2013년 11월 일본에서 개최된 제7차 한·중·일 화학물질관리정책대화 전문가 회의에서 각국 전문가들이 각국에서 진행한 2-아미노페놀의 물벼룩 급성독성시험 결과를 제시하고 기술적 해결점을 모색하고자 하였다. 우리나라에서는 금번 연구결과를 토대로 아래의 사항을 제시하였다.
- 시험계획 수립단계 이전, 시험물질의 안정성에 관한 문헌 및 시험자료 등 충분한 자료를 확보하여 검토할 필요 있음
- 시험물질 농도 유지를 위한 시험조건(예; 배지종류 등) 도출에 필요한 충분한 사전 예비시험이 필요함
- 시험자료를 평가하는 부서의 요구가 있는 경우 시험물질 모체의 중합에 의한 중합물질 분석자료와 독성자료를 함께 생산할 필요가 있을 것으로 판단됨
이와 같이 제시한 사항에 대해서 중국과 일본 전문가 모두 동의하였으며 매우 의미 있는 제안인 것으로 의견을 모았다. 다만 일본의 한 전문가는 실제 환경 중 영향을 평가하기 위해서는 시험물질의 농도를 일정하게 유지하는 것보다 실제 환경과 가깝게 농도가 변화하는 그대로에 대한 영향을 평가하는 것도 의미가 있을 것이라고 제안하였다.
한·중·일 3국 모두 OECD 시험지침이라는 표준화된 시험방법을 사용하고 있으나 화학물질을 관리하는 각국의 해당 당국이 평가하는 관점에 따라 다소 요구하는 내용은 달라질 수 있다. 따라서 시험기관들은 이러한 요구를 충족할 수 있는 다양한 기술적 능력을 갖출 필요가 있다. 한·중·일 공동연구는 이러한 국가적 차이가 있을 수 있음에도 불구하고 3국간 차이를 좁히고 다양한 요구에 만족할 수 있는 시험방법의 기술발전을 위해 지속적으로 노력할 계획이다.
Ⅳ. 결 론❚
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Ⅳ . 결 론
본 연구는 한·중·일 공동연구의 일환으로 수행되었으며 시험난해물질의 수생태 독성시험 수행 과정 및 결과 해석에 있어서 어려움을 해소하고, 시험기관이 일관되게 시험을 수행할 수 있는 기술적 정보를 제시하고자 하였다. 시험난해 물 질 인 2-아미노페놀을 대상으로 물벼룩 급성독성시험을 수행하였으며 주요 연구 결과는 다 음 과 같 다.
1. 2-아미노페놀의 물벼룩 급성독성시험 수행 결과, 48 시간 반수영향농도 (48 h-EC50)는 1.0 mg/L로 나타났으며 이와 같이 수중에서 중합반응을 일으키는 등 시험난해물질의 경우 독성시험 수행 중 안정성에 관한 충분한 자료를 검토·확보해야 한다.
2. 시험난해물질의 물벼룩 급성독성시험 등 수생태 독성시험 기간 동안 일정한 시험물질 농도 유지를 위하여 적합한 시험배지 및 pH 조건 선정, 시험물질 조제 방법, 시험물질 시험배지 교환주기 등을 사전에 확인할 필요가 있다.
3. 시험용액 중에서 중합을 일으킬 가능성이 있는 물질은 평가기관이나 규제부서에서 중합반응으로 생성되는 부산물의 종류나 양에 대한 분석 자료를 요구받을 수 있으므로 독성자료와 함께 생산할 필요가 있을 것으로 판단된다.
이러한 사항은 2013년도 한·중·일 화학물질 정책대화 전문가 회의에서 도출된 내용이며 향후 지속적인 3국간 정보교류와 공동 연구결과를 바탕으로 수생태 독성시험의 국가간 조화를 이루고 아울러 국내 시험기관의 수생태 독성시험 기술능력을 향상시키는 데 기여할 수 있을 것으로 판단된다. 향후 시험난해물질의 수생태 독성시험과 관련한 지침서를 개발, 국내 시험기관에 배포할 예정이다.
참 고 문 헌 ❚
참 고 문 헌
1. OECD, OECD Series on Testing and Assessment, Number 23: Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures, 2000.
2. 이재안, 류지성, 김경태, 류태권, 이재우, 김지은, 신유진, 김평순, 김필제, 환경유해물질의 유해성평가를 위한 생물시험계 활용연구 - 시험난해물질의 수 생태독성시험 적용연구(I) -, 국립환경과학원, 2012.
3. El-Khalafy, S.H., and Hassanein, M., Oxidation of 2-aminophenol with molecular oxygen and hydrogen peroxide catalyzed by water soluble metalloporphyrins, Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2012, 363-364, 148-152.
4. Horváth, T., Kaizer, J., and Speier, G., Functional phenoxazinone synthase models Kinetic studies on the copper-catalyzed oxygenation of 2-aminophenol, Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2004, 215, 9-15.
5. Kennedy, B., Glidle, A., and Cunnane, V.J., A study of the oxidation and polymerisation of meta substituted phenol and aniline derivatives, Journal of Electroanalytical Chemistry, 2007, 608, 22-30.
6. Mandlimath, T.R. and Gopal, B., Catalytic activity of first row transition metal oxides in the conversion of p-nitrophenol to p-aminophenol, Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2011, 350, 9-15.
7. Zhang, A.Q., Cui, C.Q., Chen, Y.Z., and Lee, J.Y., Synthesis and electrochemic properties of poly-o-aminophenol, Journal of Electroanalytical Chemistry, 1994, 373, 115-121.
8. OECD, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 202:
Daphnia sp., acute immobilisation test, 2004.
참 고 문 헌 ❚
28 9. OECD Existing Chemicals Database
http://webnet.oecd.org/hpv/ui/SponsoredChemicals.aspx
10. OECD, OECD Series On Testing And Assessment, Number 27:
Guidance document on the use of the harmonised system for the classification of chemicals which are hazardous for the aquatic environment, 2001.
부 록 ❚
< 부 록 >
시험난해물질 물벼룩 급성독성시험 사례
(OECD 대량생산 기존화학물질 초기위해성평가 자료)
4,4‘-Oxybis(benzenesulfonyl hydrazide) (CAS No. 80-51-3)
I. 수용해도 : 62.5 mg/L(20 ℃)
□ 방법개요
○ 증류수에서 진탕(shaking)하고 3 일 동안 평형상태 확인 후 시험용액을 원심 분리하고 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 농도 분석
□ 물질의 특성
○ 난용성 : 희석수와 유기용매에 대한 용해성이 비교적 높지 않음
II. 안정성
□ 방법개요
○ OECD 시험지침 111번(pH에 따른 가수분해)
□ 반감기 : 3 시간 ~ 4 시간
○ 9.33 mg/L의 시험용액을 pH 4, 7, 9 완충 용액에 준비한 후 HPLC를 이용 하여 농도를 측정함
20 ℃ 25 ℃ 30 ℃
pH 4 23.1 h 9.2 h 3.76 h
pH 7 17.2 h 7.9 h 3.72 h
pH 9 13.9 h 5.8 h 2.46 h
III. 물벼룩 급성독성시험
<사례 1. - 대한민국>
□ 방법개요
○ OECD 시험지침 202번(지수식)
부 록 ❚
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□ 세부 시험방법
○ 노출준비
- 노출용액 준비 : 직접 첨가법(표준원액을 희석수에 직접 첨가)
- 표준원액(stock solution) 준비 : 시험희석수(M4 배지)에 직접 첨가 후 균질화하여 사용
○ 특이사항 : 1 mg/L(M4 배지) 시험용액의 반감기는 4 시간(48 시간 후 측정농도는 설정농도의 3.43 % ~ 16.7 %로 측정되어 설정농도로 결과를 산출함)
□ 시험결과(반수영향농도)
○ 24 h-EC50 : 23 mg/L 48 h-EC50 : 15 mg/L
<사례 2. - 일본>
□ 방법개요
○ OECD 시험지침 202번(반지수식)
□ 세부 시험방법
○ 노출준비
- 노출용액 준비 : 준비한 표준원액을 M4 배지로 희석하였음
- 표준원액 준비 : DMF (dimethylformamide)에 200,000 mg/L 농도로 준비
○ 특이사항 : 노출 0 시간의 측정농도는 설정농도의 81 % ~ 87 %, 24 시간 후에는 33 % ~ 39 %로 측정되었음
○ 분석방법
- 0 시간, 24 시간에 노출농도를 HPLC를 이용하여 분석
□ 시험결과 : 측정농도의 기하평균으로 프로빗(probit) 통계를 사용하여 결과 산출
○ 24 h-EC50 : 9.8 mg/L 48 h-EC50 : 2.9 mg/L
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Bis(2-ethylhexyl) terephthalate (CAS No. 6422-86-2)
I. 수용해도 : 0.4 μg/L(22.5 ℃)
□ 방법개요
○ 탈이온 증류수(22.5 ℃)에서 저속교반법(slow-stir method)을 이용
○ 기존 연구는 이보다 높음
(0.35 mg/L : 우물물, 0.61 mg/L : 바닷물, 1.5 mg/L : 탈이온수, 모두 25 ℃ 조건) - 기존 결과가 높게 나온 이유는 진탕플라스크(shake-flask) 방법을 사용했음
○ 분석방법 : 고체상추출법(SPE)을 이용하여 추출하였으며 기체크로마토그래피 /질량분석법(GC/MS)를 이용하여 분석함
□ 물질의 특성
○ 소수성 물질로 물에 난용성임
II. 안정성 : 반감기– 1.4 년(pH 7), 51 일(pH 8)
□ 방법개요
○ Epiwin hydrowin model 사용
III. 물벼룩 급성독성시험
<사례. - 미국>
□ 방법개요
○ OECD 시험지침 202번(지수식)
□ 세부 시험방법
○ 노출준비
- 노출용액 준비 : 시험개시 24 시간 전에 교반법을 이용하여 준비 - 표준원액 준비 : DMF에 시험물질을 용해 후 배지에 첨가 - 노출설정농도 : 2.0 μg/L
부 록 ❚
32
○ 분석방법
- 시험시작 및 종료시점에 노출농도 분석 - SPE, GC/MS를 이용하여 농도를 측정하였음
□ 시험결과 : 측정농도를 이용하여 산출함, 통계는 사용하지 않음
○ 48 h-EC50 : > 1.4 μg/L 48 h-NOEC : ≥ 1.4 μg/L
부 록 ❚
Tridecylamine, branched and linear (CAS No. 86089-17-0)
I. 수용해도 : 0.04 g/L(20 ℃)
온도 (℃) Mass-% g/L
20 0.004 0.04
40 0.003 0.03
60 0.004 0.04
80 0.005 0.05
□ 물질의 특성
○ 물에 난용성임
II. 안정성
□ 물 환경 pH 조건에서는 가수분해 되지 않음
III. 물벼룩 급성독성시험
<사례 1. - 독일>
□ 방법개요
○ EPA OTS 797.1300, OECD 시험지침 202번(반지수식)
□ 세부 시험방법
○ 노출준비
- 노출용액 준비 : ISO 배지로 희석하였음
- 노출용기는 유리에 시험물질이 흡착되는 것을 방지하기 위해 표면을 dichlorodimethylsilane으로 코팅하고 시험전 시험물질에 용기를 24 시간 동안 담군 후 사용함
- 표준원액 준비 : ISO 배지에 시험물질을 용해시켰음. 5 분 동안 초음파분쇄 (ultrasonication) 한 후 22 시간 동안 교반함
부 록 ❚
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○ 분석방법
- 0, 24, 48 시간에 대조군, 저·중·고농도를 GC-MS를 이용하여 분석
○ 통계 : 프로빗 통계법
○ 노출설정농도 : 대조군, 0.0039, 0.0078, 0.0157, 0.0313, 0.0625, 0.125, 0.250 mg/L
□ 시험결과
○ 측정 농도값
- 24 h-EC50 : 0.042 mg/L
48 h-EC50 : 0.015(0.011 ~ 0.019) mg/L
○ 설정 농도값
- 24 h-EC50 : 0.064 mg/L
48 h-EC50 : 0.025(0.020 ~ 0.032) mg/L
<사례 2. - 독일>
□ 방법개요
○ 독일표준협회 DIN 38412 L11, EC L251/155(지수식)
□ 세부 시험방법
○ 노출준비
- 노출용액 준비 : “KS”, pH 8.0
- 표준원액 준비 : 시험 배지에 시험물질을 용해시켜 준비, pH 7.9
○ 분석방법 : 보고되지 않음
○ 통계 : 프로빗 통계법
○ 노출설정농도 : 대조군, 0.015, 0.020, 0.028, 0.040, 0.056, 0.078, 0.109, 0.153, 0.214, 0.300 mg/L
□ 시험결과
○ 설정 농도값
- 24 h-EC50 : 0.185 mg/L 48 h-EC50 : 0.050 mg/L
부 록 ❚
<사례 3. - 독일>
□ 방법개요
○ 독일표준협회 DIN 38415 part 11(지수식)
□ 세부 시험방법
○ 노출준비
- 노출용액 준비 : 독일표준협회 DIN 328412 part 11에 따라 조제 - 표준원액 준비 : 증류수에 100 mg/L로 준비
○ 분석방법 : 보고되지 않음(화학분석을 통해 안정성을 확인함)
○ 통계 : Spearman-Karber
○ 노출설정농도 : 대조군, 0.1, 0.18, 0.32, 0.58, 1.0, 1.8, 3.2, 5.8, 10 mg/L
□ 시험결과
○ 설정 농도값
- 24 h-EC50 : 1.1(0.9 ~ 1.4) mg/L 48 h-EC50 : 0.7(0.5 ~ 0.9) mg/L
<사례 4. - 독일>
□ 방법개요
○ OECD 시험지침 202번(지수식)
□ 세부 시험방법
○ 노출준비
- 노출용액 준비 : M4 배지로 희석
- 표준원액 준비 : 시험배지에 10 mg/L 농도로 조제 후 24 시간 동안 교반
○ 분석방법 : 보고되지 않음
○ 통계 : 보고되지 않음
○ 노출설정농도 : 대조군, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 mg/L
□ 시험결과
○ 48h EC50 : 0.525 mg/L
부 록 ❚
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<사례 5. - 독일>
□ 방법개요
○ OECD 시험지침 202번(지수식)
□ 세부 시험방법
○ 노출준비
- 노출용액 준비 : 천연 연못물
- 표준원액 준비 : 시험배지에 10 mg/L 농도로 조제 후 24 시간 동안 교반
○ 분석방법 : 보고되지 않음
○ 통계 : 보고되지 않음
○ 노출설정농도 : 대조군, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 mg/L
□ 시험결과
○ 48h EC50 : 0.455 mg/L
<사례 6. - 독일>
□ 방법개요
○ OECD 시험지침 202번(지수식)
□ 세부 시험방법
○ 노출준비
- 노출용액 준비 : 2.5 mg/L humic acid-Na salt가 첨가된 M4 배지 - 표준원액 준비 : 시험배지에 10 mg/L 농도로 조제 후 24 시간 동안 교반
○ 분석방법 : 보고되지 않음
○ 통계 : 보고되지 않음
○ 노출설정농도 : 대조군, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 mg/L
□ 시험결과
○ 48h EC50 : 0.654 mg/L
부 록 ❚
Dibutyltin dilaurate (CAS No. 77-58-7)
I. 수용해도 : < 0.1 mg/L(25 ℃)
II. 안정성
□ 반감기(< 38 분 at pH 7)
○ 분석방법
- DBTL (Dibutyltin dilaurate)의 용해도 및 가수분해율을 평가하기 위한 방법은 없음 - 용액내의 주석농도와 기타물질을 확인하기 위해 sodium tetraethylborate
유도체화 및 GC-MS를 이용해 정량분석함
- 액체크로마토그래피/질량분석법/질량분석법(LC/MS/MS) 및 액체 크로마토그래피/질량분석법(LC/MS)을 이용하여 용액내의 실제 존재하는 물질에 대해 정성분석을 수행
III. 물벼룩 급성독성시험
<사례. - 미국>
□ 방법개요
○ OECD 시험지침 202번, EU EEC 2(지수식)
□ 세부 시험방법
○ 노출용액 준비 : 수돗물
○ 표준원액 준비 : 수돗물에 시험물질을 100 mg/L 농도로 용해시켰음 24 시간 동안 교반 후 여과하여 희석 사용함
○ 분석방법
- 총 주석 함량 : 유도결합플라스마/질량분석법(ICP-MS) 분석, 포화용액의 DBTL 농도(분자식을 기본으로 총유기탄소(TOC) 결과로부터 계산)
○ 통계 : Spearman-Karber method
부 록 ❚
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○ 노출설정농도
- 산술평균을 이용한 예측 농도
: 포화용액(3.8 mg/L)을 준비하여 1:2(1.9 mg/L), 1:4(1.0 mg/L), 1:8(0.5 mg/L) 비율로 희석하여 노출
- 기하평균을 이용한 예측 농도
: 포화용액(3.35 mg/L)을 준비하여 1:2(1.68 mg/L), 1:4(0.84 mg/L), 1:8(0.42 mg/L) 비율로 희석하여 노출
□ 시험결과
○ TOC 분석을 통한 측정된 농도의 기하평균으로 산출된 예측값 - 48 h-EC50 : 1.9 mg/L ~ 3.8 mg/L
○ 주석 분석을 기반으로 한 산술평균 추정값 - 48 h-EC50 : < 1 mg/L
○ 기하 평균 농도를 이용하여 통계분석한 독성값 - 48 h-EC50 : 2.52 mg/L