환경유해물질의 유해성평가를 위한 생물시험계 활용연구

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발 간 등 록 번 호 NIER-RP2013-133 11-1480523-001548-01

환경유해물질의 유해성평가를 위한 생물시험계 활용연구

- 시험난해물질의 수생태독성시험 적용연구(II) -

환경건강연구부 위해성평가연구과

류지성, 김수진, 심일섭, 김경태, 김지은, 류태권, 이재우, 신유진, 김평순, 이재안, 김필제

Studies on Biological Test System for Environmental Hazard Assessment;

Aquatic Toxicity Test of Difficult Substances(2-aminophenol)(II)

Jisung Ryu, Suejin Kim, Ilseob Shim, Kyungtae Kim, Jieun Kim, Taekwon Ryu, Jaewoo Lee, Yujin Shin, Pyeongsoon Kim,

Jaean Lee, Pilje Kim Risk Assessment Division

Environmental Health Research Department National Institute of Environmental Research

2013

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목 차❚

목 차

목차 ··· i

표목차 ··· ii

그림목차 ··· iii

Abstract ··· iv

Ⅰ. 서 론 ··· 1

Ⅱ. 연구내용 및 방법 1. 시험난해물질 물벼룩 급성독성시험 ··· 3

가. 시험물질 선정 ··· 3

나. 예비시험 ··· 4

다. 본시험 ··· 6

라. 중합물질 독성 추정을 위한 시험 ··· 7

2. 시험난해물질 물벼룩 급성독성시험 사례 조사 ··· 9

Ⅲ. 연구결과 및 고찰 1. 시험난해물질 물벼룩 급성독성시험 결과 ··· 11

가. 물벼룩 배지 선정을 위한 안정성 조사 ··· 11

나. pH 조건에 따른 안정성 조사 및 농도결정시험 ··· 14

다. 본시험 결과 ··· 16

라. 중합물질 독성 추정 시험 ··· 19

2. 일본 및 중국 시험결과와의 비교 ··· 24

3. 중합반응을 일으키는 시험난해물질 시험법(안) 제안 ··· 25

Ⅳ. 결 론 ··· 26

참고문헌··· 27

부록(시험난해물질 물벼룩 급성독성시험 사례) ··· 29

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목 차❚

ii

표 목 차

<Table 1> Conditions for 2-aminophenol analysis using HPLC ··· 5

<Table 2> Chemical substances included in M4, M7 and ISO media ···· 11

<Table 3> Measured concentration of 2-aminophenol in M4, M7 and ISO media at 0 and 48 hours ··· 13

<Table 4> Average concentrations of 2-aminophenol in ISO media with pH 6.5, 7.5 and 8.5 for 48 hours ··· 14

<Table 5> Change of 2-aminophenol concentration in definitive test for 48 hours ··· 17

<Table 6> Comparison of Daphnia magna acute toxicity according to pH condition and exposure initiation time after test solution preparation

··· 21

<Table 7> Comparison of Daphnia magna acute toxicity test of 2-aminophenol among Korea, China and Japan ··· 24

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목 차❚

그 림 목 차

<Figure 1> Polymerization reaction of 2-aminophenol in aqueous medium .

··· 3

<Figure 2> Flow chart of toxicity test for polymerized products.

··· 8

<Figure 3> Color change of 2-aminophenol solutions in M4, M7 and ISO media at 0 hour, 24 hours and 48 hours. ··· 13

<Figure 4> Color change of test media in definitive test for 24 hours.

··· 18

<Figure 5> Acute toxicity of 2-aminophenol for 24 and 48 hours in Daphnia magna. ···18

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Abstract❚

iv

Abstract

The most important elements for aquatic toxicity test are preparation of test solutions and maintenance of targeted test concentrations. In the OECD guidance, 'difficult substance' refers to the substance causing difficulties to satisfy the important elements for aquatic toxicity, and its properties include poor water solubility, volatility, unstability or adsorbability, etc.

Korea, China and Japan performed individual acute toxicity test of 2-aminophenol using Daphnia magna indigenous to each country.

2-aminophenol can be polymerized chemically and electrochemically in aqueous medium with catalysts such as transition metal complex.

Therefore, 2-aminophenol may be regarded as 'difficult substances'. The test results from three countries were shown somewhat differently.

Preliminary experiments were conducted in search for optimal conditions including test media and pH condition.

We suggested several improvements for Daphnia acute toxicity test for difficult substances such as 2-aminophenol in an expert meeting among 3 countries. Firstly, the most suitable test media should be selected to obtain optimal stability of a test substance in a test solution. In addition, analytical and toxicological assessments are required to evaluate by-products from polymerization of parent compounds, if necessary.

Recently, Good Laboratory Practice (GLP) test facilities which perform aquatic toxicity tests in Korea are experiencing technical problems, because the number of toxicity tests of difficult substances conducted by those facilities has significantly increased. This study provides the latest information about OECD case studies on several difficult substances. It is expected that this information will help GLP test facilities enhance their aquatic toxicity test techniques.

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Ⅰ. 서 론❚

Ⅰ. 서 론

환경 중 유해 화학물질이 수생 생물에 미치는 영향을 평가하기 위해서는 수생태 독성시험의 수행이 필요하며, 이러한 독성시험은 일반적으로 경제협력 개발기구(OECD), 미국 환경보호국(EPA), 국제표준화기구(ISO) 등에서 제시하고 있는 국제적으로 표준화된 시험지침을 따른다. 우리나라의 경우 산업용 화학물질에 대한 수생태 독성시험은 화학물질유해성시험방법(국립환경과학원 고시 제 2013-2호)에 있는 시험방법을 이용하고 있으며, 이 시험방법 역시 OECD 시험 지침을 근간으로 하고 있다.

일반적으로 물에 녹아 있는 화학물질은 수생 생물에 직접적인 영향을 미치게 되며, 이를 평가하기 위한 수생태 독성시험을 수행할 때 시험물질을 원하는 시험농도로 조제하는 것과 그 농도를 유지하는 것이 정확한 독성값 산출을 위해 매우 중요하다. 그러나 물질에 따라서는 물 또는 시험에 사용되는 생물 배양액에 잘 녹지 않거나, 쉽게 분해 또는 중합되거나 휘발되는 등 불안정하여 시험용액을 조제하거나 시험용액의 농도를 일정하게 유지하기 어려운 경우가 있다.

OECD에서는 이러한 문제점을 갖는 물질을 시험난해물질(difficult substances) 이라 하고 있다. OECD와 EPA 등에서 제시하고 있는 수생태 독성시험방법은 물에 잘 녹고 화학적으로 안정하며, 비휘발성인 순수 화학물질에 적합하도록 만들어져 있다. 따라서 불안정하거나, 휘발성이거나, 물에 잘 녹지 않는 물질 등에 이들 시험방법을 적용할 때 독성시험을 수행하고 독성값을 산출하는데 여러 문제에 직면하게 된다.

이러한 문제점을 해결하는 것이 수생태 독성시험을 수행하는 시험기관들의 가장 큰 숙제 중 하나가 되어 왔다. 앞서 언급한 OECD나 EPA의 독성시험지침 에서는 이러한 문제 해결방법에 대해 다루지 않고 있어 표준 시험지침만을 가지고는 만족할 만한 독성시험결과를 얻기 힘든 실정이다. 따라서 OECD 등에서는 시험난해물질을 대상으로 하는 수생태 독성시험에 도움을 주기 위해 별도의 지침을 마련하고 있다¹.

그러나 이러한 지침에 대한 국내 관련 시험기관의 인식이 깊지 않을 뿐만 아니라 이 지침에서도 세부적인 해결방법을 제시하지 못하고 있어 관련 정보의

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Ⅰ. 서 론❚

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공유와 전문가들의 끊임없는 문제해결을 위한 노력이 필요한 실정이다.

아울러 최근 한·중·일 화학물질관리 당국간 정책대화 등을 통해 한국, 중국 및 일본의 전문가들 사이에서 각국에서 생산되는 화학물질에 대한 안전성 시험자료의 신뢰성을 확보하여 궁극적으로는 시험자료의 상호인정을 꾀하고자 하는 움직임이 있어 왔다. 그중 하나의 공동 추진 과제로 시험난해물질에 대한 물벼룩 급성독성시험의 문제점들을 파악하고 이를 공동으로 해결해 나가는 사업을 2012년부터 수행하고 있다².

이에 본 연구는 수용액 상태에서 중합반응을 일으키는 2-아미노페놀 (2-aminophenol)을 대상으로 한·중·일 3국간 물벼룩 급성독성시험을 수행하고 국가별 시험조건 및 결과를 비교함으로써 시험난해물질의 물벼룩 급성독성시험 수행시 문제해결을 위한 사례로 활용하고자 하였다. 또한 OECD 대량생산 기존 화학물질의 초기위해성평가 자료 중 일부 시험난해물질에 대한 물벼룩 급성 독성시험 결과를 정리하여 향후 시험난해물질을 대상으로 한 수생태 독성시험의 문제점을 해결하는 기술적 정보를 제공하고자 하였다.

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Ⅱ. 연구내용 및 방법❚

Ⅱ. 연구내용 및 방법

1. 시험난해물질 물벼룩 급성독성시험

본 연구에서는 한·중·일 공동연구 차원에서 하나의 공통 시험난해물질을 선정하고 OECD 시험지침 202번에 따라 시험을 한 후 그 결과를 상호비교, 검토하기로 한 바에 따라 아래와 같이 물벼룩 급성독성시험을 수행하였다.

가. 시험물질 선정

2013년 5월 중국에서 개최된 한·중·일 전문가 회의를 거쳐 수용액 중에서 중합반응을 일으키는 2-아미노페놀(2-aminophenol, 순도 99 %, CAS No.

95-55-6, C6H7NO)을 시험물질로 선정하였다. 2-아미노페놀은 수용해도가 20 ℃ 에서 17 g/L로 비교적 잘 녹는 물질이며 상온에서 고상의 가루형태이다.

<Figure 1> Polymerization reaction of 2-aminophenol in aqueous medium.

여러 문헌에 따르면 2-아미노페놀을 포함한 아미노페놀 이성질체는 수용액 상에서 구리, 철 등 다양한 금속․중금속 산화물 및 염에 의해 화학적 또는 전기화학적으로 중합반응을 일으켜 중합체(polymer)를 형성하는 것으로 알려져 있으며 이는 수소이온농도지수(pH)에 따라서도 달라진다^3-7. 따라서 이 물질은 수생태 독성시험 수행 시 노출농도를 일정하게 맞추는 것이 어려우며 이로 인해 일정한 노출농도를 유지할 수 있는 최적의 조건을 찾아야 할 필요가 있다.

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또한 한·중·일 3국간 시험의 차이를 최소한으로 줄이기 위해 동일 제조사 (ACROS ORGANICS)의 시험물질을 사용하기로 하였다.

나. 예비시험

(1) 물벼룩 배지 선정을 위한 안정성 조사

시험은 OECD 시험지침 202번에 준하여 수행하였는데, 해당 시험방법은 물벼룩 배지 및 시험물질 조제시 사용하는 희석수로서 3 가지 배지(M4, M7 및 ISO 배지)를 제시하고 있다⁸. 이들 배지는 각각 무기염류, 금속․중금속 산화물 및 염 함량을 서로 다르게 포함하고 있는데 이러한 물질들이 2-아미노페놀 중합반응에 영향을 미칠 수 있다고 판단하고 세 가지 배지에서의 2-아미노페놀 안정성을 각각 조사하였다. 2-아미노페놀(순도 99 %) 0.25 g을 1 L의 M4, M7, ISO 배지에 각각 넣은 후 교반(500 rpm, 15 분)하여 배지별 표준원액(247.5 mg/L)을 조제 하였다. 기존 문헌에 보고된 독성값을 포함할 수 있는 농도범위를 정하여 시험 최저농도 0.196 mg/L와 최고농도 25.000 mg/L가 되도록 시험용액을 각각의 배지로 희석하여 조제하였다.

배지별로 조제된 0.196 mg/L 및 25.000 mg/L의 시험용액을 대상으로 안정성 시험을 수행하였으며, 안정성 시험 조건은 다음과 같다.

- 반복구 : 3 반복구

- 노출기간 및 노출방식 : 48 시간, 지수식 - 시험용액의 수온 : 20 ℃ ± 1 ℃(항온수조) - 시험용액의 부피 : 100 mL

- 시험용기 : 화학적으로 불활성인 유리 재질의 용기

배지별 각 농도군의 3 반복구 시험용액을 조제 직후와 조제 후 48 시간 경과 시점에 각각 1회 채취하여 농도 분석을 수행하였다. 채취한 각 시료를 공극 크기 0.45 μm의 필터로 여과한 후 고성능액체크로마토그래피(HPLC) (SURVEYOR, Thermo, USA)로 분석하였다. 분석조건은 Table 1과 같다.

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<Table 1> Conditions for 2-aminophenol analysis using HPLC

기기 및 장치

∙ HPLC : SURVEYOR (Thermo, USA)

∙ Ultra pure water system : Milli-Q (Millipore, Germany)

∙ 0.45 μm syringe filter (Lot No. : 6658654, Whatman, UK) 시약

∙ Acetonitrile (Lot No. : 0000033002, J.T. Baker, USA)

∙ Acetic acid (Lot No. : SHBC1632V, Sigma-Aldrich, USA)

∙ Distilled water (Milli-Q, Millipore, Germany) HPLC 조건

∙ Column : Zorbax Eclipse Plus C18 (4.6 × 150 nm, 3.5 μm, Agilent, USA)

∙ Mobile phase : Acetonitrile/D.W./Acetic acid = 10/90/0.1

∙ Flow rate : 0.9 mL/min

∙ Detector : PDA (272 nm)

∙ Injection volume : 25 μL

∙ Retention time : 1.9 ~ 2.1 min

(2) pH 조건 선정을 위한 안정성 조사

배지 내에서 pH 조건에 따른 시험물질의 안정성을 조사해 보았다. 1차 안정성 조사 결과 선정된 ISO 배지를 염산(HCl)과 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 6.5, 7.5 및 8.5가 되도록 각각 배지를 준비하였다. pH 조건에 따른 안정성 시험은 급성독성시험과 동일한 노출조건에서 안정성을 확인하기 위해 물벼룩을 넣은 후 시험물질의 농도 변화를 확인하였으며, 물벼룩 유영저해를 관찰하였다.

시험에 사용한 물벼룩(Daphnia magna)은 출생 후 24 시간 이내의 것으로 실험실 조건에서 최소한 3번 이상 새끼를 출산한 건강한 어미에서 나온 건강하고 균일한 어린개체를 선별하여 시험계로 선정하였다.

시험물질 표준원액 247.5 mg/L을 조제하고 ISO 배지로 희석하여 0.196, 0.391, 0.782, 1.563, 3.125, 6.250, 12.500 및 25.000 mg/L 농도군을 조제하였으며, 안정성 시험 조건은 다음과 같다.

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- 개체수 및 반복구 : 각 농도군당 5 마리(1 반복구) - 노출기간 및 노출방식 : 48 시간, 지수식

- 시험용액의 수온 : 20 ℃ ± 1 ℃(항온수조) - 시험용액의 부피 : 100 mL

위의 조건으로 하여 48 시간 동안 각 농도군에서 급성독성영향을 관찰하였다.

pH 별 각 농도군의 시험용액을 노출 직전, 노출 이후 24 시간 및 48 시간 경과 후의 3 시점에 각각 3회 채취하여 예비시험과 같은 방식으로 농도 분석을 수행하였다.

다. 본시험

본시험에 사용한 물벼룩은 출생 후 24 시간 이내의 것으로 실험실 조건에서 최소한 3번 이상 새끼를 출산한 건강한 어미에서 나온 건강하고 균일한 어린 개체를 선별하여 시험계로 선정하였다.

본시험의 시험용액은 2차례의 사전 안전성 시험을 통해 선정된 pH 7.5의 ISO 배지를 이용해 조제하였다. ISO 배지는 염산 및 수산화나트륨을 이용해 pH를 조정한 후, 24 시간 이상 폭기시켜 사용하였다. 단, 시험용액 조제 당일 배지의 pH를 7.5로 재보정하여 사용하였다.

2-아미노페놀(순도 99 %) 0.25 g을 1 L의 ISO 배지에 넣은 후 교반(500 rpm, 15 분)하여 표준원액(247.5 mg/L)을 조제하였다. 사전 안정성 시험 결과를 바탕 으로 시험농도를 0.700, 0.840, 1.008, 1.210 및 1.452 mg/L(공비 1.2)으로 설정 하였으며, 시험용액은 표준원액을 ISO 배지로 희석하여 조제하였다.

본시험의 조건은 다음과 같다.

- 개체수 및 반복구 : 각 농도군 당 20 마리(5 마리씩 4 반복구)

- 노출기간 및 노출방식 : 48 시간, 반지수식(24 시간 주기 시험용액 교체) - 시험기간 중 환경 조건

· 수온 : 19.9 ℃ ~ 20.3 ℃

· pH : 7.22 ~ 7.87

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· 용존산소농도 : 7.84 mg/L ~ 8.23 mg/L

· 경도 : 232 mg/L ~ 236 mg/L(as CaCO3)

· 알칼리도 : 44 mg/L ~ 48 mg/L - 시험용액의 부피 : 100 mL

물벼룩 급성독성(유영저해) 영향 관찰은 노출 후 24 시간 및 48 시간에 수행 하였다. 유영저해 판정은 시험용액을 가볍게 저어준 다음, 약 15 초간 관찰하여 물의 흐름을 벗어나지 못하거나 유영하지 못하는 개체를 영향 받은 것으로 간주 하였다. 유영저해 이외에 치사유무, 유영이상 및 형태이상 등의 일반증상도 관찰 하였다. 시험결과의 통계처리는 시험물질 노출 후 24 시간 및 48 시간의 반수영향 농도(EC50)를 프로빗(Probit) 방법으로 95 % 신뢰한계 수준에서 산출하였다. 통계 프로그램은 SPSS 12.0 K를 이용하였다.

각 농도군의 4 반복구 시험용액을 노출 직전, 시험용액의 교환 전후 및 노출 종료 후의 4 시점에 각각 1회 채취하여 시험물질의 농도 분석을 수행하였다.

라. 중합물질 독성 추정을 위한 시험

pH 조건선정을 위한 예비시험에서 pH 6.5, 7.5, 8.5로 조정한 ISO 배지를 이용하여 8개 농도의 시험용액을 두 군으로 조제하였다. 하나의 시험군은 시험 용액 조제 후 즉시 물벼룩 5 마리를 넣어 48 시간 동안 독성영향을 관찰하고, 다른 한 군은 48 시간 동안 방치한 후 물벼룩을 넣어 48 시간 동안 관찰하였다 (Figure 2).

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<Figure 2> Flow chart of toxicity test for polymerized products.

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2. 시험난해물질 물벼룩 급성독성시험 사례 조사

시험기관은 시험난해물질에 대한 물벼룩 급성독성시험을 수행할 때 관련 표준시험지침에서 제시되지 않은 세부적 절차로 인하여 여러 가지 어려움에 부딪히게 된다. 이를 해결하여 대상 시험물질의 생태독성을 평가하는데 보다 합당한 시험결과를 도출하기 위한 방안을 찾는 것이 시험기관의 경쟁력이라 할 수 있다. 따라서 국내 시험기관의 경쟁력 향상에 도움이 되고자 선진국에서 수행한 시험자료를 조사하여 물벼룩 급성독성시험을 수행할 때 용해도 및 안정성 조사, 이를 통해 얻은 정보를 바탕으로 수행하는 독성시험에 기술적으로 도움이 될 수 있는 내용들을 요약해 보았다.

이를 위해 OECD 대량생산 기존화학물질에 대한 초기위해성평가 자료를 조사 하였다⁹.

수생태 독성시험의 결과는 시험물질의 조제방법과 시험생물에 대한 노출 방식에 따라 다소 다르게 나타날 수 있다. 시험물질의 조제 시 특별한 사유 없이 유기용매나 분산제 등의 보조제를 사용하게 되면 시험물질의 용해도는 높일 수 있으나 실제 환경 중에서는 일어나기 어려운 조건으로 실제 환경 중 영향을 평가하는 데는 적합한 방법으로 볼 수 없다. 따라서 근래 화학물질의 환경 중 영향평가를 수행하기 위한 수생태 독성시험 경향은 최대한 이러한 보조제 사용을 지양하고 최대한 용해될 수 있는 조건을 확보하며 시험 중 농도를 유지할 수 있는 방법을 찾는 것이 무엇보다도 필요한 시험기술이라 할 수 있다.

선진국에서는 이러한 문제를 이미 인식하고 있었으며 OECD에서도 이러한 점을 고려하여 수생태 독성시험을 수행할 수 있도록 관련 지침을 제시하기도 하였다^1,10. 그러나 이러한 지침은 실제 시험경험이 많지 않으면 쉽게 습득하기 어려울 수 있다. 우리나라에서 환경부 유해화학물질관리법에 따른 화학물질유해성 심사에 필요한 수생태 독성시험을 수행하는 시험기관들의 시험경험은 외국에 비해 다양하지 못해 아직 이러한 인식을 반영한 시험을 원활히 수행해 오지 못하였다. 따라서 각 시험기관에서 많은 경험을 토대로 시험난해물질에 대한 시험기술을 확보 할 필요가 있다.

본 연구에서는 시험기관의 수생태 독성시험기술 향상을 위해 OECD 차원에서 작성한 수생태 독성시험자료를 바탕으로 일부 자료를 간략히 정리하여

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제공하였으며 이 정보가 시험기관들에게 시험난해물질에 대한 시험기술 확보 및 개발에 실마리를 얻는데 도움이 되기를 기대한다. 특히 본 연구에서 조사한 시험물질군은 비교적 가장 시험사례가 빈번한 난용성 물질을 중심으로 일부 가수분해성 물질 사례를 부록으로 정리하였다.

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Ⅲ. 연구결과 및 고찰❚

Ⅲ . 연구결과 및 고찰

1. 시험난해물질 물벼룩 급성독성시험 결과

가. 물벼룩 배지 선정을 위한 안정성 조사

물벼룩 배지에는 물벼룩이 생장하는데 도움이 되는 여러 무기영양소가 포함되어 있다. OECD 시험지침 202번에서 제시하고 있는 배지는 세 가지(M4, M7 및 ISO 배지)이며, M4와 M7 배지의 경우 기본 성분은 같으나 배지 중 일부 성분의 농도가 M4에서 높게 포함되어 있다. 세 가지 배지에 포함된 주요 물질의 종류는 Table 2와 같다. 사전실험 1에서는 이들 세 가지 배지 내에서 2-아미노페놀의 안정성을 비교하여 농도변화가 가장 작게 나타나는 배지를 본시험에 사용 하고자 하였다.

<Table 2> Chemical substances included in M4, M7 and ISO media

배지 성분물질

M4, M7

H3BO3, MnCl2․4H2O, LiCl, RbCl, SrCl2․6H2O, NaBr, Na2MoO4․2H2O, CuCl2․2H2O, ZnCl2, CoCl2․6H2O, KI, Na2SeO3, NH4VO3, Na2EDTA․2H2O, FeSO4․7H2O, CaCl2․2H2O, MgSO4․7H2O, KCl, NaHCO3, Na2SiO3․9H2O,

NaNO3, KH2PO4, K2HPO4,

Thiamine, hydrochloride, Cyanocobalamine, Biotine

ISO CaCl2․2H2O, MgSO4․7H2O, NaHCO3, KCl

각 배지는 Table 2에서 보는 바와 같이 여러 가지 무기염류와 금속이온이 들어 있다. 특히 M4와 M7의 경우 수용액 중에서 2-아미노페놀의 중합반응을 촉진시킬

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수 있는 촉매제로서의 역할이 가능한 여러 금속이온이 존재하고 있어 M4와 M7 배지가 ISO 배지보다 2-아미노페놀 농도유지가 어려울 것으로 추정되었다.

시험방법에 제시된 바와 같이 0.196 및 25.000 mg/L의 2-아미노페놀 농도조건에서 안정성 시험을 수행한 결과, Table 3과 같이 0.196 mg/L의 경우 0 시간, 48 시간 농도분석 결과 모든 배지에서 검출한계 이하로 나타났으며, 25.000 mg/L에서는 배지에 따라 차이가 있을 뿐만 아니라 시험용액 조제 직후 보다 48 시간 후의 측정 농도가 크게 낮은 것을 확인할 수 있었다. 세 가지 모든 배지에서 조제 직후 농도를 측정한 결과 설정농도의 80% 수준인 20 mg/L 정도였으나, M4, M7, ISO 배지에서 48 시간 후 측정 농도는 설정농도 대비 각각 37.7, 41.9, 73.6 %로 감소 하였다. 이러한 농도감소 정도는 M4 배지에서 가장 컸으며 그 다음으로 M7 배지였고, ISO 배지에서 가장 작았다(M4 > M7 > ISO). 이는 각 배지 중 성분 물질로 추정했던 바와 같이 M4 및 M7 배지 내에는 CuCl2·2H2O, ZnCl2, FeSO4·7H2O 등 중합반응을 일으킬 수 있는 2가 금속 이온들이 있으나 ISO 배지에는 없고, M7 배지보다 M4 배지용액에 2가 금속이온 농도가 높았기 때문으로 판단된다. 즉, M4 배지 내에서 2-아미노페놀 중합반응이 상대적으로 가장 많이 일어나고 ISO 배지 내에서 가장 적게 일어난 것으로 확인할 수 있었다.

이러한 결과는 시간 경과에 따른 실험용액의 색 변화 정도와도 일치하였다. 시간이 흐를수록 전체적으로 용액의 색이 진해졌으며 그 중에서도 색의 변화가 가장 큰 것이 M4 배지용액으로 조제한 2-아미노페놀 25.000 mg/L 농도군 이었다(Figure 3).

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<Table 3> Measured concentration of 2-aminophenol in M4, M7 and ISO media at 0 and 48 hours

MediaTest

Nominal Conc.

(mg/L)

Measured Conc.

(mg/L)

Mean^* Conc.

(mg/L)

Measured Conc./

Nominal Conc. (%)

M4

0.196 0 h ND^**

ND^** -

48 h ND^**

25.000 0 h 20.190

9.436 37.7

48 h 4.410

M7

0.196 0 h ND^**

ND^** -

48 h ND^**

25.000 0 h 20.660

10.474 41.9

48 h 5.310

ISO

0.196 0 h ND^**

ND^** -

48 h ND^**

25.000 0 h 20.530

18.399 73.6

48 h 16.490

* Geometric mean, ^** Not detected, ^*** Limit of detection(LOD) : 0.022 mg/L

**** Limit of quantitation(LOQ) : 0.066 mg/L

<Figure 3> Color change of 2-aminophenol solutions in M4, M7 and ISO media at 0 hour, 24 hours and 48 hours.

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14

나. pH 조건에 따른 안정성 조사 및 농도결정시험

배지선정을 위한 예비시험 결과 시험조건 내에서 2-아미노페놀 농도변화가 가장 적었던 ISO 배지를 본시험에 사용할 배지로 선정하였다. 2-아미노페놀의 중합 형태나 속도는 pH 조건에 따라 변하는 것으로 보고되어 있다³. 따라서 배지 내 pH 조건에 따른 시험물질의 안정성을 비교하고자 하였다. OECD 시험지침 202번에서 제시하고 있는 물벼룩 급성독성시험의 적정 pH 범위는 6 ~ 9로 이 범위 내에서 3 가지 pH 조건을 선정하였다.

ISO 배지를 시험시작 24 시간 전에 pH 6.5, 7.5, 8.5로 맞추어 안정화한 후 각 pH 용액별 2-아미노페놀을 0.196, 0.391, 0.782, 1.563, 3.125, 6.250, 12.500, 25.000 mg/L 되도록 조제하였다. 각 농도별 시험용액에 물벼룩을 각 5 마리씩 넣고 유영저해를 관찰하였으며, 0 시간(노출 직후), 24 시간, 48 시간 후 각각 배지 내 시험물질 농도를 분석하였다. 그 결과 pH 6.5와 7.5의 경우 실험기간 중 시험물질의 농도변화가 유사하였으나 8.5의 경우 상대적으로 농도 감소폭이 크게 나타났다(Table 4).

따라서 본시험에서는 시험물질의 안정성을 확보할 수 있는 pH 6.5와 pH 7.5 중 실제 환경과 유사한 pH 7.5 조건을 선택하여 시험을 수행하였다.

<Table 4> Average concentrations of 2-aminophenol in ISO media with pH 6.5, 7.5 and 8.5 for 48 hours

(a) at pH 6.5

Nominal

Conc. (mg/L) Measured^*

Conc. (mg/L) Measured Conc./

Nominal Conc. (%)

0.196 ND^** -

0.391 0.244 62.4

0.782 0.606 77.5

1.563 1.245 79.6

3.125 2.580 82.6

6.250 5.872 94.0

12.500 13.287 106.3

25.000 23.607 94.4

* Mean of measured concentrations at 0 h, 24 h and 48 h, ^**Not detected

*** LOD : 0.022 mg/L, ^**** LOQ : 0.066 mg/L

(20)

<Table 4> Average concentrations of 2-aminophenol in ISO media with pH 6.5, 7.5 and 8.5 for 48 hours(continued)

(b) at pH 7.5 Nominal

Nominal Conc. (%)

0.196 ND^** -

0.391 0.251 64.1

0.782 0.600 76.7

1.563 1.256 80.4

3.125 2.624 84.0

6.250 5.558 88.9

12.500 12.545 100.4

25.000 23.263 93.0

* Mean of measured concentrations at 0 h, 24 h and 48 h, ^** Not detected

*** LOD : 0.022 mg/L, ^**** LOQ : 0.066 mg/L

(c) at pH 8.5

Nominal

Nominal Conc. (%)

0.196 ND^** -

0.391 0.119 30.4

0.782 0.378 48.3

1.563 1.034 66.2

3.125 2.109 67.5

6.250 4.604 73.7

12.500 10.412 83.3

25.000 20.873 83.5

* Mean of measured concentrations at 0 h, 24 h and 48 h, ^** Not detected

*** LOD : 0.022 mg/L, ^**** LOQ : 0.066 mg/L

(21)

16

pH 7.5 조건에서 물벼룩 유영저해가 나타나지 않은 최고농도는 0.782 mg/L 이었고 100 % 유영저해가 나타난 최소농도는 3.125 mg/L이었다. 이 결과를 바탕으로 본시험은 유영저해가 전혀 관찰되지 않는 농도와 100 % 유영저해가 나타난 농도범위 이내에서 본시험의 노출농도를 결정하였다.

다. 본시험 결과

물벼룩 급성독성 본시험은 사전 안정성 시험의 결과를 바탕으로 선정한 pH 7.5 ISO 배지에서 2-아미노페놀 농도를 각각 0.700, 0.840, 1.008, 1.210 및 1.452 mg/L 로 하여 수행하였다. 또한 시험물질이 시험기간 동안 불안정할 수 있으므로 24 시간마다 시험용액을 교환하는 반지수식 시험을 채택하여 수행하였다.

시험물질은 노출 즉시, 시험용액 교환 직전 및 직후, 48 시간 후에 대하여 각각 시험용액 내 2-아미노페놀 농도를 측정하였다. 그 결과 모든 농도 군에서 농도 변화가 초기측정농도의 ± 20 % 범위 내를 유지하여 OECD 시험지침에서 제시하는 농도유지 조건을 만족하였다(Table 5). 따라서 사전실험을 통해 적용한 시험조건으로 시험기간 동안 시험난해물질인 2-아미노페놀의 안정성이 유지될 수 있음을 확인할 수 있었으며 시험기간 동안 시험용액의 색변화 역시 육안으로 관찰되지 않았다(Figure 4).

(22)

<Table 5> Change of 2-aminophenol concentration in definitive test for 48 hours

Nominal Conc.

(mg/L)

Measured Conc. (mg/L)

Conc.

Change (%)

Mean* Conc.

(mg/L)

Measured Conc./

Nominal Conc. (%) Control

0 h ND^** -

ND^** -

24 h (old) ND^** -

24 h (fresh) ND^** -

48 h (old) ND^** -

0.700

0 h 0.777 -

0.691 98.7

24 h (old) 0.641 -17.5

24 h (fresh) 0.777 -

48 h (old) 0.589 -24.2

0.840

0 h 0.921 -

0.836 99.5

24 h (old) 0.766 -16.8

24 h (fresh) 0.925 -

48 h (old) 0.749 -19.0

1.008

0 h 1.106 -

1.006 99.8

24 h (old) 0.974 -11.9

24 h (fresh) 1.077 -

48 h (old) 0.882 -18.1

1.210

0 h 1.245 -

1.216 100.5

24 h (old) 1.194 -4.1

24 h (fresh) 1.297 -

48 h (old) 1.135 -12.5

1.452

0 h 1.474 -

1.373 94.6

24 h (old) 1.347 -8.6

24 h (fresh) 1.420 -

48 h (old) 1.262 -11.1

* Mean of measured concentrations at 0 h, 24 h (old), 24 h (fresh) and 48 h (old)

** Not detected, ^*** LOD : 0.022 mg/L,^**** LOQ : 0.066 mg/L

(23)

18

<Figure 4> Color change of test media in definitive test for 24 hours.

본시험에서 시험농도에 따라 나타난 물벼룩 유영저해 결과를 바탕으로 48 시간 반수영향농도(48 h-EC50)를 산출한 결과 설정농도 기준 1.012 mg/L, 측정농도 기준 1.002 mg/L로 유사하게 나타났다. 24 시간 및 48 시간 기준 유영저해의 용량-반응 곡선은 Figure 5와 같다.

<Figure 5> Acute toxicity of 2-aminophenol for 24 and 48 hours in Daphnia magna.

(24)

라. 중합물질 독성 추정 시험

2-아미노페놀은 수용액 중에서 중합반응을 일으키는 것으로 알려져 있는데 시험과정 중 시험용액 내 2-아미노페놀의 농도 감소가 중합반응에 의한 것일 경우 2-아미노페놀 농도가 유지되는 경우보다 독성이 증가하거나 감소할 수 있다.

일반적으로 독성시험을 통해 생태계에 대한 영향을 평가할 때 평가대상물질의 시험농도를 일정하게 유지하는 것이 중요하지만 실제 환경 중 대상물질의 생태 독성학적 영향을 평가하기 위해서는 모화합물 뿐만 아니라 분해산물 또는 중합물질을 평가할 필요가 있다.

따라서 별도의 시험으로서 시험용액을 두 군으로 조제하고 하나의 시험군은 시험용액 조제 후 즉시 물벼룩 5 마리를 넣어 48 시간 동안 독성영향을 관찰 하고(조건1), 다른 시험군은 시험물질 모화합물 농도가 감소하도록 48 시간 방치한 후 물벼룩을 넣어 48 시간 동안 독성영향을 관찰하였다(조건 2). 각 pH 조건에 따른 독성영향은 아래와 같다.

▪ pH 6.5의 경우

(조건1) 24 시간 노출 이후 0.782, 1.563, 3.125, 6.250, 12.500 및 25.000 mg/L 농도군에서 각각 20, 60, 100, 100, 100, 100 %의 유영저해를 보였으며 48 시간 노출 이후에는 각각 20, 100, 100, 100, 100, 100 %의 유영저해를 나타냈다.

(조건2) 24 시간 노출 이후 0.782, 1.563, 3.125, 6.250, 12.500 및 25.000 mg/L 농도군에서 각각 0, 80, 100, 100, 100, 100 %의 유영저해를 보였고 48 시간 노출 이후에는 1.563 mg/L 이상 농도군에서 모두 100 %의 유영저해를 나타냈다.

(조건1) 시험용액 조제 직후 독성영향 관찰 결과, 24 시간 노출 이후 1.563, 3.125, 6.250, 12.500 및 25.000 mg/L 농도군에서 각각 20, 100, 100, 100, 100 %의 유영저해를 보였으며 48 시간 노출 이후에는 각각 80, 100, 100, 100, 100 %의 유영저해를 나타냈다.

(조건2) 24 시간 및 48 시간 노출 이후 1.563 mg/L 이상 농도군에서 모두 100 %

(25)

20

의 유영저해를 보였다. 1.563 mg/L 농도군에서 시험용액 조제 48 시간 후 독성시험군에서 독성이 증가한 것으로 나타났다.

(조건1) 24 시간 노출 이후 1.563, 3.125, 6.250, 12.500 및 25.000 mg/L 농도군에서 각각 60, 100, 100, 100, 100 %의 유영저해를 보였으며 48 시간 노출 이후에는 1.563 mg/L 이상의 모든 농도군에서 100 % 유영저해를 나타냈다.

(조건2) 24 시간 및 48 시간 노출이후 1.563 mg/L 이상 농도군에서 모두 100

% 유영저해를 나타내어 시험용액 조제 직후 독성영향 관찰 경우보다 1.563 mg/L 농도군에서 독성이 증가한 것으로 나타났으며, 아울러 저농도인 0.782 mg/L에서 20 % 유영저해가 나타나 이 역시 시험용액 조제 직후 보다 독성이 증가한 것으로 나타났다.

이 실험결과, pH 6.5를 제외하고는 pH 7.5와 8.5 조건에서 시험용액을 조제하고 시간이 경과한 용액에 물벼룩을 노출시켰을 때 독성영향이 증가한 것으로 나타났다. 이러한 독성영향의 증가는 시험물질 농도 감소정도와 관련이 있어 보인다. pH가 증가할수록 모화합물질인 2-아미노페놀의 농도 감소폭이 커짐에 따라 시험용액 조제 48 시간 후 시험군에서 유영저해율이 증가하는 것으로 나타났다(Table 6).

이러한 결과는 pH 증가에 따라 시험물질의 수용액 중 중합반응이 증가하여 중합체가 형성되고 이 중합체의 독성이 모화합물인 2-아미노페놀보다 더 강하기 때문인 것으로 추정된다. 2-아미노페놀의 산화반응은 촉매나 pH에 따라 달라지는 데 pH 7 ~ 10 범위 중 8에서 가장 빨리 일어나는 것으로 보고된 바 있다³. 이는 본 결과와 같이 pH 조건에 따른 2-아미노페놀 농도변화는 문헌상 보고된 바와 일치하는 것이다. 하지만 본 연구에서는 물벼룩 개체수가 적었고 분석에 의한 중합체 확인을 하지 못하여 이러한 결과를 입증하기엔 부족한 것으로 판단된다.

따라서 추후 관련 연구를 진행할 때 모화합물의 부산물(분해산물 또는 중합체)의 독성영향을 평가하기 위해서는 반복시험과 함께 부산물의 화학분석을 통해 시험물질 부산물과 독성영향과의 상관관계를 조사할 필요가 있다.

(26)

<Table 6> Comparison of Daphnia magna acute toxicity according to pH condition and exposure initiation time after test solution preparation

(a) pH 6.5

- Results of 48-hour exposure immediately after preparation of test solution

Nominal

Conc.(mg/L) Measured Conc.(mg/L)

Immobilised Daphnia (%)

24 h 48 h

Control - 0 0

0.196 ND^* 0 0

0.391 0.244 0 0

0.782 0.606 20 20

1.563 1.245 60 100

3.125 2.580 100 100

6.250 5.872 100 100

12.500 13.287 100 100

25.000 23.607 100 100

* Not detected, ^**LOD : 0.022 mg/L, ^**** LOQ : 0.066 mg/L

- Results of 48-hour exposure of the test solution after being left for 48 hours

Nominal

24 h 48 h

Control - 0 0

0.196 ND^* 0 0

0.391 ND^* 0 0

0.782 0.372 0 0

1.563 0.983 80 100

3.125 2.136 100 100

6.250 5.131 100 100

12.500 11.843 100 100

25.000 19.585 100 100

* Not detected, ^**LOD : 0.022 mg/L, ^*** LOQ : 0.066 mg/L

(27)

22

<Table 6> Comparison of Daphnia magna acute toxicity according to pH condition and exposure initiation time after test solution preparation (continued)

(b) pH 7.5

Nominal

24 h 48 h

Control - 0 0

0.196 ND^* 0 0

0.391 0.251 0 0

0.782 0.600 0 0

1.563 1.256 20 80

3.125 2.624 100 100

6.250 5.558 100 100

12.500 12.545 100 100

25.000 23.263 100 100

Nominal

24 h 48 h

Control - 0 0

0.196 ND^* 0 0

0.391 ND^* 0 0

0.782 0.449 0 0

1.563 1.020 100 100

3.125 2.243 100 100

6.250 4.592 100 100

12.500 10.455 100 100

25.000 16.075 100 100

* Not detected^* Not detected, ^** LOD : 0.022 mg/L, ^**** LOQ : 0.066 mg/L

(28)

<Table 6> Comparison of Daphnia magna acute toxicity according to pH condition and exposure initiation time after test solution preparation (continued)

(c) pH 8.5

Nominal

24 h 48 h

Control - 0 0

0.196 ND^* 0 0

0.391 0.119 0 0

0.782 0.378 0 0

1.563 1.034 60 100

3.125 2.109 100 100

6.250 4.604 100 100

12.500 10.412 100 100

25.000 20.873 100 100

Nominal

24 h 48 h

Control - 0 0

0.196 ND^* 0 0

0.391 ND^* 0 0

0.782 ND^* 0 20

1.563 0.586 100 100

3.125 1.116 100 100

6.250 2.278 100 100

12.500 4.685 100 100

25.000 9.965 100 100

* Not detected, ^** LOD : 0.022 mg/L, ^**** LOQ : 0.066 mg/L

(29)

24

2. 일본 및 중국 시험결과와의 비교

한·중·일간 2-아미노페놀에 대한 물벼룩 급성독성시험의 주요 내용을 비교한 결과, 한국과 중국의 독성결과가 유사하게 나타났다. 두 시험의 경우 시험기간 중 시험물질의 농도를 일정하게 유지하였으며, 반수영향농도의 결과 값도 비슷하게 나타났다. 다만 중국의 경우 관련 기초자료를 공개하지 않아 신뢰성 확보 여부 확인이 어려웠다. 일본의 경우 시험자료를 전문가들에게 공개하여 자료의 신뢰성은 확보하였으나 시험기간 중 시험물질의 농도를 일정하게 유지하지 못하여 반수영향농도에 있어서 차이를 나타내었다(Table 7).

중국과 일본은 물벼룩 배지를 OECD에서 제안하고 있는 M4를 사용하였고 우리나라는 사전안정성조사 결과를 근거로 ISO 배지를 선정하였다. 추후 한·중·일 전문가의 지속적인 정보공유를 통해 세부적인 시험자료를 확보하기로 하였으며 시험자료를 세부적으로 검토하여 물벼룩 급성독성시험의 기술적 문제점들을 함께 해결할 예정이다.

<Table 7> Comparison of Daphnia magna acute toxicity test of 2-aminophenol among Korea, China and Japan

Korea China Japan

Test method OECD test

guideline 202 OECD test

guideline 202 OECD test guideline 202

GLP compliance ○

△ (Not GLP test facility, but GLP

compliance)

○

24 h-EC50

(Potassium dichromate) 1.5 mg/L No data available 1.0 mg/L Exposure system semi-static

(renewal per 24 h) semi-static

(renewal per 24 h) semi-static (renewal per 24 h)

Test media ISO media OECD M4 media OECD M4 media

Stability of test solutions

stable (maintained within ± 20 % of nominal conc.)

stable (maintained within ± 20 % of

nominal conc.) instable Sharing of chemical

analysis data ○ × ○

48 h-EC50

(2-aminophenol) 1.0 mg/L 1.1 mg/L 0.6 mg/L

(30)

3. 중합반응을 일으키는 시험난해물질 시험법(안) 제안

2013년 11월 일본에서 개최된 제7차 한·중·일 화학물질관리정책대화 전문가 회의에서 각국 전문가들이 각국에서 진행한 2-아미노페놀의 물벼룩 급성독성시험 결과를 제시하고 기술적 해결점을 모색하고자 하였다. 우리나라에서는 금번 연구결과를 토대로 아래의 사항을 제시하였다.

- 시험계획 수립단계 이전, 시험물질의 안정성에 관한 문헌 및 시험자료 등 충분한 자료를 확보하여 검토할 필요 있음

- 시험물질 농도 유지를 위한 시험조건(예; 배지종류 등) 도출에 필요한 충분한 사전 예비시험이 필요함

- 시험자료를 평가하는 부서의 요구가 있는 경우 시험물질 모체의 중합에 의한 중합물질 분석자료와 독성자료를 함께 생산할 필요가 있을 것으로 판단됨

이와 같이 제시한 사항에 대해서 중국과 일본 전문가 모두 동의하였으며 매우 의미 있는 제안인 것으로 의견을 모았다. 다만 일본의 한 전문가는 실제 환경 중 영향을 평가하기 위해서는 시험물질의 농도를 일정하게 유지하는 것보다 실제 환경과 가깝게 농도가 변화하는 그대로에 대한 영향을 평가하는 것도 의미가 있을 것이라고 제안하였다.

한·중·일 3국 모두 OECD 시험지침이라는 표준화된 시험방법을 사용하고 있으나 화학물질을 관리하는 각국의 해당 당국이 평가하는 관점에 따라 다소 요구하는 내용은 달라질 수 있다. 따라서 시험기관들은 이러한 요구를 충족할 수 있는 다양한 기술적 능력을 갖출 필요가 있다. 한·중·일 공동연구는 이러한 국가적 차이가 있을 수 있음에도 불구하고 3국간 차이를 좁히고 다양한 요구에 만족할 수 있는 시험방법의 기술발전을 위해 지속적으로 노력할 계획이다.

(31)

Ⅳ. 결 론❚

26

Ⅳ . 결 론

본 연구는 한·중·일 공동연구의 일환으로 수행되었으며 시험난해물질의 수생태 독성시험 수행 과정 및 결과 해석에 있어서 어려움을 해소하고, 시험기관이 일관되게 시험을 수행할 수 있는 기술적 정보를 제시하고자 하였다. 시험난해 물 질 인 2-아미노페놀을 대상으로 물벼룩 급성독성시험을 수행하였으며 주요 연구 결과는 다 음 과 같 다.

1. 2-아미노페놀의 물벼룩 급성독성시험 수행 결과, 48 시간 반수영향농도 (48 h-EC50)는 1.0 mg/L로 나타났으며 이와 같이 수중에서 중합반응을 일으키는 등 시험난해물질의 경우 독성시험 수행 중 안정성에 관한 충분한 자료를 검토·확보해야 한다.

2. 시험난해물질의 물벼룩 급성독성시험 등 수생태 독성시험 기간 동안 일정한 시험물질 농도 유지를 위하여 적합한 시험배지 및 pH 조건 선정, 시험물질 조제 방법, 시험물질 시험배지 교환주기 등을 사전에 확인할 필요가 있다.

3. 시험용액 중에서 중합을 일으킬 가능성이 있는 물질은 평가기관이나 규제부서에서 중합반응으로 생성되는 부산물의 종류나 양에 대한 분석 자료를 요구받을 수 있으므로 독성자료와 함께 생산할 필요가 있을 것으로 판단된다.

이러한 사항은 2013년도 한·중·일 화학물질 정책대화 전문가 회의에서 도출된 내용이며 향후 지속적인 3국간 정보교류와 공동 연구결과를 바탕으로 수생태 독성시험의 국가간 조화를 이루고 아울러 국내 시험기관의 수생태 독성시험 기술능력을 향상시키는 데 기여할 수 있을 것으로 판단된다. 향후 시험난해물질의 수생태 독성시험과 관련한 지침서를 개발, 국내 시험기관에 배포할 예정이다.

(32)

참 고 문 헌 ❚

참 고 문 헌

1. OECD, OECD Series on Testing and Assessment, Number 23: Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures, 2000.

2. 이재안, 류지성, 김경태, 류태권, 이재우, 김지은, 신유진, 김평순, 김필제, 환경유해물질의 유해성평가를 위한 생물시험계 활용연구 - 시험난해물질의 수 생태독성시험 적용연구(I) -, 국립환경과학원, 2012.

3. El-Khalafy, S.H., and Hassanein, M., Oxidation of 2-aminophenol with molecular oxygen and hydrogen peroxide catalyzed by water soluble metalloporphyrins, Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2012, 363-364, 148-152.

4. Horváth, T., Kaizer, J., and Speier, G., Functional phenoxazinone synthase models Kinetic studies on the copper-catalyzed oxygenation of 2-aminophenol, Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2004, 215, 9-15.

5. Kennedy, B., Glidle, A., and Cunnane, V.J., A study of the oxidation and polymerisation of meta substituted phenol and aniline derivatives, Journal of Electroanalytical Chemistry, 2007, 608, 22-30.

6. Mandlimath, T.R. and Gopal, B., Catalytic activity of first row transition metal oxides in the conversion of p-nitrophenol to p-aminophenol, Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2011, 350, 9-15.

7. Zhang, A.Q., Cui, C.Q., Chen, Y.Z., and Lee, J.Y., Synthesis and electrochemic properties of poly-o-aminophenol, Journal of Electroanalytical Chemistry, 1994, 373, 115-121.

8. OECD, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 202:

Daphnia sp., acute immobilisation test, 2004.

(33)

참 고 문 헌 ❚

28 9. OECD Existing Chemicals Database

http://webnet.oecd.org/hpv/ui/SponsoredChemicals.aspx

10. OECD, OECD Series On Testing And Assessment, Number 27:

Guidance document on the use of the harmonised system for the classification of chemicals which are hazardous for the aquatic environment, 2001.

(34)

부 록 ❚

< 부 록 >

시험난해물질 물벼룩 급성독성시험 사례

(OECD 대량생산 기존화학물질 초기위해성평가 자료)

4,4‘-Oxybis(benzenesulfonyl hydrazide) (CAS No. 80-51-3)

I. 수용해도 : 62.5 mg/L(20 ℃)

□ 방법개요

○ 증류수에서 진탕(shaking)하고 3 일 동안 평형상태 확인 후 시험용액을 원심 분리하고 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 농도 분석

□ 물질의 특성

○ 난용성 : 희석수와 유기용매에 대한 용해성이 비교적 높지 않음

II. 안정성

□ 방법개요

○ OECD 시험지침 111번(pH에 따른 가수분해)

□ 반감기 : 3 시간 ~ 4 시간

○ 9.33 mg/L의 시험용액을 pH 4, 7, 9 완충 용액에 준비한 후 HPLC를 이용 하여 농도를 측정함

20 ℃ 25 ℃ 30 ℃

pH 4 23.1 h 9.2 h 3.76 h

pH 7 17.2 h 7.9 h 3.72 h

pH 9 13.9 h 5.8 h 2.46 h

III. 물벼룩 급성독성시험

<사례 1. - 대한민국>

□ 방법개요

○ OECD 시험지침 202번(지수식)

(35)

부 록 ❚

30

□ 세부 시험방법

○ 노출준비

- 노출용액 준비 : 직접 첨가법(표준원액을 희석수에 직접 첨가)

- 표준원액(stock solution) 준비 : 시험희석수(M4 배지)에 직접 첨가 후 균질화하여 사용

○ 특이사항 : 1 mg/L(M4 배지) 시험용액의 반감기는 4 시간(48 시간 후 측정농도는 설정농도의 3.43 % ~ 16.7 %로 측정되어 설정농도로 결과를 산출함)

□ 시험결과(반수영향농도)

○ 24 h-EC50 : 23 mg/L 48 h-EC50 : 15 mg/L

<사례 2. - 일본>

□ 방법개요

○ OECD 시험지침 202번(반지수식)

○ 노출준비

- 노출용액 준비 : 준비한 표준원액을 M4 배지로 희석하였음

- 표준원액 준비 : DMF (dimethylformamide)에 200,000 mg/L 농도로 준비

○ 특이사항 : 노출 0 시간의 측정농도는 설정농도의 81 % ~ 87 %, 24 시간 후에는 33 % ~ 39 %로 측정되었음

○ 분석방법

- 0 시간, 24 시간에 노출농도를 HPLC를 이용하여 분석

□ 시험결과 : 측정농도의 기하평균으로 프로빗(probit) 통계를 사용하여 결과 산출

○ 24 h-EC50 : 9.8 mg/L 48 h-EC50 : 2.9 mg/L

(36)

부 록 ❚

Bis(2-ethylhexyl) terephthalate (CAS No. 6422-86-2)

I. 수용해도 : 0.4 μg/L(22.5 ℃)

□ 방법개요

○ 탈이온 증류수(22.5 ℃)에서 저속교반법(slow-stir method)을 이용

○ 기존 연구는 이보다 높음

(0.35 mg/L : 우물물, 0.61 mg/L : 바닷물, 1.5 mg/L : 탈이온수, 모두 25 ℃ 조건) - 기존 결과가 높게 나온 이유는 진탕플라스크(shake-flask) 방법을 사용했음

○ 분석방법 : 고체상추출법(SPE)을 이용하여 추출하였으며 기체크로마토그래피 /질량분석법(GC/MS)를 이용하여 분석함

○ 소수성 물질로 물에 난용성임

II. 안정성 : 반감기– 1.4 년(pH 7), 51 일(pH 8)

□ 방법개요

○ Epiwin hydrowin model 사용

<사례. - 미국>

□ 방법개요

○ 노출준비

- 노출용액 준비 : 시험개시 24 시간 전에 교반법을 이용하여 준비 - 표준원액 준비 : DMF에 시험물질을 용해 후 배지에 첨가 - 노출설정농도 : 2.0 μg/L

(37)

부 록 ❚

32

○ 분석방법

- 시험시작 및 종료시점에 노출농도 분석 - SPE, GC/MS를 이용하여 농도를 측정하였음

□ 시험결과 : 측정농도를 이용하여 산출함, 통계는 사용하지 않음

○ 48 h-EC50 : > 1.4 μg/L 48 h-NOEC : ≥ 1.4 μg/L

(38)

부 록 ❚

Tridecylamine, branched and linear (CAS No. 86089-17-0)

I. 수용해도 : 0.04 g/L(20 ℃)

온도 (℃) Mass-% g/L

20 0.004 0.04

40 0.003 0.03

60 0.004 0.04

80 0.005 0.05

○ 물에 난용성임

II. 안정성

□ 물 환경 pH 조건에서는 가수분해 되지 않음

<사례 1. - 독일>

□ 방법개요

○ EPA OTS 797.1300, OECD 시험지침 202번(반지수식)

○ 노출준비

- 노출용액 준비 : ISO 배지로 희석하였음

- 노출용기는 유리에 시험물질이 흡착되는 것을 방지하기 위해 표면을 dichlorodimethylsilane으로 코팅하고 시험전 시험물질에 용기를 24 시간 동안 담군 후 사용함

- 표준원액 준비 : ISO 배지에 시험물질을 용해시켰음. 5 분 동안 초음파분쇄 (ultrasonication) 한 후 22 시간 동안 교반함

(39)

부 록 ❚

34

○ 분석방법

- 0, 24, 48 시간에 대조군, 저·중·고농도를 GC-MS를 이용하여 분석

○ 통계 : 프로빗 통계법

○ 노출설정농도 : 대조군, 0.0039, 0.0078, 0.0157, 0.0313, 0.0625, 0.125, 0.250 mg/L

□ 시험결과

○ 측정 농도값

- 24 h-EC50 : 0.042 mg/L

48 h-EC50 : 0.015(0.011 ~ 0.019) mg/L

○ 설정 농도값

- 24 h-EC50 : 0.064 mg/L

48 h-EC50 : 0.025(0.020 ~ 0.032) mg/L

<사례 2. - 독일>

□ 방법개요

○ 독일표준협회 DIN 38412 L11, EC L251/155(지수식)

○ 노출준비

- 노출용액 준비 : “KS”, pH 8.0

- 표준원액 준비 : 시험 배지에 시험물질을 용해시켜 준비, pH 7.9

○ 분석방법 : 보고되지 않음

○ 통계 : 프로빗 통계법

○ 노출설정농도 : 대조군, 0.015, 0.020, 0.028, 0.040, 0.056, 0.078, 0.109, 0.153, 0.214, 0.300 mg/L

□ 시험결과

- 24 h-EC50 : 0.185 mg/L 48 h-EC50 : 0.050 mg/L

(40)

부 록 ❚

<사례 3. - 독일>

□ 방법개요

○ 독일표준협회 DIN 38415 part 11(지수식)

○ 노출준비

- 노출용액 준비 : 독일표준협회 DIN 328412 part 11에 따라 조제 - 표준원액 준비 : 증류수에 100 mg/L로 준비

○ 분석방법 : 보고되지 않음(화학분석을 통해 안정성을 확인함)

○ 통계 : Spearman-Karber

○ 노출설정농도 : 대조군, 0.1, 0.18, 0.32, 0.58, 1.0, 1.8, 3.2, 5.8, 10 mg/L

□ 시험결과

- 24 h-EC50 : 1.1(0.9 ~ 1.4) mg/L 48 h-EC50 : 0.7(0.5 ~ 0.9) mg/L

<사례 4. - 독일>

□ 방법개요

○ 노출준비

- 노출용액 준비 : M4 배지로 희석

- 표준원액 준비 : 시험배지에 10 mg/L 농도로 조제 후 24 시간 동안 교반

○ 통계 : 보고되지 않음

○ 노출설정농도 : 대조군, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 mg/L

□ 시험결과

○ 48h EC50 : 0.525 mg/L

(41)

부 록 ❚

36

<사례 5. - 독일>

□ 방법개요

○ 노출준비

- 노출용액 준비 : 천연 연못물

- 표준원액 준비 : 시험배지에 10 mg/L 농도로 조제 후 24 시간 동안 교반

○ 노출설정농도 : 대조군, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 mg/L

□ 시험결과

○ 48h EC50 : 0.455 mg/L

<사례 6. - 독일>

□ 방법개요

○ 노출준비

- 노출용액 준비 : 2.5 mg/L humic acid-Na salt가 첨가된 M4 배지 - 표준원액 준비 : 시험배지에 10 mg/L 농도로 조제 후 24 시간 동안 교반

○ 노출설정농도 : 대조군, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 mg/L

□ 시험결과

○ 48h EC50 : 0.654 mg/L

(42)

부 록 ❚

Dibutyltin dilaurate (CAS No. 77-58-7)

I. 수용해도 : < 0.1 mg/L(25 ℃)

II. 안정성

□ 반감기(< 38 분 at pH 7)

○ 분석방법

- DBTL (Dibutyltin dilaurate)의 용해도 및 가수분해율을 평가하기 위한 방법은 없음 - 용액내의 주석농도와 기타물질을 확인하기 위해 sodium tetraethylborate

유도체화 및 GC-MS를 이용해 정량분석함

- 액체크로마토그래피/질량분석법/질량분석법(LC/MS/MS) 및 액체 크로마토그래피/질량분석법(LC/MS)을 이용하여 용액내의 실제 존재하는 물질에 대해 정성분석을 수행

<사례. - 미국>

□ 방법개요

○ OECD 시험지침 202번, EU EEC 2(지수식)

○ 노출용액 준비 : 수돗물

○ 표준원액 준비 : 수돗물에 시험물질을 100 mg/L 농도로 용해시켰음 24 시간 동안 교반 후 여과하여 희석 사용함

○ 분석방법

- 총 주석 함량 : 유도결합플라스마/질량분석법(ICP-MS) 분석, 포화용액의 DBTL 농도(분자식을 기본으로 총유기탄소(TOC) 결과로부터 계산)

○ 통계 : Spearman-Karber method

(43)

부 록 ❚

38

○ 노출설정농도

- 산술평균을 이용한 예측 농도

: 포화용액(3.8 mg/L)을 준비하여 1:2(1.9 mg/L), 1:4(1.0 mg/L), 1:8(0.5 mg/L) 비율로 희석하여 노출

- 기하평균을 이용한 예측 농도

: 포화용액(3.35 mg/L)을 준비하여 1:2(1.68 mg/L), 1:4(0.84 mg/L), 1:8(0.42 mg/L) 비율로 희석하여 노출

□ 시험결과

○ TOC 분석을 통한 측정된 농도의 기하평균으로 산출된 예측값 - 48 h-EC50 : 1.9 mg/L ~ 3.8 mg/L

○ 주석 분석을 기반으로 한 산술평균 추정값 - 48 h-EC50 : < 1 mg/L

○ 기하 평균 농도를 이용하여 통계분석한 독성값 - 48 h-EC50 : 2.52 mg/L

(44)

부 록 ❚

Dioctyltin dichloride (CAS No. 3542-36-7)

I. 수용해도

<사례 1. - 0.24 mg/L ~ 0.28 mg/L(25 ℃)>

□ 방법개요

○ 100 % water-soluble fraction (WSF) 이용

○ GC/MS 측정

○ DOTC (dioctyltin dichloride)는 물에서 안정한 alkyltin moiety, DOT (dioctyltin) 및 불안정한 염화물로 분해됨

○ DOT와 염화물은 물과 반응하여 염산과 DOTO (dioctyltin oxide)를 형성

<사례 2. - 1.6 mg/L(20 ℃, pH 3.2 ~ 3.6)>

□ 방법개요

○ OECD 시험지침 105번

○ 컬럼용출법 사용

○ 다양한 알킬화합물, 수용액 내의 반응 부산물 및 합성으로 인한 불순물은 모화합물과 함께 수용액 내에 존재함

II. 안정성

○ 유기주석 화학물의 낮은 수용해도 및 가수분해성으로 인해 수용액 내 유기주석 측정에 어려움이 있어서 대체법을 사용함

○ DOTC와 DOT(2-EHMA) (dioctyltin bis(2-ethylhexyl mercaptoacetate))의 가수분해 속도 측정으로 대체하여 평가함

○ 125 ng Sn/mL 농도의 DOTC는 약 10분 이내에 DOTO로 변환됨

(45)

부 록 ❚

40 III. 물벼룩 급성독성시험

<사례 1. - 네덜란드>

□ 방법개요

○ OECD 시험지침 202번, EU 시험지침 C.2

○ 노출준비

- 표준원액 준비 : 증류수 사용 - WSF법으로 표준용액 조제

□ 시험결과 :

○ 시험기간 중 평균 DOT농도는 설정농도의 95.5 % 정도였음

○ 측정된 농도값 : 0.28 mg DOTC/L ± 0.035 mg/L

○ 48 h-EC50 > 100 % WSF(> 0.28 mg DOTC/L), NOEC ≥ 100 % WSF(> 0.28 mg DOTC/L)

<사례 2. - 스위스>

□ 방법개요

○ 노출준비

- 100 % 포화용액 조제: 증류수에 100 mg/L의 농도로 48시간 교반 후 필터함 - 100 % 포화용액으로 100, 58, 32, 18, 10 %로 희석하여 노출

□ 시험결과 :

○ 측정 평균 농도값 : 0.0045 mg/L as DOTC(100 % 포화용액)

○ 100 % 포화용액에서도 독성영향이 관찰되지 않음

○ 측정된 농도값 : 0.28 mg DOTC/L ± 0.035 mg/L

○ 24 h-EC50 > 0.005 mg/L, NOEC ≥ 0.005 mg/L

(46)

부 록 ❚

Dioctyltin bis(2-ethylhexyl mercaptoacetate) (CAS No. 15571-58-1)

I. 수용해도 : < 0.1 mg/L

□ 방법개요

○ 보고되지 않음

○ 난용성물질

○ DOT(2-EHMA) (Dioctyltin bis(2-ethylhexyl mercaptoacetate))는 빠르게 가수분해하여(10분이내) DOTO (dioctyltin oxide)를 형성하고 thioester 리간드(2-EHMA) 배출

II. 안정성

○ DOT(2-EHMA)는 빠르게 가수분해하여(10분 이내) DOTO를 형성하며 thioester 리간드, EHTG (2-ethylhexyl thioglycolate) 배출

○ DOTC와 DOT(2-EHMA)의 가수분해 속도 측정으로 대체하여 평가함

○ 125 ng Sn/mL 농도의 DOTC는 약 10분 이내에 DOTO로 변환됨

<사례 1. - 독일>

□ 방법개요

○ EU 시험지침 C.2

○ 노출준비 - 표준원액 준비

시험물질 1 g을 96 % DMF와 4 % Tween 80의 용액에 녹임. 이 혼합물 0.2 g을 취하여 최종농도 100 mg/L가 되도록 증류수에 조제

(47)

부 록 ❚

42

○ 노출설정농도(측정농도)

0.1(0.07), 0.18(0.16), 0.32(0.19), 0.58(0.31), 1.0(0.62), 1.8(1.43) mg/L

□ 시험결과 :

○ 48 h-EC50 : 0.17(0.14 ~ 0.20) mg DOT(2-EMHA)/L NOEC : 0.07 mg DOT(2-EMHA)/L

<사례 2. - 독일>

□ 방법개요

○ 노출준비

- 표준원액 준비 : 증류수에 100 mg/L의 농도로 만들어 48 시간 교반 후, 2번 여과

- 100 % 포화용액으로 100, 58, 32, 18, 10 %로 희석하여 노출

□ 시험결과 :

○ 측정 평균 농도값 : 0.06 mg DOT(2-EHMA)/L (100 % 포화용액)

○ 24 h-EC50 > 0.06 mg/L, NOEC ≥ 0.06 mg/L

(48)

부 록 ❚

Iso-octyl mercaptoacetate (CAS No. 25103-09-7)

I. 수용해도 : 10.6 mg/L(20 ℃)

□ 방법개요

○ 시험물질 : IOTG (iso-octyl thioglycolate)

○ 탈이온수에 실온, 빛차단, 물중탕으로 30 ℃에서 교반하여 포화용액을 만듦

○ GC/MS를 이용하여 분석함

○ 포화용액은 중성

II. 안정성 : 반감기 : 7.2 h(25 ℃, pH 7)

□ 방법개요

○ IOTG는 가수분해적으로 불안정함

○ EHTG (2-ethylhexyl thioglycolate)가 가수분해되면 C8 alcohol의 혼합물이 생성 (주생성물: methylheptanol, dimethylhexanol)

<사례 1. - 프랑스>

□ 방법개요

○ 모화합물질과 가수분해/산화생성물의 혼합물에 노출(가수분해물질)

○ 표준원액 준비 : ISO배지 1 L에 10 mg 넣고 24 시간 혼합

○ 노출 설정농도 : 대조군, 0.09, 0.2, 0.43, 0.95, 2.08 mg/L

□ 시험결과 : 설정농도를 이용하여 산출함

(49)

부 록 ❚

44

○ 48 h-EC50 : 0.39(0.28 ~ 0.53) mg/L

<사례 2. - 미국>

□ 방법개요

○ 보고되지 않음

○ 모화합물질 가수분해/산화생성물의 혼합물에 노출됨(가수분해물질임)

○ 노출설정농도 : 0. 0.32, 0.56, 1.0, 1.8, 3.2, 5.6 mg/L

□ 시험결과 : 설정농도를 이용하여 산출함

○ 48 h-LC50 : 2.4 mg/L

(50)

부 록 ❚

Trichlorooctylstannane (CAS No. 3091-25-6)

I. 수용해도 : 0.33 mg/L(20 ℃, pH 3.3 ~ 3.5)

□ 방법개요

○ 시험조건 : 컬럼용출법

○ 물에 난용성임

II. 안정성

○ MOTC (Mono-octyltin trichloride)의 안정성에 대한 실험값은 없음

○ 유기주석의 자료를 바탕으로 MOTC는 수 분 ~ 수 시간 안에 가수분해되고, MOT (alkyltin moiety)는 가수분해적으로 안정하다고 예측

<사례. - 미국>

□ 방법개요

○ OECD 시험지침 202번, EU 시험지침 C.2

○ 포화용액 준비 : 수돗물에 100 mg/L 농도가 되도록 시험물질을 녹여 24 시간 교반 후 여과

○ 광주기 : 12 h/12 h(명/암)

□ 시험결과 :

○ 측정 평균 농도값 < 1 mg MOTC/L(100 % 포화용액)

○ 48 h-EC50 > 0.33 mg MOTC/L