대한소화기학회지 2008;52:359-367
접수: 2008년 3월 15일, 승인: 2008년 6월 30일 연락처: 이상대, 400-714, 인천시 중구 율목동 237
인천기독병원 소화기내과
Tel: (032) 762-7831, Fax: (032) 763-9409 E-mail: [email protected]
Correspondence to: Sang Dae Lee, M.D.
Department of Internal Medicine, Incheon Christian Hospital, 237, Yulmok-dong, Jung-gu, Incheon 400-714, Korea
Tel: +82-32-762-7831, Fax: +82-32-763-9409 E-mail: [email protected]
대장 점막의 전암 병변과 암종에서 Nuclear Factor, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase 및 Cyclin D1 단백
발현의 면역조직화학 분석
인천기독병원 내과, 중앙대학교 의과대학 병리학교실*
이상대ㆍ이태진*ㆍ박언섭*
Immunohistochemical Analysis of Nuclear Factor, p38, and Cyclin D1 Proteins in Premalignant Lesions and Carcinomas of the Colorectal Mucosa
Sang Dae Lee, M.D., Tae Jin Lee, M.D.*, and Eon Sub Park, M.D.*
Department of Internal Medicine, Incheon Christian Hospital, Incheon, Department of Pathology, Chung-Ang University College of Medicine*, Seoul, Korea
Background/Aims: Nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65), nuclear factor-κB1 p50 (NF-κB p50) have been shown to play a role in cell proliferation, apoptosis, cytokine production, and oncogenesis. Recently, p38 mi- togen-activated protein kinase (MAPK)/ NF-κB/ cyclin D1 signaling pathway has been shown to play an im- portant part in the pathogenesis of human cancers. This study was designed to investigate the expression of NF- κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, and cyclin D1 proteins in premalignant lesions of colon and colorectal adenocarcinoma. Methods: Paraffin sections of 20 normal mucosa, 20 low-grade tubular adenoma, 20 high-grade tubular adenoma and 64 adenocarcinoma tissues were analysed immunohistochemically for the expression of NF- κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, and cyclin D1 proteins. Results: The expression of NF-κB p65, NF-κB p50, and p38 MAPKα proteins were significantly higher in adenocarcinoma tissue in comparison with that in normal mucosa, low-grade tubular adenoma, and high-grade tubular adenoma tissues. Expression of NF-κB p50 was more frequent in poorly differentiated histologic grade, presence of nodal metastasis, and advanced stage.
Expression of p38 MAPKα protein was higher in advanced tumor stage, presence of nodal metastasis and ad- vanced stage. Synchronous expression of NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, and cyclin D1 proteins were significantly higher in adenocarcinoma tissue. Conclusions: With the increased expression of NF-κB p65, NF- κB p50, and p38 MAPKα proteins, p38 MAPK/ NF-κB/ cyclin D1 signaling pathway may play a role in the pathogenesis of colorectal carcinoma. (Korean J Gastroenterol 2008;52:359-367)
Key Words: Carcinoma, Colorectal; NF-κB p65; NF-κB p50; p38 MAPKα; Cyclin D1
360 대한소화기학회지: 제52권 제6호, 2008
서 론
염증과 종양과의 연관성은 과거부터 대두되었고 19세기 에 이미 만성 염증에 의하여 악성종양이 유발될 것이라고 추정되었지만 최근까지 염증과 종양의 연관성에 대해서는 널리 인정받지 못하였다.1 감염과 종양은 모든 인간 악성종 양의 15-20%에서 연관성이 있을 것으로 추정된다.2 예를 들 어 B형과 C형 간염 바이러스가 간암의 중요한 위험인자이 며 Helicobacter pylori 감염과 위암의 연관성이 알려져 있 다.3 궤양성 대장염과 같은 만성 염증성 장질환이 대장직장 암의 위험을 증가시키고, 만성적인 호흡기 자극과 염증이 폐암의 중요한 유발인자가 되고 있다.4,5 따라서 만성적인 염증이 어떻게 종양을 유발하고 진행시키는지에 관한 의문 을 해결하기 위한 노력은 계속되고 있다. 종양의 발생과 진 행은 충분한 성장을 촉진하는 신호와 성장 억제 신호의 감 소, 세포자멸사의 억제, 증식, 조직 침습, 전이, 신생혈관 생 성 등이 관여하여 이루어지는 과정이라고 할 수 있으며 이 러한 모든 과정에 염증과 NF-κB가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.6 감염과 염증 및 괴사 산물에 의하여 NF-κB 가 활성화되고 이로 인하여 세포 주기 유전자들과 세포자멸 사 억제 인자들 및 침윤에 관여하는 단백들이 활성화된다고 한다.6
Rel/NF-κB는 세포 성장, 분화, 세포자멸사의 조절, 사이 토카인 생성, 종양화에 관여하는 많은 유전자들을 조절하는 전사인자들의 군이다.7 Rel/NF-κB군에는 NF-κB1 (p50), NF-κB2 (p52), Rel 단백인 RelA (p65), RelB, c-Rel 등이 있 다.8 난소암, 폐암, 유방암, 갑상선암, 방광암 등의 인간 종양 세포 주에서 NF-κB의 활성화가 보고되었고, NF-κB p65가 대장암의 발생과정에서 중요한 역할을 하며, NF-κB p65과 NF-κB p50의 과발현이 예후와 연관성이 있다는 연구 결과 가 보고된 바 있다.9-14
p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)는 염증과 세 포 증식 및 세포사를 조절하는 인자의 하나이다.15 p38 경로 의 활성은 일반적으로 세포가 스트레스를 받는 상황에서 이 루어지며 MKK3와 MKK6가 관여하는 p38의 인산화 과정을 통하여 발생한다.16 p38 경로의 활성화는 전사, 전이, 세포주 기의 진행, 세포자멸사와 같은 세포의 다양한 과정을 조절 한다고 알려져 있다.15 p38 MAPK의 과발현이 위암, 간암, 유방암, 전립선암, 췌장암 등을 포함하는 몇몇 종양에서 알 려져 있으며, p38 MAPK/NF-κB/cyclin D1 신호전달 경로가 종양 생성에 중요한 역할을 할 것이라는 연구 보고가 있 다.17-22
이미 많은 연구가 있어왔던 cyclin D1은 염색체 11q13에 위치하며 세포주기에서 G1 단계의 CDK와 복합체를 형성하 여 Rb 단백을 인산화시킴으로써 세포 증식을 유발하고 종
양 발생에 관여한다고 알려져 있다.23,24 이러한 cyclin D1이 NF-κB가 세포 주기의 진행에 관여함에 있어서 표적이 된 다는 연구 보고가 있어서25 대장암의 발생 단계에서 cyclin D1과 NF-κB의 발현을 동시에 관찰하는 NF-κB의 분자생 물학적인 역할을 이해하는 데 중요하다.
이에 이번 연구에서 대장암의 발생 단계와 진행에 있어서 NF-κB p65, NF-κB p50 p38 MAPKα, cyclin D1 단백 발현 의 연관성을 관찰하고 NF-κB p65와 NF-κB p50 및 p38 MAPKα 단백 발현과 임상병리학적인 인자들과의 연관성 을 관찰하여 예후인자로서 가치가 있는지를 알아보고자 하 였다.
대상 및 방법
1. 연구대상
2005년 1월부터 2006년 12월까지 중앙대학교병원에서 병 리학적으로 대장암으로 진단되어 외과 수술한 환자 중 조직 보관 상태가 양호한 64명과 저등급과 고등급의 형성이상이 동반된 대장직장 용종 각각 20예의 파라핀 포매 조직을 이 용하였다. 대조군으로 사용한 정상 점막 20예는 대장 내시 경을 통하여 얻은 생검 조직 중 용종이나 종양이 관찰되지 않고 비교적 염증 소견도 적은 예를 선택하였다.
2. 연구방법
1) 임상 기록 검토와 병리조직 검색
환자의 임상기록을 토대로 성별, 연령을 조사하고 환자의 유리 슬라이드를 재검색하여 조직 분화도를 정하며 Ameri- can Joint Committee on Cancer의 Cancer Staging Manual (6th edition, 2002)에 따라 병기를 조사하였다.
2) 면역조직화학 염색
파라핀 포매조직을 두께 4-5μm으로 절편으로 박절하고 xylene으로 5분간 3회 탈파라핀시킨 후 무수 알코올, 90%, 75% 및 50% 에탄올에 각각 2분씩 처리하여 함수시켰다. 조 직 절편에 있는 내인 과산화효소의 활성을 억제하기 위해 0.3% hydrogen peroxide-methanol에 10분간 처리 후 증류수로 세척하고, 절편을 50 mM Tris 완충용액(TBS, pH 7.5)으로 수세 후 비특이 항원을 제거하기 위해 30분간 염소혈청과 반응시키고 여분의 용액을 제거하였다. 일차항체로 RelA (p65) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF- κB1 (p50) (Santa Cruz Biotechnology), p38 MAPKα (Cell signaling Technology, Beverly, USA), cyclin D1 (Novocastra, Newcastle, UK) 단일 항체를 1:50으로 희석하여 실온에서 2 시간 동안 반응시키고, TBS로 5분간 3회 수세한 다음 biotin
이상대 외 2인. 대장 점막의 전암 병변과 암종에서 면역조직화학 분석 361
Table 1. Immunoexpressions of NF-κB p65, NF-κB p50, and p38 MAPKα in Transition from Normal Mucosa to Adenocarcinoma
n NF-κB p65 NF-κB p50 p38 MAPKα
(−) (%) (＋) (%) (−) (%) (＋) (%) (−) (%) (＋) (%) Normal mucosa 20 18 (90.0) 2 (10.0) 16 (80.0) 4 (20.0) 19 (95.0) 1 (5.0) Adenoma, LG 20 14 (70.0) 6 (30.0) 15 (75.0) 5 (25.0) 18 (90.0) 2 (10.0) Adenoma, HG 20 11 (55.0) 9 (45.0) 11 (55.0) 9 (45.0) 6 (30.0) 14 (70.0) Adenocarcinoma 64 25 (39.1) 39 (60.9) 14 (21.9) 50 (78.1) 14 (21.9) 50 (78.1)
p-value 0.0001 0.0001 0.0001
LG, low-grade; HG, high-grade.
Fig. 1. Immunohistochemical staining in adenocarcinoma of the colorectal mucosa. (A) NF-κB p65; diffusely strong positive cells (×200). (B) NF-κB p50; diffusely strong positive cells (×200). (C) p38 MAPKα; diffusely strong positive cells (×200). (D) cyclin D1;
diffusely strong positive cells (×200).
이 부착된 이차항체(Zymed, South San Francisco, CA, USA) 를 1:300으로 희석하여 작용시킨 후 통상적인 avidin-biotin complex법으로 20분간 반응시켰다. 발색제는 3-amino-9-ethyl carbazole (AEC)를 사용하였고 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하여 glycerol gelatin으로 봉입한 후 광학현미경으로 관 찰하였다.
염색결과의 판정은 NF-κB p65는 세포질과 핵에 NF-κB p50과 p38 MAPKα 및 cyclin D1은 핵에 염색되는 세포의 수가 10% 이상이면 양성으로 판정하였다(Fig. 1).
3. 통계 분석
정상 조직과 저등급과 고등급의 용종 및 선암종에서 NF- κB p65, NF-κB p55, p38 MAPKα, cyclin D1 발현의 연관 성을 Window용 SPSS version 12.0 통계 프로그램을 이용하 여 Pearson Chi-square test와 correlation test를 실시하여, p값 이 0.05 이하일 때를 유의성이 있는 것으로 인정하였다.
4. 연구승인
중앙대학교 의료원 임상연구 윤리위원회의 승인을 받았 고, 환자에게 서면 동의서를 받았다.
결 과
1. 임상 병리 소견
대장암종 64예 중 남자는 37명(57.8%) 여자는 27명(42.2%) 이었으며, 평균 나이는 62.4세였다. 조직 분화도는 고분화도 가 13예(20.3%), 중등도 분화도가 46예(71.9%), 저분화도가 5 예(7.8%)였으며, 종양 색전이 없는 군이 35예(54.7%), 있는 군이 29예(45.3%)였다. 종양 병기가 T0과 T1인 군은 포함되 지 않았고 T2인 군이 5예(7.8%), T3인 군이 55예(85.9%), T4 인 군이 4예(6.3%)였다. 림프절 전이가 없는 예가 26예 (40.6%), 전이가 있는 예가 38예(59.4%)였으며, 병기가 stage
362 The Korean Journal of Gastroenterology: Vol. 52, No. 6, 2008
Table 2. Correlation between Immunoexpressions of NF-κB p65, NF-κB p50, and p38 MAPKα and Histopathologic Features in Colon Adenocarcinoma
n NF-κB p65 NF-κB p50 p38 MAPKα
(−) (%) (＋) (%) (−) (%) (＋) (%) (−) (%) (＋) (%) Differentiation
Well 13 9 (69.2) 4 (30.8) 6 (46.1) 7 (53.9) 7 (53.8) 6 (46.2) Moderate 46 13 (28.3) 33 (71.7) 8 (17.4) 38 (82.6) 4 (8.7) 42 (91.3) Poor 5 3 (60.0) 2 (40.0) 0 (0) 5 (100) 3 (60.0) 2 (40.0)
p-value NS 0.040 NS
Tumor emboli
Negative 35 14 (40.0) 21 (60.0) 10 (28.6) 25 (71.4) 10 (28.6) 25 (71.4) Positive 29 11 (37.9) 18 (62.1) 4 (13.8) 25 (86.2) 4 (13.8) 25 (86.2)
p-value NS NS NS
T-stage
T2 5 4 (80.0) 1 (20.0) 3 (60.0) 2 (40.0) 3 (60.0) 2 (40.0) T3 55 19 (34.5) 36 (65.5) 10 (18.2) 45 (81.8) 11 (20.0) 42 (76.4) T4 4 2 (50.0) 2 (50.0) 1 (33.3) 3 (66.7) 0 (0) 4 (100)
p-value NS NS 0.026
Nodal metastasis
(−) 26 11 (42.3) 15 (57.7) 9 (34.6) 17 (65.4) 9 (34.6) 17 (56.4) (＋) 38 14 (36.8) 24 (63.2) 5 (13.2) 33 (86.8) 5 (13.2) 33 (86.8)
p-value NS 0.042 0.042
Stage
I 4 3 (75.0) 1 (25.0) 2 (50.0) 2 (50.0) 2 (50.0) 2 (50.0) II 22 8 (36.4) 14 (63.6) 7 (31.8) 15 (68.2) 7 (31.8) 15 (68.2) III 38 14 (42.4) 24 (63.2) 5 (13.2) 33 (86.8) 5 (13.2) 33 (86.8)
p-value NS 0.029 0.029
NS, not significant.
I인 군이 4예(6.3%), stage II인 군이 22예(34.4%), stage III인 군이 38예(59.3%)였다.
2. NF-κB p65 단백 발현
이번 연구에 사용한 단일 항체는 활성화된 NF-κB p65 단 백을 검출할 수 있는 항체로 NF-κB p65 단백은 세포의 세 포질과 핵에서 양성반응이 관찰되었는데 핵보다는 세포질 에서 양성 반응을 보이는 빈도가 높았고 핵에서만 양성반응 을 보이는 예는 없었다. 핵에서의 양성반응은 핵질에서 관 찰되었다. 세포질과 핵에서 동시에 양성반응을 보이는 경우 를 NF-κB p65 단백 발현 양성으로 판정하였다. 염색 결과 정상 점막의 10.0%에서 발현이 관찰되었고, 저등급 선종에 서는 30.0%, 고등급 선종에서는 45.0%, 선암종에서는 60.9%
에서 발현이 관찰되어 유의하게 정상 점막에서 선암종으로 진행하면서 발현 빈도가 증가하였다(Table 1).
총 64예의 선암종에 대하여 병리 인자들과 NF-κB p65 단백 발현을 비교분석하였다. 분화도에 따른 분석에서는 조 직학적인 고분화도에서 30.8%, 중등도 분화도에서 71.7%, 저분화도에서 40.0%의 발현 빈도를 나타내면서 통계학적인
유의성은 없었으며, 종양 색전, 종양 병기, 림프절 전이, 병 기와도 연관성이 관찰되지 않았다(Table 2).
3. NF-κB p50 단백 발현
NF-κB p50 단백 발현은 세포의 핵에서 관찰되었다. 염색 결과 정상 점막의 20.0%에서 발현이 관찰되었고, 저등급 선 종에서는 25.0%, 고등급 선종에서는 45.0%, 선암종에서는 78.1%에서 발현이 관찰되어 유의하게 정상 점막에서 선암 종으로 진행하면서 발현 빈도가 증가하였다(p=0.0001).
총 64예의 선암종에서 조직 분화도에 따른 분석에서는 고 분화도에서 53.9%, 중등도 분화도에서 82.6%, 저분화도에서 100%의 발현 빈도를 나타내 통계학적인 유의성이 있었다 (p=0.040). 종양 색전과 종양 병기에 따른 연관성은 관찰되 지 않았고, 림프절 전이가 없는 군에서는 65.4%, 전이가 있 는 군에서는 86.8%에서 NF-κB p50 단백 발현이 관찰되어 통계학적인 유의성이 있었으며(p=0.042), 병기에 따른 분석 에서도 병기가 stage I에서 III로 진행할수록 NF-κB p50 단 백 발현은 50.0%, 68.2%, 86.8%로 증가하며 통계학적인 유 의성이 있었다(p=0.029)(Table 2).
Lee SD, et al. Immunohistochemical Analysis in Premalignant Lesions and Carcinomas of the Colorectal Mucosa 363
Table 3. Correlation of Immunoexpressions of NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα and Cyclin D1 in the Premalignant and Adenocarcinoma of the Colon
NF-κB p65 NF-κB p50 p38 MAPKα Cyclin D1 (−) (%) (＋) (%) (−) (%) (＋) (%) (−) (%) (＋) (%) (−) (%) (＋) (%) NF-κB p65 (−) 50 29 (58.0) 21 (42.0) 29 (58.0) 21 (42.0) 32 (64.0) 18 (36.0) (＋) 54 11 (20.4) 43 (79.6) 9 (16.7) 45 (83.3) 11 (20.4) 43 (79.6)
p-value 0.0001 0.0001 0.0001
NF-κB p50 (−) 40 29 (72.5) 11 (27.5) 25 (62.5) 15 (37.5) 24 (60.0) 16 (40.0) (＋) 64 21 (32.8) 43 (67.2) 13 (20.3) 51 (79.7) 19 (29.7) 45 (70.3)
p-value 0.0001 0.0001 0.002
p38 MAPKα (−) 38 29 (76.3) 9 (23.7) 25 (65.8) 13 (34.2) 23 (60.5) 15 (39.5) (＋) 66 21 (31.8) 45 (68.2) 15 (22.7) 51 (77.3) 20 (30.3) 46 (69.7)
p-value 0.0001 0.0001 0.003
Cyclin D1 (−) 43 32 (74.4) 11 (25.6) 24 (55.8) 19 (44.2) 23 (53.5) 20 (46.5) (＋) 61 18 (29.5) 43 (70.5) 16 (26.2) 45 (73.8) 15 (24.6) 46 (75.4)
p-value 0.0001 0.002 0.003
Table 4. Synchronous Expressions of NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα and Cyclin D1 Proteins
n p65(＋), p50(＋), p38(＋), cyclin D1(＋) (−) (%) (＋) (%) Normal mcosa 20 20 (100) 0 (0) Adenoma, LG 20 20 (100) 0 (0) Adenoma, HG 20 16 (80.0) 4 (20.0) Adenocarcinoma 64 35 (54.7) 29 (45.3)
p-value 0.0001
LG, low-grade; HG, high-grade.
4. p38 MAPKα 단백 발현
p38 MAPKα 단백은 정상 점막의 5.0%에서 발현이 관찰 되었고, 저등급 선종에서는 10.0%, 고등급 선종에서는 70.0%, 선암종에서는 78.1%에서 발현이 관찰되어 유의하게 정상 점막에서 선암종으로 진행하면서 발현 빈도가 증가하 였다(p=0.0001).
총 64예의 선암종에서 조직 분화도와 종양 색전에 따른 분석에서는 통계학적인 유의성이 없었다. 종양 병기에 따른 분석에서는 병기가 T2에서 T4로 진행할수록 p38 MAPKα 단백 발현의 빈도도 40.0%, 76.4%, 100%로 유의하게 증가하 였고(p=0.026), 림프절 전이가 없는 군에서는 56.4%, 전이가 있는 군에서는 86.8%에서 단백 발현이 관찰되어 통계학적 인 유의성이 있었으며(p=0.042), 병기에 따른 분석에서도 병 기가 stage I에서 stage III로 진행할수록 단백 발현은 50.0%, 68.2%, 86.8%로 증가하며 통계학적인 유의성이 있었다 (p=0.029)(Table 2).
5. 전암 병변과 선암종에서 NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, cyclin D1 단백 발현의 연관 성 및 동시 발현
총 104예의 전암 병변과 선암종에서 NF-κB p65 단백 발 현이 음성인 경우에 NF-κB p50 단백 발현도 음성인 경우는 58.0%, NF-κB p65 단백 발현이 양성인 경우에 NF-κB p50 단백 발현도 양성인 경우는 79.6%로 통계학적인 유의성이 있었고, NF-κB p65 단백 발현이 음성인 경우에 p38 MAPK α 단백 발현도 음성인 경우는 58.0%, NF-κB p65 단백 발 현이 양성인 경우에 p38 MAPKα 단백 발현도 양성인 경우 는 83.3%로 통계학적인 유의성이 있었다. NF-κB p65 단백
발현이 음성인 경우에 cyclin D1 단백 발현도 음성인 경우 는 64.0%, NF-κB p65 단백 발현이 양성인 경우에 cyclin D1 단백 발현도 양성인 경우는 79.6%로 통계학적인 유의성이 있었다(p=0.0001). 또한 NF-κB p50 단백 발현이 음성인 경 우에 p38 MAPKα 단백 발현도 음성인 경우는 62.5%, NF-κ B p50 단백 발현이 양성인 경우에 p38 MAPKα 단백 발현 도 양성인 경우는 79.7%로 통계학적인 유의성이 있었다 (p=0.0001). NF-κB p50 단백 발현이 음성인 경우에 cyclin D1 단백 발현도 음성인 경우는 60.0%, NF-κB p50 단백 발 현이 양성인 경우에 cyclin D1 단백 발현도 양성인 경우는 70.3%로 통계학적인 유의성이 있었다(p=0.002). p38 MAPK α 단백 발현이 음성인 경우에 cyclin D1 단백 발현도 음성 인 경우는 60.5%, p38 MAPKα 단백 발현이 양성인 경우에 cyclin D1 단백 발현도 양성인 경우는 69.7%로 통계학적인 유의성이 있었다(p=0.003)(Table 3).
NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, cyclin D1 단백이 동시에 발현되는 예들을 관찰해 본 결과 저등급의 선종에서
364 대한소화기학회지: 제52권 제6호, 2008
는 0%, 고등급의 선종에서는 20%, 선암종에서는 45.3%에서 관찰되어 유의하게 병변이 진행할수록 NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, cyclin D1 단백이 동시에 발현되는 빈도 가 높아졌다(p=0.0001)(Table 4).
고 찰
Rel/NF-κB는 NF-κB1 (p50), NF-κB2 (p52), Rel 단백인 RelA (p65), RelB, c-Rel 등의 많은 유전자들을 포함하는 전 사인자들의 군으로 이들은 세포의 성장과 분화, 세포자멸사 의 조절, 사이토카인 생성 및 종양화에 관여하는 것으로 알 려져 있다.7 자극을 받지 않은 상태에서 Rel/NF-κB 단백은 세포질에 존배하며 IκB라고 불리는 특이 억제 단백과 복합 체를 이루고 있다. 세포 자극으로 인산화와 IκB 분해가 발 생하고 핵 안으로 Rel/NF-κB 전이가 발생하여 표적 유전자 발현이 유발된다. 현재까지 Rel/NF-κB를 활성화시키는 다 양한 인자들이 발견되었다. 이러한 경로에 tumor necrosis factor-α와 IL-1과 같은 사이토카인이 관여하는 면역 반응이 관여하고 UV light와 ionizing radiation과 같은 physical stress, hydrogen peroxide, butyl peroxide와 같은 oxidative stress가 작 용한다.26
이번 연구에서 NF-κB p65 단백은 대장의 정상 점막, 저 등급 선종, 고등급 선종, 선암종에서 각각 10.0%, 30.0%, 45.0%, 60.9%의 발현이 관찰되었으며, NF-κB p50은 각각 20%, 25.0%, 45.0%, 78.1%에서 발현이 관찰되어 NF-κB p65 단백과 NF-κB p50 단백은 대장암 발생과정에서 발현 빈도 가 증가함을 알 수 있었다. 다른 연구에 의하면 NF-κB p65 과 NF-κB p50 단백은 이번 연구 결과와 같이 정상 점막에 서 선종을 거쳐 선암종으로 발전할수록 발현이 증가하
고,14,27 NF-κB p50 단백 발현은 혈관 침범, 림프절 전이, 간
전이, 병기 등과 연관성이 있어서 나쁜 예후 인자로서의 가 능성이 있다.28 이번 연구에서 NF-κB p65 단백 발현은 임상- 병리 인자들과 통계학적인 유의성이 관찰되지 않았지만, NF-κB p50 단백 발현은 조직 분화도, 림프절 전이, 병기와 연관성이 관찰되었다. 그래도 NF-κB p65 단백 발현은 고분 화도의 종양보다는 중등도와 저분화도 종양에서 발현되는 빈도가 높았고, T2에 비하여 T3와 T4에서 발현되는 빈도가 높았으며, stage I에 비하여 stage II와 III에서 현저히 높은 빈도로 발현되는 경향이 관찰되어 NF-κB p65 단백 발현도 NF-κB p50의 단백 발현과 다르지 않게 종양의 진행과 연 관성이 있을 것으로 생각한다. 하지만 이번 연구에서 고분 화도와 중등도 분화도 종양에 비하여 저분화도 검체가 상대 적으로 적고 T4에 해당하는 검체의 수가 적어서 임상-병리 인자들과의 연관성을 판단하기에는 한계가 있다.
이번 연구에서 사용한 NF-κB p65 단일 항체는 이전 저
자들에 의하여 NF-κB p65의 비활성화와 활성화된 형태를 구별하는 데 유용하다고 알려진 것이다.14,27 이들의 연구 결 과에 의하면 활성화된 NF-κB p65 단백의 오직 10-20%만이 핵에서 검출되고 나머지 80-90%의 NF-κB p65 단백은 세포 질에 남아있었다.14 이번 연구에서 NF-κB p65 단백 발현이 세포질과 핵에서 동시에 관찰된 점은 이들의 연구 결과와 일치하는 소견으로 많은 연구에서 세포질과 핵에 염색된 경 우를 NF-κB p65 단백이 활성화된 양성으로 판정하고 있
다.14,22,27 IκB로부터 분리되어 활성화된 NF-κB p65 단백이
세포질에 남아있는 이유에 대해서는 명확히 밝혀진 바는 없 지만 세 가지 정도의 가능성이 제기되고 있다.14 첫째는 IκB 에 돌연변이가 발생하여 NF-κB p65와 결합할 수 없게 됨 으로써 NF-κB p65의 핵전이 신호가 가려졌을 가능성과 두 번째로는 NF-κB p65에 돌연변이가 발생하여 IκB와의 결 합이 이루어지지 않았을 가능성이고 세 번째는 NF-κB p65 상향 신호 형질도입 캐스케이드(upstream signal transduction cascades)의 구조적인 활성화 가능성이다. NF-κB p65와는 달리 NF-κB p50은 기본적인 수용체가 발견되고 있지 않다 가 Bcl-3 단백이 IκB와 유사한 역할을 할 수 있다는 사실이 알려졌고, MAD-3의 작용에 의하여 NF-κB p50이 세포질에 정체된다는 연구 보고가 있다.29 또한 NF-κB p50이 과발현 되었을 경우에 세포질에는 검출할 수 있는 양의 단백이 존 재하지 않는다고 알려져 있다.29 이번 연구에서도 NF-κB p50 단백은 세포의 핵에서만 발현됨이 관찰되었다.
NF-κB 단백 발현의 변화는 만성 염증과 사이토카인이나 바이러스 등의 다양한 자극에 의하여 발생할 수 있어 대장 직장암의 발생에 NF-κB가 직접 영향을 미치는지 여부에 대해서는 계속적인 연구가 필요한 상태라고 생각하고, 예후 인자로서의 가치에 대해서도 이전 저자들에 의해서 계속 논 란 중이다. 하지만 다양한 종류의 종양에서 NF-κB 활성이 관찰되었고 많은 연구를 통하여 NF-κB가 세포자멸사 뿐만 아니라 신생혈관형성, 세포증식, 침윤, 전이 등에 역할을 한 다는 것이 알려지고 있으며 이러한 점들을 이용하여 최근 종양에서 NF-κB에 대한 중요 연구 분야는 종양의 치료에 다양한 NF-κB 억제제의 사용을 시도해 보는 것이다. 일부 연구에서 성공적인 암억제 효과를 보고하기도 하였지만30 NF-κB가 치료에 유용하게 사용되기까지는 더 많은 연구가 필요하다고 생각한다.
p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)는 염증과 세 포 증식 및 세포사를 조절하는 인자의 하나이며 p38 경로의 활성화는 전사, 전이, 세포주기의 진행, 세포 자멸사와 같은 세포의 다양한 과정을 조절한다고 알려져 있다.22 이번 연구 에서 p38 MAPKα는 정상 점막의 5.0%에서 발현이 관찰되 었고, 저등급 선종, 고등급 선종, 선암종에서는 각각 10.0%, 70.0%, 78.1%에서 발현이 관찰되어 유의하게 정상 점막에서
이상대 외 2인. 대장 점막의 전암 병변과 암종에서 면역조직화학 분석 365
선암종으로 진행하면서 발현 빈도가 증가하였다. 이러한 결 과는 p38 MAPKα가 대장암종의 발생 단계에서 그 발현이 점차 증가함을 시사하는 소견이라고 판단된다. 또한 선암종 을 대상으로 한 분석에서 p38 MAPKα 발현은 종양 병기와 림프절 전이 및 병기와 연관성이 관찰되어 종양의 진행과도 연관성이 있을 것으로 생각한다. Davison 등은 유방암에서 p38의 발현과 활성이 종양의 진행 및 나쁜 예후와 연관성이 있다는 연구 결과를 발표하였다. 이들의 연구에서는 유방암 세포의 p38 활성화와 세포자멸사 사이에는 연관성이 없어 서 p38 활성화 기전을 세포자멸사와의 관련보다는 스트레 스 관련 기전으로 설명하고 있다.19 Lin 등의 연구에서도 유 방외 파젯병에서 p38 단백의 과발현이 관찰되었고, NF-κB p65 및 cyclin D1 단백 발현과의 연관성도 관찰되었다.22 이 러한 점은 p38이 세포 증식과 종양 형성에 관여한다는 이전 연구 결과들과 일치하는 내용이라고 생각한다. 최근 대장암 세포에서 p38α의 억제가 세포사를 유발하고 종양의 진행 을 억제한다는 연구 결과가 있어서31 대장직장암의 치료에 도 p38이 사용될 수 있을 것으로 예측된다.
이번 연구에서 NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, cyclin D1은 서로 연관성 있게 발현하고 있었으며, NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, cyclin D1 단백이 동시에 발 현되는 예들을 관찰해 본 결과 저등급 선종에서는 0%, 고등 급 선종에서는 20%, 선암종에서는 45.3%에서 관찰되어 유 의하게 병변이 진행할수록 NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, cyclin D1 단백이 동시에 발현되는 빈도가 높아졌 다(Table 4). 이는 NF-κB/p38 MAPKα/ cyclin D1 경로가 세 포의 증식, 세포자멸사, 분화, 악성화 등과 연관성 있는 중 요 신호 전달 경로라는 이전 저자들의 연구 결과에 부합하 는 소견이라고 생각한다.27,28
NF-κB의 활성화에 의하여 cyclin D1이 증가한다고 알려 져 있어서25 NF-κB 단백과 cyclin D1 단백이 연관성 있게 발현되는 것은 합당한 소견이라고 생각하지만, TAK1-MKK6- p38 경로에 의하여 cyclin D1의 발현이 하향 조절된다는 기 전이 알려져 있어서32 종양에서의 p38 발현 증가와 cyclin D1의 연관성에 대해서는 계속적인 연구가 필요하다.
결론으로 NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα 단백 발 현은 각각 대장암의 발생 단계에서 역할을 하고 NF-κB p50과 p38 MAPKα 단백 발현은 대장암의 임상-병리 인자 들과 연관성이 있어서 암의 진행과 연관성이 있으며, NF-κ B p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, cyclin D1 단백은 서로 연 관성있게 발현하여 NF-κB/p38 MAPKα/ cyclin D1 신호전 달 경로가 대장암의 발생과 진행에 역할을 하는 것으로 생 각한다.
요 약
목적: Nuclear Factor-κB p65 (NF-κB p65)와 Nuclear Factor-κB1 p50 (NF-κB p50)은 세포증식과 세포자멸사, 시 토카인 생성 및 종양화에 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 최근 p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/ NF-κB/
cyclin D1 신호전달 경로가 인간 종양 발생에 중요한 부분 을 담당한다는 연구 결과가 있다. 이번 연구에서는 대장의 전암 병변과 선암종에서 NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, cyclin D1의 단백 발현을 알아보고자 하였다. 대 상 및 방법: 정상 점막 20예, 저등급 선종 20예, 고등급 선 종 20예, 선암종 64예의 파라핀 포매 조직을 이용하여 NF- κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, cyclin D1 단백에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였다. 결과: NF-κB p65과 NF- κB p50 및 p38 MAPKα 단백의 발현은 정상 점막에서 선 암종으로 진행하면서 유의하게 증가하였다. 선암종에서 NF-κB p50 단백은 저등급 분화도인 경우, 림프절 전이가 있는 경우, 병기가 높은 경우에 발현 빈도가 높았고, p38 MAPKα 단백은 종양 병기가 높은 경우, 림프절 전이가 있 는 경우, 병기가 높은 경우에 발현 빈도가 높았다. NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, cyclin D1 단백은 서로 연관 성 있게 발현하였고, 선암종에서 NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, cyclin D1 단백이 모두 발현되는 예가 많았다.
결론: NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα 단백 발현은 각각 대장암의 발생 단계에서 역할을 하고 NF-κB p50과 p38 MAPKα 단백 발현은 대장암의 임상-병리 인자들과 연 관성이 있어서 암의 진행과 연관성이 있으며, NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, cyclin D1 단백은 서로 연관성있 게 발현하여 NF-κB/p38 MAPKα/cyclin D1 신호전달 경로 가 대장암의 발생과 진행에 역할을 하는 것으로 생각한다.
색인단어: 대장직장암, NF-κB p65, NF-κB p50, p38 MAPKα, Cyclin D1
참고문헌
1. Balkwill F, Mantovani A. Inflammation and cancer: back to Virchow? Lancet 2001;357:539-545.
2. Kuper H, Adami HO, Trichopoulos D. Infections as a major preventable cause of human cancer. J Intern Med 2000;248:
171-183.
3. Roder DM. The epidemiology of gastric cancer. Gastric Cancer 2002;5:5-11.
4. Ekbom A. Risk of cancer in ulcerative colitis. J Gastrointest Surg 1998;2:312-313.
366 The Korean Journal of Gastroenterology: Vol. 52, No. 6, 2008
5. Dhala A, Pinsker K, Prezant DJ. Respiratory health con- sequences of environmental tobacco smoke. Med Clin North Am 2004;88:1535-1552.
6. Karin M. NF-κB and cancer: mechanism and targets. Mol Carcinog 2006;45:355-361.
7. Loncar MB, Al-Azzeh ED, Sommer PS, et al. Tumour ne- crosis factor α and nuclear factor κB inhibit transcription of human TFF3 encoding a gastrointestinal healing peptide. Gut 2003;52:1297-1303.
8. Ghosh S, May MJ, Kopp EB. NF-κB and Rel proteins: evo- lutionarily conserved mediators of immune responses. Annu Rev Immunol 1998;16:225-260.
9. Xiao CW, Yan X, Li Y, Reddy SA, Tsang BK. Resistance of human ovarian cancer cells to tumor necrosis factor α is a consequence of nuclear factor κB-mediated induction of Fas-associated death domain-like interleukin-1β-converting enzyme-like inhibitory protein. Endocrinology 2003;144:623- 630.
10. Mukhopadhyay T, Roth JA, Maxwell SA. Altered expression of the p50 subunit of the NF-κB transcription factor com- plex in non-small cell lung carcinoma. Oncogene 1995;11:
999-1003.
11. Nakshatri H, Bhat-Nakshatri P, Martin DA, Goulet RJ Jr, Sledge GW Jr. Constitutive activation of NF-κB during pro- gression of breast cancer to hormone-independent growth.
Mol Cell Biol 1997;17:3629-3639.
12. Visconti R, Cerutti J, Battista S, et al. Expression of the neo- plastic phenotype by human thyroid carcinoma cell lines re- quires NF-κB p65 protein expression. Oncogene 1997;15:
1987-1994.
13. Sumitomo M, Tachibana M, Ozu C, et al. Induction of apop- tosis of cytokine-producing bladder cancer cells by ad- enovirus-mediated IκB overexpression. Hum Gene Ther 1999;10:37-47.
14. Yu LL, Yu HG, Yu JP, Luo HS, Xu XM, Li JH. Nuclear factor-κB p65 (RelA) transcription factor is constitutively ac- tivated in human colorectal carcinoma tissue. World J Gastroenterol 2004;10:3255-3260.
15. Thoms HC, Dunlop MG, Stark LA. p38-mediated inactivation of cyclin D1/cyclin-dependent kinase 4 stimulates nucleolar translocation of RelA and apoptosis in colorectal cancer cells.
Cancer Res 2007;67:1660-1669.
16. Sumbayev VV, Yasinska IM. Regulation of MAP kin- ase-dependent apoptotic pathway: implication of reactive oxy- gen and nitrogen species. Arch Biochem Biophys 2005;436:
406-412.
17. Bang YJ, Kwon JH, Kang SH, Kim JW, Yang YC. Increased
MAPK activity and MKP-1 overexpression in human gastric adenocarcinoma. Biochem Biophys Res Commun 1998;250:
43-47.
18. Coltella N, Rasola A, Nano E, et al. p38 MAPK turns hep- atocyte growth factor to a death signal that commits ovarian cancer cells to chemotherapy-induced apoptosis. Int J Cancer 2006;118:2981-2990.
19. Davidson B, Konstantinovsky S, Kleinberg L, et al. The mi- togen-activated protein kinases (MAPK) p38 and JNK are markers of tumor progression in breast carcinoma. Gynecol Oncol 2006;102:452-461.
20. Shimada K, Nakamura M, Ishida E, Konishi N. Molecular roles of MAP kinases and FADD phosphorylation in prostate cancer. Histol Histopathol 2006;21:415-422.
21. Summy JM, Trevino JG, Baker CH, Gallick GE. c-Src regu- lates constitutive and EGF-mediated VEGF expression in pan- creatic tumor cells through activation of phosphatidyl in- ositol-3 kinase and p38 MAPK. Pancreas 2005;31:263-274.
22. Lin N, Uchi H, Moroi Y, Fukiwake N, Dainichi T, Takeuchi S. Expression of the p38 MAPK, NF-kB and cyclin D1 in extramammary Paget's disease. J Dermatol Sci 2007;45:187- 192.
23. Motokura T, Arnold T. Cyclins and oncogenesis. Biochim Biophys Acta 1993;1155:63-78.
24. Hinds PW, Dowdy SF, Eaton EN, Arnold A, Weinberg RA.
Function of a human cyclin gene as a oncogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:709-713.
25. Hinz M, Krappmann D, Eichten A, Heder A, Scheidereit C, Strauss M. NF-κB function in growth control: regulation of cyclin D1 expression and G0/G1-to-S-phase transition. Mol Cell Biol 1999;19:2690-2698.
26. Siebenlist U, Franzoso G, Brown K. Structure, regulation and function of NF-κB. Annu Rev Cell Biol 1994;10:405-455.
27. Aranha M, Borralho P, Ravasco P, et al. NF-κB and apopto- sis in colorectal tumourigenesis. Eur J Clin Inv 2007;37:416- 424.
28. Akyurek N, Gonul II, Dursun A, Benekli M, Uner A, Yamac D. Increased expression of nuclear-kappaB/p50 correlates with disease progression and prognosis in colorectal adenocar- cinoma. Mod Pathol 2007;20(suppl):106A.
29. Zabel U, Henkel T, Silva M, Baeuerle P. Nuclear uptake con- trol of NF-κB by MAD-3, an IkB protein present in the nucleus. EMBO J 1993;12:210-211.
30. Scartozzi M, Bearzi I, Pierantoni C, et al. Nuclear factor-κB tumor expression predicts response and survival in irinote- can-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetux- imab-irinotecan therapy. J Clin Oncol 2007;25:3930-3935.
Lee SD, et al. Immunohistochemical Analysis in Premalignant Lesions and Carcinomas of the Colorectal Mucosa 367
31. Comes F, Matrone A, Lastella P, et al. A novel cell type-spe- cific role of p38α on the control of autophagy and cell death in colorectal cancer cells. Cell Death Diff 2007;14:
693-702.
32. Terada Y, Inoshita S, Nakashima O, Kuwahara M, Sasaki S, Marumo F. Regulation of cyclin D1 expression and cell cycle progression by mitogen-activated protein kinase cascade.
Kidney Int 1999;56:1258-1261.
