequency of EN Ⅱ, BCP and preC mutations in the patients. BCP mutation was frequent in the patients with CLD regardless of HBeAg positivity. On the other hand, EN Ⅱ and preC mutations were more frequent in HBeAg-negative patients. ASCs, asymptomatic HBV car- riers; CLD, patients with chronic liver disease.
김연수 외 6인. 만성 B형 간질환에서 Hepatitis B Virus Enhancer II 영역의 변이 219
43±11세로 BCP 변이만 있었던 환자의 연령 34±
16세 보다 많은 경향을 보였다(p>0.05).
4. 추적검사상 HBeAg이 자연소실되었던 2예 에서 HBeAg 양성 시기와 음성 시기의 변이 양상
HBeAg 양성인 만성 간염 환자 2예에서 HBeAg 이 양성이었던 시기와 음전된 후의 EN Ⅱ, BCP 그 리고 preC의 염기서열을 비교하였다. 한 예에서는 HBeAg이 양성이었던 시기의 C1653, G1896, G1899 가 음전이 일어난 4년 후 각각 T1653, A1896, A1899로 전환되었다(HBeAg 양성기에 nt 1896 변이 형과 야생형이 공존)(Fig. 5). T1762와 A1764 변이 는 HBeAg 양성 시기에 이미 존재하였으며 4년 후 혈청에서도 변화가 없었다. 또 다른 한 예도 HBeAg 음전 후 A1899 변이만 동반되지 않았을 뿐 동일한 변이가 관찰되었다.
고 찰
HBeAg 음성인 만성 HBV 보유자에서는 A1896 변이형이 흔히 검출되며 HBeAg이 anti-HBe로 혈청 전환(seroconversion)되는 시기에 이 변이형이 출현 Fig. 5. Sequential changes of EN Ⅱ (nt 1653) (a) and preC (nt 1896 and 1899) (b) regions from HBeAg-positive to HBeAg-negative phase in a patient with chronic hepatitis. EN Ⅱ (T1653) and preC (A1896, A1899) mutations became dominant after seroconversion of HBeAg. A, adenine; C, cytosine; G, guanine; T, thymine; ALT, alanine aminotrans- ferase.
Table 3. Patterns of Mutations in the HBeAg- negative Patients with Chronic Liver Diseases
Patterns
No. (%) EN Ⅱ BCP preC
+ - + + - -
+ + + _ + _
+ + _ + _ +
6 (43) 3 (21) 2 (14) 1 ( 7) 1 ( 7) 1 ( 7)
Total 14
EN Ⅱ, enhancer Ⅱ; BCP, basic core promoter;
preC, precore; ASCs, asymptomatic HBV carriers;
CLD, chronic liver disease.
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하여 선택(selection)된다고 알려져 있다. 그러나 모 든 예에서 HBeAg이 소실되는 시기에 이 변이형이 나타나는 것은 아니다. 즉 일부의 환자에서 검출되 는 HBV의 preC 서열은 야생형과 동일한데 이러한 예들에서 HBeAg이 혈청전환되는 기전은 preC mRNA의 전사에 영향을 미치는 BCP의 변이에 기 인할 것으로 추측되고 있다. 이 변이가 일어나면 BCP에 더 이상 전사인자(transcription factor)가 결 합하지 못하여 preC mRNA의 전사나 HBeAg의 표 현이 야생형의 1/3로 감소하였고14 또한 preC 서열 이 야생형인 HBeAg 음성자에서 BCP 변이가 모두 존재하였다2는 보고는 이를 간접적으로 뒷받침한다 고 할 수 있다.
HBeAg의 소실에 관계되는 preC와 BCP의 변이 는 감염된 바이러스의 유전자형(genotype)과 밀접한 관계를 보인다고 보고되고 있다. 최초의 보고15는 nt 1858이 thymine인 유전자형에서는 nt 1896 guanine 의 adenine으로의 치환이 pregenomic encapsidation 서열의 stem-loop 구조를 안정시키므로 HBeAg 소 실시기에 A1896 변이형이 흔히 나타나는 반면, nt 1858이 cytosine인 유전자형 A에서는 A1896 변이가 stem-loop 구조를 불안정하게 하므로 이 변이가 일 어날 수 없으며 대신 BCP에 변이를 일으켜 HBeAg 소실을 유도한다고 주장하였다. 따라서 HBeAg을 소실시키는 바이러스의 전략이 HBV의 유전자형에 따라 차이가 있음이 시사된다. 본 연구에서는 HBeAg 음성자 중 일부에서는 preC 변이 없이 BCP 단독변 이(1예)나 EN Ⅱ와 BCP의 동시변이(2예)가 관찰되 었는데, HBV 유전자형을 분석하지는 않았으나 이 들에서 nt 1858은 모두 thymine으로 나타나 유전자 형 A는 아니었다(결과는 제시되어 있지 않음).
EN Ⅱ의 T1653 변이형은 HBeAg 음성인 간경변 증11 혹은 원발성 간암 환자12에서 빈번히 검출된다 고 보고되고 있다. 특히 원발성 간암 환자에서 변이 가 흔한 부위로는 nt 1762, 1764, 1896, 1613, 1653, 1753 그리고 core 유전자의 codon 130이었는데 T1653 변이형은 53%의 간암 환자에서 검출되었 다.12 이 보고에서는 HBeAg 양성 여부와 T1653 변 이형의 검출 여부를 비교 분석하지 않았으나 원발 성 간암 환자에서는 대부분 간경변증이 동반되고
HBeAg 음성자의 빈도가 높았을 것으로 예측되므로 본 연구 결과와 유사하다고 해석된다.
지역적으로 검출 빈도에 차이가 있기는 하나16,17 일반적으로 A1896 변이형은 전격성 간염 환자에서 흔히 검출된다.18-21 또한 전격성 간염이 HBeAg 음 성 보유자로부터 감염과 긴밀히 관련22-24되는 점은 HBeAg 음성 보유자와 전격성 간염 환자에서 검출 되는 HBV의 염기서열이 서로 유사하리라는 예측을 가능케 한다. HBV core 유전자의 변이도 이와 유사 하여 HBeAg 음성인 만성 간질환과 전격성 간염 환 자에서는 core 유전자 내에 missense 변이가 다발적 으로 나타나는 반면 HBeAg 양성인 만성 간질환과 비전격성 급성 간염 환자에서는 core 유전자 내의 변이가 심하지 않다고 보고되고 있다.21,25,26 본 연구 에서는 EN Ⅱ 영역에서도 이와 유사한 변이 양상을 확인할 수 있었다. 급성 간염 환자를 대상으로한 연 구9에 의하면 비전격성 간염 환자에서는 이 변이가 검출되지 않았던 반면 전격성 간염 환자에서는 빈 번히 관찰되었다고 하였다. 만성 간질환이 대상이었 던 본 연구에서는 T1653 변이가 HBeAg 음성자의 64%에서 관찰되어 EN Ⅱ 변이 역시 전격성 간염 환자와 HBeAg 음성인 만성 HBV 보유자에서 공통 적으로 흔히 나타남을 알 수 있었다. Hasegawa 등10 에 의하면 전격성 간염 환자로부터 검출된 A1896, T1762, A1764 그리고 T1653 변이형은 transfection 시 세포 내에 높은 core 항원 농도와 증식 중간물 (replicative intermediate)을 보여 이러한 강한 증식 력을 가지는 변이형이 전격성 간염의 병인에 관여 되리라 주장하였다. 물론 transfection 연구라는 점을 고려할 때 이 결과가 생체 내에서의 바이러스 증식 정도를 대변할 수는 없으리라 생각된다. 한편 면역 학적 측면에서 본다면 T1653, T1762 그리고 A1764 변이는 X 유전자의 codon 94, 130 그리고 131의 아 미노산 전환을 유발하므로 이로 인한 X 단백의 항 원성 변화로 간질환 활동도가 달라질 가능성도 추 측할 수 있다.
BCP 변이로 인하여 preC mRNA 전사가 감소14되 는 효과는 대부분의 예에서 HBeAg을 음전시키기에 충분치 않은 듯하다. HBeAg 양성인 만성 간염 시기 의 보유자에서 BCP 변이가 대부분 존재1-3,11한다는
Kim, et al. Mutations of Hepatitis B Virus Enhancer II in Chronic Hepatitis B Virus Infection 221
점이 이러한 가능성을 시사한다. 따라서 HBeAg을 음전시키기 위하여 또 다른 영역의 변이 즉 preC와 EN Ⅱ의 변이가 추가적으로 발생하였을 가능성을 추측할 수 있다. 본 연구를 통하여 면역내성기(im- mune tolerance phase)의 무증상 보유자에서는 세 영 역 모두 변이가 드물었으며, HBeAg 양성인 만성 간 염 환자에서는 대부분 BCP 변이가 존재하였으나 preC와 EN Ⅱ의 변이 빈도는 HBeAg 음성자나 간 경변증 환자에 비하여 상대적으로 낮게 나타났다.
한편 HBeAg이 음전된 예들이나 HBeAg은 양성일 지라도 간경변증과 같은 진행성 간질환에서 세 영 역 모두 고빈도의 변이가 관찰되었다. HBeAg이 양 성인 만성 간염환자는 HBeAg이 소실된 환자나 간 경변증 환자에 비하여 상대적으로 이른 시점의 면 역제거기(immune clearance phase)에 있음을 고려한 다면 면역제거기에는 시간 경과에 따라 추가적으로 변이가 발생할 가능성이 시사된다. 흥미롭게도 EN
Ⅱ 변이가 관찰된 17예(HBeAg 음성 9예와 양성 8 예) 중 16예(94%)에서 BCP 변이가 존재하여 EN Ⅱ 변이는 BCP 영역에 변이가 발생한 후 추가적으로 일어나는 변이일 것으로 생각된다. 또한 추적검사상 HBeAg이 소실된 2예의 환자에서도 이와 같은 현상 이 관찰되었던 바 HBeAg이 양성이었던 만성 간염 시기에는 BCP 변이(T1762, A1764)만이 존재하였으 나 HBeAg이 소실된 후 EN Ⅱ (T1653)와 preC 변이 (A1896)가 추가적으로 발생하였다.
이는 감염기간이 길수록 변이 발생이 높을 가능 성을 시사하는데 본 연구에서도 만성 간질환 환자 중 EN Ⅱ나 preC 영역에 변이가 동반되었던 환자의 연령은 43±11세로 BCP 변이만 있었던 환자의 34
±16세보다 많은 경향을 보였다.
이상의 결과로 미루어 면역내성기에는 세 영역 모두 변이가 드물고, HBeAg 양성인 면역제거기에 는 BCP 변이가 대부분 존재하며 HBeAg이 소실된 많은 환자에서 EN Ⅱ와 preC 영역의 변이가 동반됨 을 알 수 있었다. 이는 HBeAg을 소실시키기 위해 여러 영역의 변이가 시간 경과에 따라 추가적으로 나타남을 시사하며 preC mRNA의 전사 억제효과가 BCP 변이(T1762, A1764) 뿐만 아니라 EN Ⅱ 변이 (T1653)에도 기인될 가능성을 시사한다.
요 약
목적: 만성 B형 간질환의 자연경과 중 basic core promoter (BCP)나 precore (preC) 변이형의 출현은 모두 HBeAg의 음전에 기여한다. 한편 BCP의 기능 에 영향을 미칠 수 있는 조절유전자 부위에도 변이 가 나타날 가능성이 있으며 이중 enhancer Ⅱ (EN
Ⅱ)의 T1653 변이는 전격성 간염, 간경변증 그리고 원발성 간암 환자 등에서 빈번히 나타난다고 보고 된다. 본 연구에서는 만성 B형 간질환에서 간질환 의 활동도나 HBeAg 양성 여부에 따른 EN Ⅱ, BCP 그리고 preC 영역의 변이 양상을 비교 분석하고자 하였다. 대상 및 방법: HBeAg 양성인 무증상 HBV 보유자 10예(I군), HBeAg 양성인 만성 간질환 환자 18예(Ⅱ군) 그리고 HBeAg 음성인 만성 간질환 환자 14예(Ⅲ군)의 혈청에서 DNA를 추출하여 PCR-direct sequencing 방법으로 상기 유전자 부위의 염기서열 을 확인하였다. 결과: EN Ⅱ 영역에서는 nt 1653 cytosine이 thymine으로 치환된 변이가 가장 흔하였 다. 이 변이는 I군에서는 전 예에서 발견되지 않았 던 반면 Ⅱ군과 Ⅲ군에서는 각각 8예(44%), 9예 (64%)에서 발견되었다. T1653 변이형이 검출된 Ⅱ 군의 환자는 대부분 간경변증 환자이었다. BCP의 변이(T1762, A1764)는 I군에서는 1예(10%), Ⅱ군과
Ⅲ군에서는 각각 17예(94%), 12예(86%)에서 관찰되 었다. PreC 변이(A1896)는 I군에서는 전 예에서 발 견되지 않았고 Ⅱ군과 Ⅲ군에서는 4예(22%) 그리고 11예(79%)에서 관찰되었다. 결론: HBeAg이 음성인 만성 B형 간질환에서는 상기 세 영역 모두에서 변 이가 흔히 관찰되었던 반면, HBeAg 양성인 만성 간 질환에서는 BCP 변이는 빈번하였으나 EN Ⅱ나 preC 변이 빈도는 HBeAg 음성군에 비해 상대적으 로 낮게 관찰되었다. 이는 면역제거기에 BCP의 변 이가 EN Ⅱ나 preC 변이보다 선행됨을 시사하며, EN Ⅱ의 변이가 BCP 변이와 더불어 preC mRNA 전사에 영향을 미칠 가능성을 시사한다.
색인단어: B형 간염 바이러스, 변이, Enhancer Ⅱ, Core promoter, Precore, HBeAg
222 대한소화기학회지 : 제 36 권 제 2 호 2000
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