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책임저자：박용검, 서울시 동작구 흑석동 224-1
156-755, 중앙대학교병원 외과 Tel: 02-816-9871, Fax: 02-793-1042 E-mail: [email protected]
접수일：2007년 1월 17일, 게재승인일：2007년 6월 27일
*위 논문은 2006년도 교내학술 연구비 지원을 받아 작성된 논문임.
대장 직장암에서 D2-40을 이용한 림프계 미세 혈관 밀도와 혈관 내피세포 성장 인자-C의 단백 발현의 의미
중앙대학교 의과대학 중앙대학교병원 외과학교실, 1성균관대학교 의과대학 마산삼성병원 외과학교실
김태희ㆍ김용석ㆍ최영철1ㆍ김범규ㆍ이태진ㆍ박용검
The Significance of the Lymphatic Micro Vessel Density and Vascular Endothelial Growth Factor- C Expression for Colorectal Cancer
Tae Hee Kim, M.D., Yong Sok Kim, M.D., Young Chol Choi, M.D.1, Bom Ku Kim, M.D., Tae Jin Lee, M.D. and Yong Geum Park, M.D.
Purpose: Studying the prognostic factors of distant meta- stasis is quite important for predicting these patients’ prog- nosis and also for providing standards for post-operative ad- juvant chemotherapy. Microbiological studies currently enable researchers to look for new predictors of distant metastasis in patients with colon cancers. In this study, the VEGF-C expression and stain rate of D2-40 were investigated as prognostic factors.
Methods: 79 Specimens were collected from the patients who underwent colorectal operation and they were pathologi- caly diagnosed with cancer at Chung-Ang University hospital from March, 2003 to Sept. 2005. The specimens were im- munohistochemically stained to detect the VEGF-c ex- pression and the D2- 40 stain rate.
Results: The VEGF-C expression was related to lymph node metastasis, tumor embolism and the frequency of the T- stage, but it was not related to progression of cancer. The D2-40 stained lymphatic density was significantly increased in the cases with lymph node metastasis and in the tumor embolism cases; furthermore, the density became higher in relation to the increased T-stage and progression of cancer.
Conclusion: The VEGF-C expression and lymphatic vessel density appear to be prognostic factors for colon cancer.
(J Korean Surg Soc 2007;73:406-411)
Key Words: Colorectral cancer, VEGF-C, D2-40, Lymphatic microvessel density
중심 단어: 대장 직장암, VEGF-C, D2-40, 미세혈관밀도 Department of Surgery, College of Medicine, Chung-Ang University, Seoul, 1Department of Surgery, Masan Samsung Hospital, Sungkyunkwan University School of Medicine, Masan, Korea
서 론
대장암은 서구에서는 폐암에 이어 암 사망률 2위를 차지 하는 흔한 질병으로 최근 우리나라에서는 암 사망률 4위를 차지한다. 하지만 우리나라도 식생활의 변화와 산업의 발 달 등 서구화됨에 따라 점점 그 발생이 증가 추세에 있 다.(1) 대장암은 소화기암 중에서는 비교적 예후가 좋은 편 이지만 많은 예에서는 진단 시 또는 절제 후 원격전이를 일으켜 사망한다. 따라서 원격전이의 예후 인자에 대한 연 구는 환자의 예후를 미리 예측할 수 있다는 점과 수술 후 보조요법의 시행을 결정하는 판단 기준이 된다는 점에서 의미가 깊다. 기존의 알려진 여러 임상병리학적인 예후인 자 외에도 근래에는 분자생물학적 방법을 기초로 대장암의 원격전이에 대한 의미 있는 예후인자를 찾는 연구가 진행 되고 있다.
혈관 및 림프관의 증식은 종양의 성장에 있어 필수적인 과정이다. 그 중 림프관계는 대부분의 악성 종양에서 전이 의 일차적인 통로이며 대부분의 악성 종양에서 종양세포의 림프관 침윤이 전이의 가장 중요한 지표이므로 결장직장암 의 조직에서 림프관의 증식을 측정하는 것은 임상적으로 중요하다.(2) 혈관 및 림프관의 증식에 대한 대부분의 병리 학적 접근 방법은 면역조직화학적으로 혈관내피세포에 표 지된 혈관의 밀도를 평가하는 것이다. 몇 개의 혈관내피세 포 표지인자가 발견되어 광범위하게 쓰이는데 CD31/PECAM- 1, CD34, Factor VIII-related antigen 등이다.(3) 그러나 림프 관증식에 대한 연구는 림프관의 내피세포에 대한 표지인자 의 부족으로 인해 제한적이었다. 최근에 monoclonal anti- body인 D2-40이 림프관에서 선택적으로 발견되어 혈관으 로부터 구분하여 림프관들을 구별할 수 있게 되었다. D2-40
Fig. 1. Immunohistochemical stai- ning for D2-40 in color- ectal cancer. (A) A few lymphatic vessels are not- ed in adenocarcinoma of mucosal invasion, (B) Many lymphatic vessels are not- ed in adenocarcinoma of subserosal invasion (×200).
은 O-linked sialoglycoprotein과 작용하는 항체로 림프관의 내피세포에서 발견되며 림프계에는 존재하나 주변 모세 혈 관에는 없는 것으로 알려져 있다.(4) 림프관계는 대부분의 악성 종양에서 전이의 일차적인 통로이며 대부분의 악성 종양에서 종양세포의 림프관 침윤이 전이의 가장 중요한 지표이다.
혈관 신생은 종양 세포의 크기가 2∼3 mm size에 도달한 이 후의 성장에 있어 절대적으로 필요한 요소이며,(2) 주변 의 혈관으로 종양세포가 퍼지는 것을 촉진시켜 종양세포의 침윤과 전이에 필수적인 역할을 한다. 종양세포는 다양한 혈관신생인자를 분비하는데 이 중 Vascular endothelial growth factor (VEGF)는 혈관의 투과성을 증가시키고 혈관내피세 포의 증식을 자극하며,(5) 인간의 종양에서 성장과 침윤, 전 이, 재발에 있어서 가장 중요한 분자중의 하나로 여겨지고 있다.(6-9)
VEGF의 여러 아형 중 VEGF-C는 대부분 림프관의 내피 세포에 분포하며 VEGF-C의 가장 큰 기능은 림프간계의 성 장을 조절하는 것으로 여겨지고 있다.(10)
이에 본 연구에서는 대장암에서 림프관 내피세포 표지자 인 D2-40을 이용하여 림프계 미세혈관 밀도를 관찰하고 VEGF-C에 대한 면역조직화학 염색을 실시하여 이들 인자 들의 예후인자로서의 가치를 판단해 보고자 한다.
방 법 1) 재료
2003년 3월부터 2005년 9월까지 중앙대학교 의료원에서
병리학적으로 결장직장암으로 외과적으로 수술 받은 환자 중 조직보존 상태가 양호한 79명의 파라핀 포매 조직을 이 용하였다.
총 79예 중 남자는 47명(59.5%) 여자는 32명(40.5%)이었 으며, 20대가 1명(1.3%), 40대가 9명(11.4%), 50대가 8명 (10.1%), 60대가 33명(41.8%), 70대가 24명(30.4%), 80대가 4 명(5.1%)이었고, 평균 나이는 65.2세였다.
2) 방법
(1) 병리조직학적 검색: 환자의 유리 슬라이드를 재검색 하여 조직학적인 분화도를 정하고 AJCC (American Joint Committee on Cancer)의 Cancer Staging Manual을 이용하여 병기를 정하였다.
(2) 면역조직화학 염색: 파라핀 포매조직을 두께 4∼5μm 으로 절편으로 박절하고 xylene으로 5분간 3회 탈파라핀시 킨 후 무수 알코올, 90%, 75% 및 50% 에탄올에 각각 2분씩 처리하여 함수시켰다. 조직 절편에 있는 내인성 과산화효 소의 활성을 억제하기 위해 0.3% hydrogen peroxide- meth- anol에 10분간 처리 후 증류수로 세척한다. 절편을 50 mM Tris 완충용액(TBS, pH 7.5)으로 수세 후 비특이적 항원을 제거하기 위해 30분간 염소혈청과 반응시키고 여분의 용액 을 제거한 후 일차항체로 D2-40 (Abcam, Cambridge, UK)과 VEGF-C (R&D system, MN, USA)를 1：50으로 희석하여 실 온에서 2시간 동안 반응시켰다. 일차항체 반응 후 절편을 TBS로 5분간 3회 수세한 다음 biotin이 부착된 이차항체 (Zymed Co., South San Francisco, USA)를 1：300으로 희석 하여 작용시킨 후 통상적인 avidin-biotin complex법으로 20
Fig. 2. Immunohistochemical stai- ning for VEGF-C in color- ectal cancer. (A) No pos- itive immunoreactivity in adenocarcinoma of muco- sal invasion, (B) Diffusely positive immunoreactivity in adenocarcinoma of sub- serosal invasion (×400).
분간 반응시켰다. 발색제는 3-amino-9-ethyl carbazole (AEC) 를 사용하였고 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하여 gly- cerol gelatin으로 봉입한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
(3) 면역조직화학 염색 결과 판정: D2-40에 의한 Fig. 1 과 2에서처럼 염색부위를 확인하였다. 림프계 미세혈관밀 도는 비교적 미세혈관밀도가 높은 세 곳을 현미경 저배율 시야에서 검색하고 배율을 높여 200배 시야에서 미세혈관 의 수를 세고 세 곳의 평균치로 각 예의 미세혈관밀도를 구하였고, VEGF-C에 대해서는 종양세포의 세포질에 염색 된 범위가 10% 이하이면 1, 10∼50%이면 2, 50% 이상이면 3으로 정하고, 염색강도도 0∼3까지로 정하여 염색강도와 염색범위의 합이 2 이상인 경우를 양성으로 판독하였다.
(4) 통계학적 분석: 조직학적 분화도, 종양 색전 유무, 종양 의 T-stage, 림프절 전이 여부, TNM 병기 등과 미세혈관밀 도와의 상관성은 Window용 SPSS (version 8.0) 통계 프로그 램을 이용하여 ANOVA test를 실시하였고, VEGF-C의 발현 에 대해서는 chi-square를 실시하여 P값이 0.05 이하일 때를 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 인정하였다.
결 과 1) 임상 병리학적 소견
조직학적 분화도는 고분화도가 17예(21.5%), 중등도 분화 도가 59예(74.7%), 저분화도가 3예(3.8%)였으며, 종양 색전 이 없는 군이 57예(72.2%) 있는 군이 22예(27.8%)였다. 종양 병기가 1인 군이 8예(10.1%), 2인 군이 13예(16.5%), 3인 군 이 58예(73.4%)였다. 림프절 전이가 없는 예가 44예(55.7%) 전
이가 있는 예가 35예(44.3%)였으며, 병기가 I인 군이 18예 (22.8%), II인 군이 23예(29.1%), III인 군이 32예(40.5%), IV 인 군이 6예(7.6%)였다.
2) D2-40에 의한 림프계 미세혈관 밀도
D2-40에 의한 림프계 미세혈관 밀도는 평균 27.92±11.16 였으며 조직적학 분화도에 따른 림프계 미세혈관밀도의 차 이는 관찰되지 않았고, 종양 색전 유무에 따른 분석에서는 종양 색전이 없는 경우에 림프계 미세혈관밀도는 24.82±
10.73, 종양 색전이 있는 경우에 림프계 미세혈관밀도는 35.95±07.88로 통계학적인 유의성이 있었고(P=0.0001), 종 양 병기에 따른 분석에서는 생검 조직에서 병기가 T1에서 T3로 진행할수록 림프계 미세혈관밀도도 통계학적으로 유 의하게 증가하였다(P=0.011). 림프절 전이 유무에 따른 분 석에서는 전이가 없는 경우에 림프계 미세혈관밀도는 21.23±
07.64, 전이가 있는 경우에 36.34±08.99로 통계학적인 유의 성이 있었으며(P=0.0001), 병기에 따른 분류에서는 병기가 I에서 IV로 진행할수록 림프계 미세혈관밀도는 통계학적으 로 유의하게 증가하였다(P=0.0001)(Table 1).
3) VEGF-C 단백 발현
VEGF-C는 총 79예 중 30예(38.0%)에서 양성으로 판정되 었다. 조직학적 분화도와 종양 병기에 따른 발현은 통계학 적인 유의성이 없었으며, 종양 색전 유무에 따른 분석에서 종양 색전이 없는 군에서는 29예(50.9%) 종양 색전이 있는 군에서는 20예(90.9%)에서 양성의 소견이 관찰되어 통계학 적인 의미가 있었다(P=0.001). 종양 병기에 따른 분석에서
Table 1. Lymphatic microvessel density (LMVD) and VEGF-C expression in colorectal cancer
VEGF-C
D2-40
(n) () (%) (+) (%)
Histologic differentiation
Well 17 21.24±10.05 9 (52.9) 8 (47.1) Moderate 59 30.47±10.52 19 (32.2) 40 (67.8) Poor 3 15.67±06.35 2 (66.7) 1 (33.3)
(P-value) NS NS
Tumor emboli
() 57 24.82±10.73 28 (49.1) 29 (50.9) (+) 22 35.95±07.88 2 (9.1) 20 (90.9)
(P-value) 0.0001 0.001
T-stage
1 8 16.25±05.18 6 (75.0) 2 (25.0) 2 13 16.46±09.67 6 (46.2) 7 (53.8) 3 58 32.10±08.97 18 (31.0) 40 (69.0)
(P-value) 0.011 0.015
Nodal metastasis
() 44 21.23±07.64 28 (63.6) 16 (36.4) (+) 35 36.34±08.99 2 (5.7) 33 (94.3)
(P-value) 0.0001 0.0001
Stage
I 18 13.56±04.20
28 (68.3) 13 (31.7)
II 23 25.57±03.23
III 32 34.97±08.93
2 (5.3) 36 (94.7)
IV 6 42.50±00.84
(P-value) 0.0001 0.0001
Table 2 Correlation with VEGF-C expression and lymphatic microvessel density (LMVD)
LMVD
VEGF-C (n) (mean±S.D)
() 30 20.23±07.57
(+) 49 32.63±10.40
(P-value) 0.0001
종양 병기가 T1, T2, T3로 증가할수록 VEGF-C의 양성 비율 도 25.0%, 53.8%, 69.0%로 통계학적으로 의미 있게 증가하 였고(P=0.015), 림프절 전이 유무에 따른 분석에서도 림프 절 전이가 없는 군에서는 36.4%, 전이가 있는 군에서는 94.3%의 양성 비율을 나타내어 통계학적 의미가 있었다 (P=0.0001). 병기에 따른 분석에서는 VEGF-C의 양성 비율 은 병기가 I에서 IV로 증가함에 따라 순차적인 증가가 관찰 되지는 않았다. VEGF-C의 양성 비율이 유사하게 관찰된 병
기 I과 병기 II에서 VEGF-C의 양성군과 음성군의 임상 및 병리학적인 특징을 관찰해보았을 때 두 군 간에는 통계학 적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
4) D2-40에 의한 림프계 미세혈관밀도와 VEGF-C 발현 의 연관성
VEGF-C가 음성인 군에서 D2-40에 의한 림프계 미세혈관 밀도는 평균 20.23±07.57개였고 VEGF-C가 양성인 군에서 는 32.63±10.40개로 통계학적으로 유의한 차이가 있었다 (P=0.0001)(Table 2).
고 찰
림프계는 종양 세포의 전이 통로로서 알려져 있지만 종 양세포에 의한 림프관의 침범이 여러 동물과 사람의 악성 종양을 대상으로 한 연구에서 주로 종양의 변연부에서 발 견되어 왔다. 그렇지만 이러한 결과들은 혈관과 림프관을 구분하는 특징적인 표지자가 없음으로 인해 종양 내에서의 림프관의 존재와 기능에 대한 연구가 부족하였다.(11) 대장 암을 포함한 몇몇 종양에서 종양 내에 존재하는 림프관들 은 주로 종양세포에 의해 침범된, 기존에 존재하고 있는 림 프관으로 생각되어 왔으나 악성종양에서 암세포 자극에 의 하여 새로운 생성이 일어나는 지에 대한 의문점과 이들 종 양세포와 림프관 사이의 상호 작용에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 종양의 성장과 전이에는 신생 맥관 형성이 필수 적이다. 종양은 성장하기 위해서는 반드시 새로운 미세혈 관의 증식을 촉진해야하고 이러한 종양 내의 신생 행혈관 은 종양세포가 체순환계로 들어가 원격전이를 일으키는 통 로를 제공한다.(12)
D2-40이라는 단일항체는 림프계 내피세포, 태아 고환, 생 식세포종양 등에서 발견되는 O-linked sialoglycrotein과 작용 한다. Kahn 등에 의해 보고된 것에 의하면 D2-40은 림프계 내피세포에 선택적인 표지인자로 혈관세포와는 작용하지 않는다.(4) 최근 연구에서는 D2-40이 편평내피세포로 덮이 고 내강 내 림프구만 있고 적혈구는 없는 림프관의 내피세 포와 반응하는 것이 확인되었다.(16) 또한 D2-40 항체에 의 한 면역반응은 포르마린에 고정하여 파라핀 블록을 만든 조직에서도 잘 발현된다는 장점이 있다.
본 연구에서 D2-40에 의한 림프계 미세혈관밀도는 평균 27.92±11.16였으며 조직적학 분화도에 따른 림프계 미세혈 관밀도의 차이는 관찰되지 않았고, 종양 색전 유무에 따른 분석에서 종양 색전이 없는 경우에 림프계 미세혈관밀도는 24.82±10.73, 종양 색전이 있는 경우에 림프계 미세혈관밀 도는 35.95±07.88로 통계학적인 유의성이 있었다. 종양 병 기에 따른 분석에서는 생검 조직에서 병기가 T1에서 T3로 진행할수록 림프계 미세혈관밀도도 16.25±05.18, 16.46±09.67, 32.10±08.97로 통계학적으로 유의하게 증가하였고, 림프절
전이가 없는 경우에 림프계 미세혈관밀도는 21.23±07.64, 전이가 있는 경우에 36.34±08.99개로 통계학적인 유의성이 있었으며, 병기에 따른 분류에서는 병기가 I에서 IV로 진행 할수록 림프계 미세혈관밀도는 13.56±04.20, 25.57±03.23, 34.97±08.93, 42.50±00.84로 통계학적으로 유의하게 증가하 였다. 본 연구 결과와 함께 Jiang 등이 vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3)를 이용하여 대장암에서 림프계 미세혈관밀도를 관찰한 결과 림프절 전이와 병기와 의 연관성이 있다고 보고한 바 있어서,(17) 림프계 미세혈 관밀도는 대장암에서 중요한 예후 인자가 될 수 있을 것으 로 생각된다. 맥관 형성을 유발하는 인자로서는 bFGF, aFGF, VEGF, PD-ECGF, TGF-alpha, TGF-betha, Angiogenin, TNF-alpha 등이 있는데 이 중 VEGF는 많은 연구들에서 종 양의 혈관신생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 이것의 생물학적인 작용들로는 혈관내피세포의 증식과 이 동, 혈관 투과성의 증가, 항-자연사인자(anti-apoptotic fac- tors), urokinase-type serine protease, matrix metalloproteinase 의 상향조절 등이 알려져 있다.(13) 종양의 VEGF 발현과 림프계 미세혈관 밀도는 종양 세포의 확산에 대한 표지인 자로서 밀접한 관계가 있다. 최근에 발견된 VEGF 군에 속 하는 아형인 VEGF-C, VEGF-D의 역할에 대해서는 잘 알려 져 있지 않다. VEGF-C는 tyrosine kinase receptor VEGFR-3 에 대한 ligand로 처음 알려진 물질로서 림프계와 연관이 있 으며 VEGF-A와 함께 VEGFR-2에 대한 ligand를 공유하며 구조적으로 VEGF-D와 흡사한데 구조상 VEGF의 central core 부분의 약 30% 염기 배열 동종 부위를 공유하고 있 다.(14) VEGF-C는 혈관신생과 림프관신생 모두 관여하나 강력한 림프관신생 유도인자로 알려져 있고 실험실 조건에 서 내피세포의 증식과 이동에도 관여하지만 VEGF 만큼 강 력하지는 않다. 최근에 기존에 알려진 혈관내피성장인자의 아형인 VEGF-C, VEGF-D 등이 종양 주변 림프관의 확장과 함께 종양내 림프관 신생을 일으키는 것이 보고되었고 특 히 VEGF-C는 강력한 림프관 신생 유도 인자로 알려져 있 다.(15)
본 연구에서 VEGF-C는 총 79예 중 38.0%에서 양성으로 판정되어 비교적 높지 않은 발현 빈도를 나타냈다. 조직학 적 분화도와 종양 병기에 따른 발현은 통계학적인 유의성 이 없었으며, 종양 색전이 없는 군에서는 50.9%, 종양 색전 이 있는 군에서는 90.9%에서 양성의 소견이 관찰되어 통계 학적인 의미가 있었다. 종양 병기가 T1, T2, T3로 증가할수 록 VEGF-C의 양성 비율도 25.0%, 53.8%, 69.0%로 통계학적 으로 의미있게 증가하였고, 림프절 전이가 없는 군에서는 36.4%, 전이가 있는 군에서는 94.3%의 양성 비율을 나타내 어 통계학적 의미가 있었다. 병기에 따른 분석에서는 VEGF- C의 양성 비율은 병기의 증가에 따른 순차적인 양성 비율 의 증가는 보이지 않았다. 병기의 증가에 따른 순차적인 증 가가 관찰되지 않은 이유는 다음 두 가지 정도로 해석할
수 있다. 첫째는 상대적으로 연구대상 환자의 수가 적고 특 히 병기 IV에 해당하는 대상의 수가 적었기 때문이라고 생 각할 수 있고, 두 번째는 VEGF-C의 양성 비율이 유사하게 관찰된 병기 I과 병기 II에서 VEGF-C의 양성군과 음성군의 사이에 임상 및 병리학적인 차이점이 없는 점으로 미루어 VEGF-C의 발현이 비교적 병기가 낮은 병기에는 발현을 잘 하지 않다가 높은 병기에서는 급격히 발현 빈도가 높아지 는 것으로도 생각할 수 있다. 이와 같은 결과로 대장암에서 VEGF-C는 종양 색전 유무와 종양병기 및 림프절 전이와 연관성이 있는 표지자라고 생각한다.
또한 VEGF-C의 발현과 림프계 미세혈관밀도와의 연관 성 측면에서 VEGF-C가 음성인 군에서 D2-40에 의한 림프 계 미세혈관밀도는 평균 20.23±07.57개였고 VEGF-C가 양 성인 군에서는 32.63±10.40개로 통계학적으로 유의한 차이 가 있어서 VEGF-C가 림프계 미세혈관의 증식에 영향을 미 칠 것으로 추정한다.
결 론
대장 직장암에서 림프관 내피세포 표지자인 D2-40을 이 용하여 림프계 미세혈관 밀도를 관찰하고 VEGF-C에 대한 면역조직화학 염색을 실시하여 VEGF-C 단백 발현과 림프 계 미세혈관밀도는 상호 연관성이 있으며, 림프계 미세혈 관밀도는 종양색전, 종양병기, 림프절 전이, 병기와 연관성 이 있으며, VEGF-C 단백발현은 종양색전, 종양병기, 림프 절 전이와 연관성이 있어서 대장암에서 림프계 미세혈관밀 도와 VEGF-C 단백 발현은 예후인자로서의 가능성이 있다 고 생각한다.
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