사랑과 열정으로 더불어 함께 하는 세상 만들기 - 율촌재단(栗村財團)

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(1)효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 임 지 영. 국민대학교 식품영양학과. 1. 서론 1.1. 연구목적 • 본 연구는 효소적 산화갈변반응을 이용하여 캬라멜 색소 대체 소재 생산을 위한 원천기술을 개 발하고 식품 모델 시스템을 이용하여 색소의 안정성 및 활용성을 분석함으로써 산업적 적용 가 능성을 평가하기 위한 기초 자료를 제시하고자 실시하였다.. 1.2. 연구배경 • 캬라멜 색소는 당류의 열분해에 의해 제조되는 색소이며 매출은 $100 million 정도 규모로서 전 세계 색소 시장의 약 11%를 차지하고 있다. 주로 위스키, 맥주, 주스, 콜라와 같은 음료에 서 70% 이상이 사용되고 있으며, 주로 분말 형태보다는 액상 형태로 소비되고 있다(Chappel & Howell, 1992; Downham & Collins, 2000).. • 캬라멜 색소 제조에 사용되는 당류로는 과당, 포도당, 전화당, 자당, 맥아당, 시럽 등이 있으며, 산성상태로 조정하기 위하여 황산, 초산, 인산, 구연산 등을 사용하고 알카리 첨가물로는 암모 니아, 나트륨, 칼륨, 수산화칼슘 등을 이용한다. 캬라멜 색소는 당의 중합반응에 의하여 담황색 에서 농황색까지 다양한 색을 보인다(Sengar & Sharma., 2012). 효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 185.

(2) • 캬라멜 색소가 상업적으로 제조되어 판매되는 형태는 총 네 가지로서 Table 1에 나타낸 바와 같이 알카리와 산을 첨가하여 제조된 caramel color I, 아황산염을 함유한 화합물을 첨가하여 제조된 caramel color Ⅱ, 암모늄 화합물로 제조된 caramel color Ⅲ, 암모늄과 아황산염 화 합물로 제조된 caramel color Ⅳ로 분류된다(Sepe et al., 2008).. • 다양한 식품에 널리 사용되는 캬라멜 색소의 안전성은 많은 논란의 대상이 되어왔다. 최근 미국 공익과학센터(Center for science in the public interest, 2011)에 따르면 콜라 등에 사용되는 캬라멜 색소에 포함된 2-methylimidazole(MEI)과 4-MEI과 같은 성분이 쥐를 실험동물로 사 용한 연구에서 폐, 간, 갑상선암이나 백혈병을 일으킬 수 있음을 보고하였으며, 암모니아를 포함 한 조건에서 제조되는 캬라멜 색소의 허가를 취소하여야 한다는 주장이 신중하게 제시되었다.. • 우리나라의 경우에도 소비자 시민 모임을 중심으로 캬라멜 색소의 위해성에 관한 우려가 매스미 디어에 보고된 바 있으며 캬라멜 색소에 대한 부정적 이미지 때문에 캬라멜 색소를 대체하고자 하는 시장 수요가 형성되고 있다.. Table 1. Specification of industrial caramel colors (Sengar & Sharma, 2012) Caramel. EU code. Characteristic. Class Ⅰ plain caramel, caustic caramel. E150a. Spirit caramel, made by control heat, alkali and acid. Class Ⅱ caustic sulfite process caramel. E150b. Alcohol and tannins stable caramel, used for martini. Class Ⅲ baker's caramel, confectioners' caramel, and beer caramel. E150c. Widely used caramel, such as confectionary and drink, beverage. Class Ⅳ beverage caramel sulfite ammonia process caramel. E150d. Used principally in soft-drinks. 186. 2013년 기초연구과제총서.

(3) • Laccases(p-diphenol:dioxygen oxidoreductases; EC 1.10.3.2)는 미생물과 식물에 널리 분 포하는 효소로서 산화 환원과정에서 독성을 가진 phenol들을 제거하는 특징을 가지고 있으며 다양한 기질에 대한 특이성을 가지고 있어서 제지 및 섬유산업에서 polyaromatic hydrocarbon과 같은 독성페놀화합물의 무독화 등의 목적으로 널리 활용되고 있다.. • 또한, 식품산업에서는 Table 2와 같이 페놀 물질을 제거하여 와인 안정성의 향상, 맥주의 이취 와 혼탁도 개선, 주스의 안정성, 펙틴의 겔화 그리고 식품 산업 폐기물 정화 등 다양한 용도로 사용되고 있다(Minussi et al., 2002; Osma et al., 2010).. • Laccases는 flavonoids와 페놀의 ortho-, para-diphenol을 산화시켜 라디칼을 형성하고 형성된 라디칼이 Fig. 1과 같이 ortho-, para-quinone과 중합되어 갈색에서 검은색을 나타내는 중합 체를 형성할 수 있다(Osma et al., 2010). 기질들은 Fig. 2와 같이 산화환원 효소에 의하여 중합되거나 다른 polyphenol들과 공유결합에 의해 결합되어 다양한 색이 형성될 수 있다.. • Kim et al. (2007)은 laccase의 기질이 되는 hydroquinone, catechol, dopamine, guaiacol, ferulic acid를 이용한 효소반응으로 진한 갈색, 회색, 무색 그리고 노란색을 생성하여 섬유 염 색에 활용하였다.. • Jeon et al. (2010)은 유사한 원리를 이용하여 머리 염색약의 제조 기술로서의 잠재성을 평가 하였다. 위의 연구 결과를 근거로 할 때 laccase의 효소적 산화 갈변 반응은 적절한 기질과 반 응조건의 선택 시 캬라멜 색소 대체 소재의 생산에 활용될 수 있다.. • 앞서 언급한 바와 같이 캬라멜 색소는 지속적인 안전성 여부에 대한 논란이 있으며 그 대체 소 재의 생산이 가능할 경우 그 파급 효과는 매우 크다. 현재까지 오징어 먹물을 이용하여 캬라멜 색소 대체 소재를 생산하고자 하는 시도가 있었으나 오징어 먹물은 특유의 풍미 때문에 산업적 적용이 불가능하였으며 그 밖에 캬라멜 색소 대체 소재의 생산 기술에 대한 연구는 보고된 바 없다.. • 본 연구는 laccase의 효소적 산화 갈변반응을 이용하여 캬라멜 색소 대체 소재의 생산 가능성을 평가하고자 실시되었다.. 효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 187.

(4) Table 2. Application of laccase in the food industry (Minussi et al., 2002) Main applications. Remarks. Enhance the wine stability. Phenolic compounds remover Cork stoppers. Enhance the beer stability. Haze-free agent Oxygen remover Off-flavour remover. Processing of fruit juice. Haze-free, improve juice stability, Increased customer susceptibility, Enhanced the color & flavour stability. Baking industry. Cross-link biopolymers Imporoving strength, stability, volume & stickiness, Reduced stickiness. Make a better sensory. Odor control Taste enhancement Decrease of undesired products. Pectin gelation. Gelling agents, Crosslinking agents of sugar, beet pectin. Food industry waste. Disposal of water-waste, bioremediation. 188. 2013년 기초연구과제총서.

(5) Fig. 1. Schematic presentation of laccase-catalyzed oxidation.. Fig. 2. Model of coloring reaction by laccases (Pourcel et al., 2007).. 효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 189.

(6) 2. 재료 및 방법 • 재료 및 시약 (+)-Catechin hydrate, resorcinol, hydroquinone, catechol, gallic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, vanillin, ferulic acid, syringic acid, rutin hydrate, quercetin은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하여 사용하였다. Laccase(E.C. 1. 10. 3. 2.)는 Aspergillusoryzae)로 부터 유래한 Denilite IIS (Novozymes, Bagasvaerd, Denmark)를 사용하였다. 캬라멜 색소는 시판 중인 액체 및 분말형(세우, 한국) 제품을 사용하였다.. • 카라멜 대체소재(효소적 산화반응물)의 제조 Laccase에 의한 산화갈변반응은 Kurisawa et al. (2003)의 방법을 일부 변형하여 Fig. 3과 같이 실시하였다. 단일 기질의 경우 기질 10 mM, 복합 기질은 각 기질 5 mM을 증류수에 용해 하여 사용하였다. 효소 반응에는 laccase를 0.05 unit/mM 기질 수준으로 첨가하였으며 30℃ 항 온수조에서 24시간 동안 150 rpm 으로 교반하며 반응을 진행하였다. 반응의 종료 후에는 효소를 불활성화 시키기 위하여 95℃에서 5분간 가열하였으며 5000 × g에서 15분간 원심분리(Supra 30K, Hanil Science industrial CO, Incheon, Korea) 하고 상징액을 회수하였으며 최종적으로 동결 건조하여 분말시료를 제조하였다.. Fig. 3. Preparation of caramel colorant alternative using laccase-catalyzed enzymatic oxidation.. 190. 2013년 기초연구과제총서.

(7) • Laccase의 활성변화 측정 Laccase의 활성은 Adelakuna et al. (2012)의 방법을 일부 변형하여 ABTS(2.2’-Azobic (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammooonium Salt) 산화에 의한 발색법으로 측정 하였다. 반응액은 5 mM의 ABTS를 pH 3.5, 4.0, 5.0으로 조정한 100 mM sodium acetate buffer에 용해시켜 준비하였으며 1 unit의 laccas를 첨가한 후 ABTS 산화에 의한 흡광도의 변화 는 420 nm(ε420 = 3.67 x 104M-1cm-1)에서 UV/VIS spectrophotometer를 이용하여 측정 하였다. 효소활성 1 unit은 1분동안 1 uM의 산화에 필요한 효소의 양으로 정의하였다.. • Color intensity (Darkness) Color intensity는 건조된 시료를 0.1%(w/v) 농도로 증류수에 용해한 후 1 cm의 cell을 이용하여 610 nm에서 흡광도를 측정하였으며 아래의 formula를 이용하여 산출하였다(Licht et aI, 1992). Color intensity = (Absorbance 610 nm × 100) / % solids. • Hue index (Redness) Hue index는 시료를 0.1% (w/v) 농도로 증류수에 용해한 후 1 cm의 cell을 이용하여 510과 610 nm에서 흡광도를 측정하고 아래의 formula를 이용하여 산출하였다. Hue index= 10log(Absorbance at 510 nm/ Absorbance at 610 nm). • 색도변화 (Tristimulus color attributes) 시료의 color attributes는 일정량의 시료를 petridish에 위치시킨 후 색차계(Chroma Meter Cr-400, Minolta, Tokyo, Japan)를 이용하여 L(명도), a(적색도), b(황색도) 값을 3회 이상 반 복 측정하여 평균값으로 나타냈다. 또한 각 pH, 및 알콜의 첨가전 후 관찰된 색의 변화는 △E (        ) 값의 변화로 표현하였다.. • 카라멜 대체소재(효소적 산화반응물)의 안정성 시료(0.1%, w/v)의 열안정성은 80℃의 항온수조에서 일정시간 동안 유지한 후 hue index(redness)와 color intensity(darkness)의 변화를 측정하여 표시하였다. 시료의 알코올 안정성은 50% ethanol에 용해시킨 시료를 0일, 3일, 7일, 14일, 28일동안 상온에서 저장한 후 측정하였으며 pH 안정성은 0.2 M citric acid와 0.2 M sodium phosphate를 이용하여 pH 2, 4, 7로 조정한 후 측정하였다.. 효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 191.

(8) 또한, pH와 열안정성의 조건을 조합하여 온도 및 pH 처리에 의한 안정성의 변화를 측정하였다. 모든 시료는 3회 이상 반복 측정하여 평균값을 표시하였다.. • 카라멜 대체소재를 이용한 약식과 흑설탕의 착색효과 비교 약식은 참쌀을 10시간 침지시킨 후 30분간 체에 받쳐 물기를 제거하고 Table 3의 성분을 넣고 배합한 후 1시간동안 증자하여 제조하였다. 제조한 약식의 색도 측정을 위하여 일정량의 약식에 압력을 가하여 측정용기에 균일하게 위치시킨 후 색차계를 이용하여 L, a, b 값을 측정하였다. 흑 설탕의 착색 효과는 시판중인 흑설탕의 색과 유사한 색을 얻기 위하여 필요한 캬라멜 색소와 대체 소재의 양으로 표현하였다. 흑설탕과 유사한 색상의 선정은 캬라멜 색소와 대체소재의 양을 변화 시키며 육안으로 관찰하여 판정하였으며 색상의 평가 전에는 미량(0.5 mL/ 25 g 백설탕)의 증류 수를 첨가하고 핸드믹서로 충분히 교반하여 색소가 골고루 혼합되도록 하였다.. Table 3. Fomula of Yaksik Ingredients (g). Sample. Caramel (liquid). Caramel (Powder). Rutin polymers. 192. Color sauce Low. 0.6. Mid. 0.9. High. 1.2. Low. 0.075. Mid. 0.112. High. 0.15. Low. 0.3. Mid. 0.45. High. 0.6. 2013년 기초연구과제총서. Glutinous rice. Sugar (white). Salt. Water. 100. 11.67. 0.33. 6.67.

(9) 3. 연구 결과 및 고찰 3.1. pH 조건에 의한 효소활성 변화 pH의 변화에 따른 laccase 효소 활성 변화를 측정과 결과는 Fig. 4와 같다. pH가 5로 증가함 에 따라 효소 활성은 유의적으로 감소하는 것으로 나타났으며 효소반응 3시간 이내에 초기 활성의 25% 수준으로 감소하였다. 따라서 산화반응 생성물 형성을 위한 초기 중합반응은 반응초기에 개 시되는 것으로 생각된다. 효소를 85℃에 유지시킨 경우에는 5분 이내에 활성을 소실하였으며 24 시간 정도의 반응을 시킨 경우에는 별도의 효소불활성화 기작이 필요하지 않을 것으로 생각된다.. 3.2. 효소반응 시간에 따른 색의 발현 변화 효소의 농도를 0.1 U/mM 기질로 고정하고 chlorogenic acid, rutin, gallic acid를 기질로 사 용하여 반응시간의 경과에 따른 효소의 색 발현을 측정한 결과는 Fig. 5와 같다. 효소 활성의 변화 측정 결과와 유사하게 색의 발현은 3시간 이내에 나타났으며 반응 시간을 6시간 이상으로 증가시 킨 경우에도 유의적인 색의 변화는 관찰되지 않았다. Jeon et al. (2010)은 laccase의 효소촉매 반응 시 12시간 이후에는 색의 변화가 일어나지 않았다고 하였으며 Cheng & Crisosto (1995)의 연구 결과에 따르면 산화중합반응은 반응초기에 개시되며 갈색화 반응과 기질의 함량과는 높은 양 의 상관성을 나타냈다. 갈색산화반응물의 생성에는 ortho-diphenol 구조가 중요한 영향을 미치기 때문에 ortho-diphenol 구조를 포함하는 chlorogenic acid, rutin, gallic acid 등은 빠르게 산화 되는 경향을 나타내며 rutin과 같이 많은 수의 ortho-diphenol의 수산기를 갖는 경우 가장 진한 갈색이 생성되었다(Guadagni et al., 1949; Vamos-Vigyazo & Nadudvari-Markus., 1983).. 3.3. 캬라멜 대체소재 개발을 위한 시료의 탐색 Fig. 6과 Table 3은 laccase 산화중합 반응에 의한 색 변화 양상을 colorimeter를 이용하여 측정 한 결과이다. 측정 결과는 붉은색 계열의 색과 노란색 계열의 색의 비를 나타내는 color parameter (a*/b*)로 나타냈다. 종합적으로 볼 때 orth-의 위치에 OH그룹을 가진 페놀화합물(gallic acid, chlorogenic acid, rutin)의 갈색강도는 para-의 위치에 OH 그룹을 함유한 화합물보다 유의적으로 높은 것으로 나타났다. 명도(L-value)의 경우 단일 기질을 반응시킨 경우보다 다양한 기질을 함께 효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 193.

(10) 반응시켜 복합기질을 활용하는 것이 유의적으로 명도가 감소하여 어두운 색상을 나타낼 수 있는 것 으로 나타났으며, 특히 rutin은 color parameter (a*/b*)의 값이 다른 시료들과 비교하여 현저히 높았다. 기질에 따른 명도 차이는 산화 효소의 기질에 따른 중합체 형성과 관련이 높다. 페놀 구조는 산화 효소에 의해 ortho-, para-diphenol구조의 OH가 산화되어 비공유 전자쌍(라디칼)이 형성되 며, 이렇게 형성된 비공유 전자쌍을 갖는 물질은 ortho-, para-quinone의 구조를 갖는 기질과 중 합되어 brown polymer를 형성한다(Osma et al., 2010; Pourcel1 et al., 2007; Kim et al., 2007).. 0.8. Laccase activity (U/mL). pH 3.5 pH 4.0 pH 5.0 0.6. 0.4. 0.2. 0.0 3. 6. 12. 24. Time (hr) 1.0 pH 3.0. Laccase activity (U/mL). 0.8. 0.6. 0.4. 0.2. 0.0 5. 10. Time (min). 194. 2013년 기초연구과제총서. 15. 20.

(11) Fig. 4. Effect of pH (top) and temperature (85℃, bottom) on laccase activity. 0.1 U/mM chlorogenic acid 0.1 U/mM rutin 0.1 U/mM gallic acid 8. Hue index. 6. 4. 2. 0 0. 3. 6. 12. 24. Time (hr). 0.1 U/mM chlorogenic acid 0.1 U/mM rutin 0.1 U/mM gallic acid. Corlor intensity. 0.16. 0.12. 0.08. 0.04. 0.00 0. 3. 6. 12. 24. Time (hr). Fig. 5. Changes in hue index (top) and color intensity (bottom) as a function of reaction time in laccase-catalyzed enzyme reaction.. 효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 195.

(12) 1. 2. 14. 3. 15. 4. 16. 5. 6. 17. 7. 18. 8. 19. 9. 10. 20. 11. 21. 12. 13. 22. 23. 1. Resorcinol 2. Hydroquinone 3. Catechol 4. Gallic acid 5. Chlorogenic acid 6. Caffeic acid 7. para-coumaric acid 8. Vanillin 9. Ferulic acid 10. Syringic acid 11. Rutin 12. Quercetin 13. Catechin 14. Catechol + gallic acid 15. Catechol + chlorogenic acid 16. Catechol + syringic acid 17. Catechol + rutin 18. Syringic acid + gallic acid 19. Syringic acid + chlorogenic acid 20. Syringic acid + rutin 21. Rutin + gallic acid 22. Rutin + chlorogenic acid 23. Gallic acid + chlorogenic acid. 30. Color parameter (a*/b*). 25. 20. 15. 10. 5. 0. -5 60. 50. 40. 30. Color parameter (L*). Fig. 6. Laccase catalyzed color formation of various phenolic compounds.. 196. 2013년 기초연구과제총서.

(13) Table 3. Color attributes of various phenolic compounds prepared by laccase catalyzed enzymatic oxidation.. Sample. L*. a*/b*. △E. 53.39. 0.23. 54.97. Light-yellow(+). 54. 0.05. 58.97. Yellow(+). Catechol. 43.65. 0.47. 45.29. Brown(+). Gallic acid. 37.43. 1.59. 38.74. Brown(++). Chlorogenic acid. 35.05. 4.18. 35.48. Brown-black(+++). Caffeic. 54.42. 0.06. 56.38. Light-yellow(+). p-coumaric acid. 59.37. 0.03. 59.45. None(-). Vanillin. 53.74. 0.12. 55.44. Light-yellow(+). 60. -0.09. 60.04. None(-). 41.86. 0.99. 45.42. Ogrange(++). Rutin. 34.48. 25.21. 34.66. Brown-black(+++). Quercetin. 57.51. -0.11. 58.10. Light-yellow(+). Catechin. 47.13. 0.13. 51.28. Yellow(+). Catechol + gallic acid. 36.63. 1.62. 37.36. Brown(++). Catechol + chlorogenic acid. 33.95. -2.29. 33.97. Brown-black(+++). Catechol + syringic acid. 40.89. 0.75. 42.96. Brown(++). Catechol + rutin (turbid). 42.8. 0.53. 44.35. Brown(+). Syringic acid + gallic acid. 36.04. 2.26. 36.82. Brown(+++). Syringic acid + chlorogenic acid. 36.78. 2.10. 38.13. Brown(++). Syringic acid + rutin. 35.71. 3.37. 36.85. Brown(++). Rutin + gallic acid (turbid). 39.41. 1.01. 41.21. Brown(++). Rutin + chlorogenic acid. 35.07. 4.37. 35.55. Brown-black(+++). Gallic acid + chlorogenic acid. 36.64. 2.09. 37.85. Brown(++). Resorcinol Hydroquinone. Ferulic Syringic. acid. acid acid. Color. (-): none, (+): very light red-brown, (++): light red-brown, (+++): strong red-brown. △E =        .. 효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 197.

(14) Whitaker & Lee (1995)는 산화환원 효소의 경우 phenol이 산소와 반응하여 ortho- hydroxylation 되고 (주로 ortho-position의 hydroxylation) 이후 산화되어 ortho-quinone 으로 전환되는데 이 과정에서 일어나는 coupling reaction에서 서로 중합되어 갈색이 형성된다고 하였다.. Rutin, chlorogenic acid 그리고 gallic acid의 E*값은 34.62, 35.48, 38.74로 다른 단일 기 질에 비해 큰 차이를 보였으며(E*=12 이상: 다른 계통의 색, E*=0.5-1.5: 근소한 차이) 전반적 으로 색이 육안으로 식별할 수 있을 정도의 진한 색을 나타냈다.. 한편, 복합적인 기질을 사용하는 경우 뚜렷한 상승효과가 관찰되지 않았다. 복합 기질에서 색의 발현이 유의적으로 증가하지 않은 이유는 기질에 따라 효소에 대한 친화성에 차이를 나타내므로 상대적으로 효소의 기질 친화성이 높은 기질이 먼저 산화되어 중합되는 동안 낮은 효소 친화성을 갖는 기질은 효소 반응이 감소되기 때문인 것으로 생각된다(Jeon et al., 2010). Fowler et al. (2011)에 의하면 효소적 산화 중합 반응의 결과 flavonoids는 주로 A ring의 7-OH, 8-C에 poly-flavonoid가 형성되며 B ring의 2’-, 5’-C에도 poly-flavonoid가 형성된다고 하였으며 효 소적 산화 갈변 반응은 flavonoid의 B-ring의 hydroxylation 위치 중 2’, 3’- 또는 3’, 4’-hydroxylation처럼 ortho- hydroxylation구조에서 반응이 용이하게 일어나는 반면에 A-, B-ring의 hydroxylation에서의 반응은 미미하였다.. Table 4는 캬라멜 색소와 유사한 색의 발현이 관찰되었던 기질을 선정하여 hue index, color intensity를 측정한 결과이다. 단일기질에서는 chlorogenic acid와 rutin의 color intensity 값이 높게 나타났다. Catechol과 chlorogenic acid는 모두 ortho-diphenol 구조를 포함하는 기질이며 이러한 기질은 효소와 기질의 친화성의 증가와 빠른 속도로 중합되어 가장 강한 색의 강도를 보인 것으로 생각된다(Guadagni et al., 1949; Cheng & Crisosto, 1995; Jeon et al., 2010; Vamos-Vigyazo & Nadudvari-Markus, 1983). 복합 기질의 rutin과 chlorogenic acid는 0.125 의 color intensity값과 5.7 의 hue index 값을 보였다. 이들의 color intensity 및 hue index는 caramel color Ⅲ의 중간 범위에 해당하였다(color intensity: 0.08-0.36, hue index: 5.1-5.5).. 따라서, 본 연구를 통하여 제조된 캬라멜 대체 소재는 색의 발현 측면에서 일부 면류, 스프 분 말, 과자, 맥주 등에 사용되고 있는 caramel color Ⅲ과 위스키나 고량주 같은 알코올 함량이 높 은 주류에 사용하는 caramel color Ⅰ(color intensity: 0.01-0.12)와(Licht et al., 1992; Sengar & Sharma, 2012)의 부분적 대체가 가능한 수준으로 판단된다.. 198. 2013년 기초연구과제총서.

(15) Chlorogenic acid는 과일, 차, 커피, 그리고 와인에 존재하며(Buren et al., 1973; Challis & Bartlett., 1975) phenolic acids는 식물이 주위 환경, 스트레스에 대한 방어 작용으로 합성된다. 페놀 기질의 함량이 높은 과일은 외부의 자극(세포벽의 파괴)으로 페놀 기질이 산화 환원 효소에 노출되게 되며 polyphenol oxidase, peroxidase와 같은 효소에 의하여 갈색의 산화물을 형성한 다(Mayer & Hare. 1979).. Table 4. Hue index and color intensity of selected substrates. NO.. Sample. Hue index. Color intensity. 3. Catechol. 3.3. 0.063. 4. Gallic acid. 5.1. 0.110. 5. Chlorogenic acid. 5.5. 0.129. 10. Syringic acid. 4.2. 0.101. 11. Rutin. 6.1. 0.144. 14. Catechol + gallic acid. 4.1. 0.162. 15. Catechol + chlorogenic acid. 4.3. 0.338. 16. Catechol + syringic acid. 3.2. 0.114. 17. Catechol + rutin (turbid). 1.9. 0.528. 18. Syringic acid + gallic acid. 5.1. 0.144. 19. Syringic acid + chlorogenic acid. 5.7. 0.099. 20. Syringic acid + rutin. 6.4. 0.101. 21. Rutin + gallic acid (turbid). 3.4. 0.331. 22. Rutin + chlorogenic acid. 5.7. 0.125. 23. Gallic acid + chlorogenic acid. 6.0. 0.125. 효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 199.

(16) 3.4. 캬라멜 대체소재의 안정성 캬라멜 대체소재의 탐색 연구에서 우수한 효과를 나타낸 chlorogenic acid와 rutin 및 두 가지 기질을 혼합하여 최종 기질의 농도가 되도록 제조한 시료를 사용하여 다양한 환경 조건에서 hue index와 color intensity의 변화를 측정한 결과는 Fig. 7, 8과 같다. 시료의 붉은 갈색 정도를 나 타내는 hue index는 카라멜 색소들과 rutin polymer로 제조한 캬라멜 대체소재가 모두 유사하게 pH 3에서 저장기간이 증가함에 따라 점차적으로 증가하는 경향을 보였으나 chlorogenic acid를 포함한 기질로 만든 캬라멜 대체소재에서는 점차적으로 감소하는 경향이 관찰되었다. 그 밖의 pH 에서는 저장기간이 경과함에 따라 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. 한편, color intensity의 경 우에는 측정한 모든 pH 범위에서 chlorogenic acid를 포함한 기질이 증가하는 경향을 보였다.. 저장기간에 일어나는 색의 전반적 변화 정도를 측정하기 위하여 △E 값으로 그래프를 표현한 결 과는 Fig. 9와 같다. 일반적으로 △E의 차이가 0-0.5이면 색차가 거의 없으며, 0.5-1.5는 근소한 차이, 1.5-3.0이면 감지할 수 있는 차이, 3.0-6.0이면 현저한 차이로 간주하므로 rutin을 단일 기질로 사용한 경우 약산성 및 산성 pH 저장조건에서 저장기간이 증가함에 따라 감지할 수 있는 차이가 나타나는 것으로 해석할 수 있으며 rutin과 chlorogenic acid를 혼합하여 캬라멜 대체소재 를 제조한 경우 pH 변화에 따른 저장 안정성이 증가하는 효과가 관찰되었다. 각 pH 조건에서 8 0℃에서 가열한 후 색의 변화를 관찰한 열 안정성의 평가에서는 chlorogenic acid가 가열 15분이 경과한 후 hue index와 color intensity에서 변화를 나타낸 것을 제외하고는 1시간동안 가열한 경 우에도 초기 색이 유지하는 안정적인 모습을 보였다(Fig. 10, Fig. 11). Friedman & Jürgens (2000)는 chlorogenic acid는 ortho-hydroxyl group을 가지고 있고 탄소와 탄소 사이의 이중결합 들이 benzene 고리와 연결되어 있어 pH, 열 그리고 저장기간에 상대적으로 안정하다고 보고하였다.. 캬라멜 색소의 알코올 안정성은 위스키나 고량주의 응용을 염두에 두고 50% ethanol 조건에서 4주간 실온에서 저장하며 알코올 안정성을 평가하였다. Hue index는 chlorogenic acid를 제외한 모든 시료에서 안정하게 유지되었으며 color intensity는 모든 시료에서 저장기간 동안 증가하는 경향이 나타났다. 시료를 알코올에 노출시킨 후 나타나는 색의 변화 정도를 △E로 표시한 경우 상업용 캬라멜 색소 2종과 rutin을 이용하여 제조한 캬라멜 대체소재의 △E 값의 변화가 저장 실 험기간 중 2이하로 유지되어 근소한 색의 차이가 나타난 반면 chlorogenic acid를 함유한 시료에 서는 보다 큰 색의 차이가 관찰되었다(Fig. 12). 이상의 결과를 근거로 할 때 rutin을 이용하여 제조한 캬라멜 대체소재의 알코올 안정성은 시판중인 캬라멜 색소와 유사한 수준으로 평가되었다.. 200. 2013년 기초연구과제총서.

(17) 7. pH 3. Hue index. 6. 5. 4 Caram el 1 Caram el 2 Rutin polym er Chlorogenic acid Rutin plym er + C hlorogenic acid 3 0. 5. 10. 15. 20. 25. T im e (day) 7. pH 5. Hue index. 6. 5. 4 C aram el 1 C aram el 2 R utin polym er C hlorogenic acid R utin plym er + C hlorogenic acid 3 0. 5. 10. 15. 20. 25. T im e (day) 7. pH 7. Hue index. 6. 5. 4 C aram el 1 C aram el 2 R utin polym er C hlorogenic acid R utin plym er + C hlorogenic acid 3 0. 5. 10. 15. 20. 25. T im e (day). Fig. 7. Changes in hue index of caramel colorant alternatives in various pH during the storage at 20°C.. 효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 201.

(18) 40. pH 3. Color intensity. 30. 20. 10 Caremel 1 Caramel 2 Rutin polymer Chlorogrnic acid Rutin polymer + Chlorogenic acid 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. T im e (day) 50. pH 5. Caremel 1 Caramel 2 Rutin polymer Chlorogrnic acid Rutin polymer + Chlorogenic acid. Color intensity. 40. 30. 20. 10 0. 5. 10. 15. 20. 25. T im e (day) 50. pH 7. Color intensity. 40. 30. 20 Caremel 1 Caramel 2 Rutin polymer Chlorogrnic acid Rutin polymer + Chlorogenic acid 10 0. 5. 10. 15. 20. 25. T im e (day). Fig. 8. Changes in color intensity of caramel colorant alternatives in various pH during the storage at 20°C.. 202. 2013년 기초연구과제총서.

(19) 4. pH 3. C aram el 1 C aram el 2 R u tin p o ly m e r C h lo r o g e n ic a c id R u tin p ly m e r + C h lo r o g e n ic a c id. △E. 2. 0. -2. -4 0. 5. 10. 15. 20. 25. T im e (d a y ) 4. pH 5. C a ram e l 1 C a ram e l 2 R u tin p o ly m e r C h lo r o g e n ic a c id R u tin p ly m e r + C h lo r o g e n ic a c id. △E. 2. 0. -2. -4 0. 5. 10. 15. 20. 25. T im e (d a y ) 4. pH 7. C aram e l 1 C aram e l 2 R u tin p o ly m e r C h lo r o g e n ic a c id R u tin p ly m e r + C h lo r o g e n ic a c id. △E. 2. 0. -2. -4 0. 5. 10. 15. 20. 25. T im e (d a y ). Fig. 9. Changes in △E of caramel colorant alternatives in various pH during the storage at 20°C. 효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 203.

(20) 7. pH 3. Hue index. 6. 5. 4 C aram el 1 C aram el 2 R utin polymer C hlorogenic acid R utin plym er + C hlorogenic acid 3 0. 15. 30. 45. 60. 75. T im e (m in). pH 5. Hue index. 6. 4. 2 C aram el 1 C aram el 2 R utin polym er C hlorogenic acid R utin plym er + C hlorogenic acid 0 0. 15. 30. 45. 60. 75. T im e (m in) 7. pH 7. Hue index. 6. 5. 4 C aramel 1 C aramel 2 R utin polym er C hlorogenic acid R utin plym er + C hlorogenic acid 3 0. 15. 30. 45. 60. 75. T im e (m in). Fig. 10. Changes in hue index of caramel colorant alternatives by heating at various pHs.. 204. 2013년 기초연구과제총서.

(21) 70. 60. pH 3. C aremel 1 C aramel 2 R utin polymer C hlorogrnic acid R utin polymer + Chlorogenic acid. Color intensity. 50. 40. 30. 20. 10. 0 0. 15. 30. 45. 60. 75. T im e (m in) 70. 60. Caremel 1 Caramel 2 Rutin polymer Chlorogrnic acid Rutin polymer + Chlorogenic acid. pH 5. Color intensity. 50. 40. 30. 20. 10. 0 0. 15. 30. 45. 60. 75. T im e (m in) 70. 60. pH 7. Caremel 1 Caramel 2 Rutin polymer Chlorogrnic acid Rutin polymer + Chlorogenic acid. Color intensity. 50. 40. 30. 20. 10. 0 0. 15. 30. 45. 60. 75. T im e (m in). Fig. 11. Changes in color intensity of caramel colorant alternatives by heating at various pHs.. 효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 205.

(22) 7 C a ra m e l 1 C a ra m e l 2 R u tin p o lym e r C h lo ro g en ic ac id R u tin p lym e r + C h lo ro g en ic ac id. Hue index. 6. 5. 4. 3 0. 5. 10. 15. 20. 25. 20. 25. T im e (d a y ) 50. Color intensity. 40. 30. 20 C arem el 1 C aram el 2 R utin p o lym e r C hlo ro grn ic ac id R utin p o lym e r + C h lo ro ge nic a cid 10 0. 5. 10. 15. T im e (d ay ) 4 C a ra m e l 1 C a ra m e l 2 R u tin p o ly m e r C h lo r o g e n ic a c id R u tin p ly m e r + C h lo r o g e n ic a c id. △E. 2. 0. -2. -4 0. 5. 10. 15. 20. 25. T im e ( d a y ). Fig. 12. Changes in hue index (top), color intensity (middle) and △E (bottom) of caramel colorant alternatives in ethanol (50%, v/v).. 206. 2013년 기초연구과제총서.

(23) 3.5. 캬라멜 대체소재의 착색효과 수용액 조건에서 캬라멜 색소 대체 소재의 안정성 평가 결과 rutin을 기질로 제조한 시료가 가 장 우수한 색소 안정성을 나타내었으므로 rutin을 기질로 제조한 대체 소재를 이용하여 고형시료 에 사용 시 착색효과를 평가하였다. 일차적으로 색의 hue index와 color intensity를 동일한 농 도에서 비교한 결과는 Table 5와 같다.. 모든 시료는 시료의 농도가 증가함에 따라 hue index는 큰 차이를 나타내지 않은 반면 color intensity는 농도에 비례하여 증가하는 경향을 나타냈다. Color intensity는 분말형 캬라멜 색소, 캬라멜 대체소재, 액상형 캬라멜 색소의 순으로 증가하였으며 각 시료 간에는 약 2배 정도의 차이 가 존재하였다. 이상의 결과를 근거로 유사한 착색 효과를 나타낼 것으로 예측되는 세가지 농도 (분말 캬라멜색소: 0.6, 0.9, 1.2%, 캬라멜 대체소재: 0.3, 0.45, 0.6, 액상형 캬라멜 색소: 0.075, 0.112, 0.15%)로 첨가하여 약식을 제조하고 색의 변화를 측정한 결과는 Fig. 13 및 Table 6에 제시하였다.. 캬라멜 색소와 대체소재를 첨가하여 제조한 약식은 수용액상태와 유사하게 모든 시료에서 첨가 량이 증가함에 따라 명도가 감소하였다. 첨가량이 동일한 수준(0.6%)인 캬라멜 분말 저농도(Low) 와 대체소재 고농도(High)를 비교하면 대체소재를 첨가하여 제조한 약식의 색이 상대적으로 더 어 둡게 착색되었으며 붉은색과 노란색의 비율인 a/b value는 분말형 캬라멜 색소가 0.218, 대체소 재가 0.298로서 대체소재가 보다 강한 붉은색 계열의 색상을 발현시켰다. 한편 액상형 캬라멜 색 소의 경우에는 첨가수준이 0.075에서 0.15%로 증가함에 따라 a/b value는 0.203에서 0.249로 증가하는 경향을 나타냈다.. 효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 207.

(24) Table 5. Hue index and color intensity of commercial caramels and caramel alternative. Concentration (%) 0.05. 0.1. 0.2. Hue index. Color intensity. Hue index. Color intensity. Hue index. Color intensity. Caramel (powder). 5.2. 3.0. 5.19. 6.20. 5.5. 10.9. Caramel (liquid). 5.0. 11.7. 5.09. 22.9. 5.0. 46.2. Caramel Alternative (Rutin polymers). 5.8. 4.6. 6.2. 10.49. 6.2. 18.1. Fig. 13 Yalsik prepared with caramel colorant alternative. 208. 2013년 기초연구과제총서.

(25) Table 5. Color attributes of yaksik prepared with caramel alternative. Concentration (%)1 Low. Medium. L. a. Caramel (powder). 57.73. 4.91. 22.46 53.75. 5.93. Caramel Alternative (Rutin polymers). 58.74. 3.03. 18.86 51.36. Caramel (liquid). 58.91. 3.67. 18.07 55.45. 1. b. L. a. High b. L. a. b. 22.26 49.26. 7.21. 21.86. 4.93. 19.93 51.18. 6.02. 20.18. 3.79. 17.21 52.80. 4.17. 16.74. 2. Caramel (powder) : 0.6, 0.9, 1.2%, Caramel alternative : 0.3, 0.45, 0.6, Caramel (liquid)3: 0.075, 0.112, 0.15%.. 캬라멜 색소와 대체소재를 첨가하여 시판중인 흑설탕과 유사한 색을 나타낼 수 있는 첨가 수준 을 조사한 결과 액상형 캬라멜 색소는 0.8, 캬라멜 분말은 4, 대체소재는 약 2.8%의 첨가가 필요 한 것으로 조사되었다. 조사된 첨가수준에서 액상형 캬라멜 색소는 시판중인 흑설탕과 비교하여 육안으로도 구별이 가능한 어두운 색으로 착색되었으며 대체 소재는 캬라멜 분말 소재의 70% 수 준으로 첨가한 경우에도 큰 차이를 나타내지 않았다(△E=54).. Fig. 14 Brown sugars prepared with caramel colorant alternative.. 효소적 산화갈변반응을 이용한 캬라멜색소 대체소재 개발. 209.

(26) Table 6. Color attributes of brown sugar prepared with caramel alternative. Ingredients Caramel liquid (0.8%). Brown sugar (commercial product). Caramel powder (4%). Caramel alternative (2.8%). L. a. b. △E. L. a. b. △E. L. a. b. △E. L. a. b. △E. 42. 3.1. 5.8. 56. 46. 6.6. 11. 53. 45. 6.9. 12. 54. 46. 11. 13. 54. 4. 연구 결과 및 제언 본 연구에서는 생체 기능성을 보유한 페놀화합물의 효소적 산화반응을 이용하여 캬라멜 색소 대 체소재를 제조하고 다양한 조건에서 색소의 안정성을 평가 하였다. 효소 반응에 의한 갈색 물질의 형성을 위해서는 ortho-diphenol 구조가 중요한 역할을 하였으며 명도(L-value)의 경우 단일 기질 을 반응시킨 경우보다 복합기질을 이용한 경우 보다 어두운 색상을 나타냈으며 rutin이나 chlorogenic acid를 기질로 사용하는 것이 다른 기질과 비교하여 높은 color intenisty를 나타냈다.. 캬라멜 대체 소재의 안정성을 평가한 결과 pH에 대한 안정성은 단일 기질을 이용한 반응물보다 복합기질의 사용 시 증가하는 경향이 관찰되었으며 80℃에서 60분간 가열하여도 다양한 pH 조건 에서 안정하였다. 따라서, 발색 효과 및 안정성의 측면에서 판단할 때 시중에 판매되는 면류 식품 의 스프 분말, 과자 그리고 빵과 같은 식품 분야에 부분적으로 사용 가능 할 것으로 판단되며 caramel color Ⅲ(color intensity: 0.08-0.36, hue index: 5.1-5.5)의 대체 색소로서 사용가 능 할 것으로 생각된다. 모델시스템을 이용하여 캬라멜 색소 대체 소재의 착색 효과를 평가한 결 과 분말형 캬라멜 색소 첨가량의 약 70%를 첨가하여도 약식과 흑설탕과 같은 고형식품에서 유사 한 착색 효과가 확인되었다.. 향후 색의 발현 특성이 우수한 페놀화합물을 다량 함유한 다른 저가의 식품 자원을 활용(예; 사 과박, chlorogenic acid 풍부)하여 캬라멜 색소 대체소재 생산을 위한 산업적 응용 가능성이 평가 되기를 기대한다.. 210. 2013년 기초연구과제총서.

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