Original Article
원고 접수일 2010년 12월 27일, 게재 확정일 2011년 1월 19일 책임저자 박영욱
(210-702) 강원도 강릉시 강릉대학로 120번지, 강릉원주대학교 치과대학 구강악안 면외과학교실
Tel: 033-640-3102, Fax: 033-640-3103, E-mail: [email protected]
RECEIVED December 27, 2010, ACCEPTED January 19, 2011 Correspondence to Young-Wook Park
Department of Oral and Maxillofacial Surgery, College of Dentistry, Gangneung-Wonju National University
120, Gangneung Daehang-no, Gangneung 210-702, Korea
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구강 편평상피세포암 마우스 모델에서 림프관내피 성장인자 수용체의 억제
계준영ㆍ박영욱
강릉원주대학교 치과대학 구강악안면외과학교실
Abstract
Inhibition of Lymphatic Endothelial Growth Factor Receptor in a Murine Model of Oral Squamous Cell Carcinoma
Jun-Young Kye, Young-Wook Park
Department of Oral and Maxillofacial Surgery, College of Dentistry, Gangneung-Wonju National University
Purpose: Tumor associated angiogenesis and/or lymphangiogenesis are known to be linked by VEGFR signaling pathways.
These processes are regulated by several growth factors including VEGFR-2, VEGFR-3. E7080 is an orally active inhibitor of multiple tyrosine kinases including VEGFR-2, 3. Therefore, it was proposed that E7080 may inhibit angiogenesis and lymphangiogenesis. The aim of this study was to determine the effect of E7080 in a nude mouse model of OSCC.
Methods: KB cells were xenografted into the submucosal tissue of the mouth floor of athymic mice. Seven days after the xenograft, the mice were randomized into 2 groups. E7080 were administered orally to the experimental group once per day. The mice were sacrificed 3 weeks after the treatment. The tumors were examined histopathologically. Immunohistochemical assays with anti- VEGF-C, VEGFR-2, VEGFR-3, phosphorylated VEGFR-2/3 (pVEGFR-2/3), and D2-40 antibodies were then performed.
Results: The transplantation of human OSCC tumor cells into the mouth floor resulted in the formation of orthotopic tumors.
The experimental (E7080 treatment) group showed a slowly increased tumor volume. Moreover, immunohistochemical staining demonstrated higher levels of VEGF-C, VEGFR-2, VEGFR-3, pVEGFR-2/3 and D2-40 expression in the control group than in the experimental group.
Conclusion: These results suggest that E7080 may provide therapeutic benefits in OSCC.
Key words: OSCC, Angiogenesis, Lymphangiogenesis, VEGFR, E7080
인 것이 구강 편평상피세포암종(oral mucosal squamous cell carcinoma, OSCC)으로 구강암의 약 90% 이상을 차지하고 있다.
2006년 전 세계적으로 약 274,000명에서 이환되었고, 미국에서 는 매년 약 12,000명이 발병되어 그 중 5,000명 이상이 사망하며, 서유럽의 경우에서도 보고된 사망률이 100,000명 당 29∼40명이 다[1]. 또한 인간수명의 증가와 함께 흡연의 영향으로 구강암은 향후에 그 발생률이 계속적으로 증가할 것으로 예상되고 있다.
현대에 이르러 외과적 수술의 발달과 방사선 치료나 항암제와 같은 화학 요법의 발전에도 불구하고 병기가 진행된 3∼4기의 구강암 환자의 5년 생존율은 지난 수십 년간 약 50∼55%정도로 머무르고 있는 등 크게 개선되고 있지 못하다[2].
악성 종양의 예후를 불량하게 하는 인자들로 여러 가지를 생각 할 수 있으나 그 중 대표적인 것은 악성 종양의 일반적 특징인 인접 림프절 전이나 원격 장기로의 침습 및 전이가 있으며 특히 타 장기로의 전이는 암환자의 주요 사망 원인이 된다[3,4]. 또한 구강 편평상피세포암의 경우 타 두경부 암과 마찬가지로 경부 림프절 전이가 잘 되는 경향이 있으며[5], 기존 연구에 의하면 초진 환자의 30% 정도에서 이미 경부 림프절 전이가 진행된 상태로 진단되었고, 특히 설암의 경우 가장 높은 림프절 전이를 보인다고 하였다[6]. 전이는 신생 림프관 형성(lymphangiogen- esis)과 혈관 형성(angiogenesis)을 통해 이루어진다. 이러한 신 생 림프관 및 혈관 형성은 내피세포 성장인자(vascular endothe- lial growth factor, VEGF)인 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D와 태반 성장 인자(placental growth factor), 그리고 이들의 수용체인 VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3에 의해 조절된 다[7,8]. 기존의 수많은 연구를 통해 VEGF-A와 VEGFR-2를 통한 경로가 신생 혈관 형성에 관여하는 것으로 밝혀졌으며, 종양 조직 이 지속적인 증식을 하기 위해서는 신생 혈관 형성에 필수적이므 로 이 과정을 억제시킴으로써 종양의 성장을 억제하고 암 환자의 수명을 연장시킨 결과를 보고한 임상 치료들도 있다[9-11]. 또한 추가적인 연구를 통해 VEGF-C와 VEGF-D가 VEGFR-3를 활성 화시키고 이 경로를 통해 신생 림프관 형성에 관여하는 것으로 밝혀졌으며[12], 신생 림프관 형성과 림프절 전이와 관련한 VEGF-C의 관계는 수많은 암종에서 보고되었다[13-17]. 쥐를 이 용한 임상전 실험 연구에서 VEGF-C가 과발현된 암종에서 VEGF-C의 억제는 림프절 전이를 억제하였으며[18], 폐 등의 원격 장기나 인접 림프절로의 전이를 억제하는데 있어서 VEGFR-2나 VEGFR-3의 개별적인 억제보다는 VEGFR-2와 VEGFR-3를 동시 에 억제하는 것이 더 효과가 있다고 하였다[19].
위와 같은 배경에서 본 연구에서는 혈관내피 성장인자 수용체 인 VEGFR-2와 VEGFR-3를 모두 억제시키는 것은 종양세포의
연구방법
1. 세포주 및 세포배양
인간 구강 편평상피세포암종으로부터 확립된 KB (KCLB No.
10017) 세포주가 본 실험에 이용되었다. KB 세포주는 한국세포 주 은행(Seoul, Korea)으로부터 구입하여 10% 우태혈청(fetal bovine albumin, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 100 units/
ml penicillin (Invitrogen) 및 100 mg/ml streptomycin (Invitrogen)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Invitrogen)을 사용하여 배양하였다. 세포들은 단일층 으로 배양하였고, 55% 습도를 유지하면서 5% CO2, 95% 공기 상태로 37oC에서 유지되었다.
2. 시약 및 실험동물
혈관내피성장인자 수용체 억제제로 E7080 (S1164, Selleck chemical, Houston, Texas, USA)을 구입하여 사용하였다. 생 후 8주된 웅성 누드 마우스(BALB/cAnNCrj)를 업체(Orient Bio, Seoul, Korea)로부터 구입하여 10주 시점에서 실험에 이용하였 다. 누드 마우스는 병원성 미생물이 존재하지 않는 환경에서 국립 강릉원주대학교 치과대학의 실험동물 관리원칙(Animal Care and Use Guidelines)에 의거하여 사육하였다.
3. 실험동물에서의 종양세포 이종 이식
생체 내 이종이식을 위한 세포 부유액(cell suspension)을 만들 기 위하여 95% 이상의 활성을 유지한 배양세포만을 이용하였으며 이는 트립판 블루 염색으로 확인하였다. 배지에 포화상태에 이르 지 않은 암세포를 트립신 처리(0.25% 트립신＋0.02% EDTA) 후 정해진 수만큼을 50μl의 Ca2＋과 Mg2＋가 함유되지 않은 HBSS (Hanks' balanced salt solution)에 부유시켰다. 세포밀 도는 본 연구진의 예비실험 결과상 이종이식시 누드 마우스에서 100% 종양 발생능을 보인 최소 세포수로서 KB세포의 경우 5⨯
105개였다[20]. 마취상태를 유도하기 위하여 zolazepam (ZoletilⓇ, Virbac, Carros, France) 1.5 mg/kg과 xylazine hydrochloride (Rumpun Ⓡ, Bayer Korea, Korea) 3.5 mg/kg의 혼합액을 대퇴 부에 근육주사 하였다. 10분 경과 후, 50μl의 HBSS에 부유시킨 암세포 주입액을 1 ml 시린지와 27게이지의 주사침을 사용하여 10마리의 누드 마우스의 구강저 부위, 즉 피부쪽에서 주사침을 삽입하여 양측 교근사이의 조직공간으로 진행한 후 구강 점막하 조직 내에 정해진 종양세포를 이종이식하였다(Fig. 1B).
Fig. 1. Gross features of the orthotopic murine tumors of human OSCC. (A) Inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor (E7080). (B) 5x105 cells of human OSCC (KB cell line) were injected into the tissue space of mouth floor of mouse. (C) Measurement of the tumor size. (D) Dissected view of the tumor. Black arrow heads indicate reactive lymph node and jugular vein around the tumor. (E) Excision of the reactive lymph nodes.
4. 실험동물의 치료
10마리의 실험동물을 무작위로 2군(n=5)으로 분류하여 1군은 대조군, 2군은 E7080 치료군으로 설정하였다. 즉, 1군은 플라시 보 치료만을 시행하였으며 2군은 종양세포 이식 후 종양발생을 확인한 시점부터 E7080을 1마리 당 1회에 5 mg/kg을 생리식염 수에 희석하여 매일 1회씩 경구투여를 시행하였다(Fig. 1A). 치료 시작 후 3주 경과된 시점에서 모든 실험동물을 희생시켜 치료를 종결하였다.
5. 실험동물의 관찰 및 희생
종양세포 이종이식 후 실험동물은 종양이 인지될 때까지 매일 관찰되었고, 종양 발생 후에는 1주일에 2회 종양의 증식을 기록하 였다. 종물의 크기는 캘리퍼를 이용하여 그 장경과 단경을 cepha- lad-to-caudad/left-to-right로 측정, 기록한 후 종양의 부피를 다음의 공식으로 산출하였다; (장경)×(단경)2×π/6, π=3.14 (Fig. 1C). 실험동물의 체중 역시 1주에 2회 동일 시점에서 측정, 기록하였다. 안락사 후, 원발성 종양 부위를 절제하여 그 무게를 측정한 후 종물을 이등분하여 반은 헤마톡실린-에오신 염색을 위하여 포르말린 고정 후 파라핀에 포매하였고, 나머지 반은 신선 도를 유지하기 위하여 냉동고(−70oC)에 보관하였다. 원발성 종 양 외에도 좌, 우측 경부 림프절 각각 2개씩 총 4개를 절제하여 전이병소 발생 여부에 대한 조직학적 검사를 시행하였다(Fig.
1D, E).
6. 면역조직화학염색을 위한 항체 및 시약
면역조직화학염색에는 다음의 일차항체들이 사용되었다: pol- yclonal goat anti-VEGF-C (ab18883, Abcam, MA, USA), monoclonal mouse anti-VEGFR-2 (Flk-1) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), polyclonal rabbit anti- VEGFR-3 (ab27278, Abcam, MA, USA), polyclonal rab- bit anti- phosphorylated-VEGFR-2/3 (pVEGFR-2/3, PC460, Calbiochem, Frankfurt, Germany), monoclonal mouse D2-40 D2-40 (M3619, Dako, USA) 이차항체로는 goat an- ti-rabbit HRP (horeseradish peroxidase, Jackson Immuno- Research Laboratories, West Grove, USA), peroxidase con- jugated goat anti-rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, USA), rabbit polyclonal anti-goat IgG (ab6741, Abcam, MA, USA)이 이용되었으며, 발색을 위하 여 DAB (3,3-diaminobenzine, Research Genetics, Hunts- ville, USA)이 사용되었다.
7. 면역조직화학염색
VEGF-C, VEGFR-2, VEGFR-3, pVEGFR-2/3의 면역조직화 학염색을 위해서 파라핀 포매 조직을 이용하였으며, 항체 제조사 의 지시대로 다음과 같이 염색을 시행하였다. 파라핀 포매 조직을 4∼6μm로 세절하여 생긴 조직절편을 양성 전하를 띤 슬라이드 위에 올려놓고, 57∼60oC 정도의 열을 30∼40분 정도 가하여 왁스성분의 제거를 용이하게 하였다. 자일렌 용액으로 왁스를
Fig. 2. Tumor growth curve of the tumors, induced by the xeno- graft of human OSCC. OSCC, oral mucosal squamous cell carcinoma.
염색의 경우 조직 슬라이드를 10 mM sodium cirate 완충액(pH 6.0)에 담근 상태에서 전자렌지에서 마이크로웨이브를 이용하여 2분 30초간 강가열후 7분 30초간 약가열하였다. VEGF-C, VEGFR-2 염색의 경우 항원성 회복을 위한 특별한 처리는 시행하 지 않았다. 이후 내인성 과산화효소(endogenous peroxidase) 의 활성을 억제하기 위하여 3% H2O2 메탄올 용액에서 12분간 두었다. 이후 조직절편을 다시 PBS로 3분간 3차례 수세 후, 상온 에서 비특이 단백의 결합을 차단하기 위하여 5% 정상 말 혈청과 1% 정상 양 혈청을 PBS에 섞은 단백 차단액에 20분간 반응시켰 다. 단백 차단액 제거 후 단백 차단액에 일차항체를 적용하여 4oC에서 밤새 결합시켰다. 일차 항체는 제조사에서 제시한 희석 비율에 따라 VEGF-C (1：50), VEGFR-2 (1：50), VEGFR-3 (1：100), pVEGFR-2/3 (1：200), D2-40 (1：100)의 비율로 희석하여 사용하였다. 음성대조 표본은 PBS만을 적용하였다.
PBS로 3분간 3차례 수세하고 단백 차단액을 10분간 적용한 후, 단백 차단액을 제거하고 단백 차단액에 1：500으로 희석시킨 이차 항체인 goat anti-rabbit HRP를 상온에서 30분간 반응시켰 다. 슬라이드를 PBS로 3분간 3차례 수세 후 발색반응을 위하여 DAB을 적용하였다. 이때 발색반응을 현미경으로 확인해가며 적 정시간 적용하되 5분을 넘지 않도록 한다. 증류수로 3분간 3회 수세 후, 헤마톡실린으로 대조염색을 50초간 시행하였다. 흐르는 증류수로 대조염색을 중지시키고 세포핵을 푸른색으로 강조하기 위하여 PBS를 30∼60초간 적용하였다. 증류수로 모든 염기 성분 이 제거되도록 철저히 수세한 후 마운트를 2∼3방울 적용하고 50∼60oC의 열판에서 5∼10분 정도 중합시켜 고정하였다.
8. 림프관 밀도
림프관 밀도(lymphatic vessel density, LVD)를 측정하기 위 하여 림프관 내피세포 표지자인 D2-40에 의해 염색된 표본에서 종양관련 림프관 내피세포의 농도를 구하였다. 먼저 40배의 저배 율 하에서 종물의 주변부에서 종양관련 림프관이 집중적으로 분포 된 부위를 확인한 후, 그 부위에서 200배의 배율로 확대하여 슬라이드 당 4부위씩 가장 밀도가 높다고 여겨지는 부위를 택하여 0.039 mm2 영역에서 D2-40 항체에 의하여 염색된 내피세포로 이루어진 림프관의 숫자를 측정하여 그 평균치를 비교, 분석하였 다.
9. 자료 분석 및 통계
각 인자의 면역조직화학염색에 대한 양성반응을 확인하고 그 분포 부위를 확인하기 위해서 대조염색을 시행한 슬라이드를 제작 하였다. 400배의 배율 하에서 각 슬라이드 당 4부위씩 종양조직의
관찰하였다. DAB에 의해 양성반응이 나타난 부위를 SigmaScan Pro 영상분석 소프트웨어(SigmaScan Pro 5.0, SPSS Science, USA)를 통해 표시하고, 그 분포 부위를 확인하였다. 발현 정도의 비교를 위하여 SigmaScan Pro 영상분석 소프트웨어에서 DAB에 의한 양성반응의 강도를 OD (optical density)값으로 수치화한 후 평가하였다. OD값 측정시에는 실험내용을 모르는 계측자에 의해 대표적인 염색이 시행되었다고 생각되는 부위를 무작위적으 로 설정 후, 목표지점에서의 수치를 측정하고 해당 슬라이드에서 의 배경 염색(background staining)된 수치를 빼서 데이터로 이용하였다. 실험군과 대조군 간의 양성반응의 강도 비교는 Student t-test를 이용하여 통계 처리하였다. 통계 분석시 0.05 이하의 P 값을 유의성 있는 차이로 인정하였다.
결 과
1. 종양세포 이식소견
인간의 구강 편평상피세포암 세포주를 누드 마우스의 구강저에 이종이식한 결과 10마리 모두에서 성공적으로 종양이 발생되었으 며 종양세포를 이식한 후 육안으로 인지 가능한 종양 결절이 생기기까지는 평균 약 7일이 소요되었다(Fig. 1).
2. 종양성장 곡선
종양세포의 이식 후 시간이 경과함에 따라 모든 실험동물에서 종양의 발생과 성장이 관찰되었으며 각 실험군의 종물증식 속도는 종양의 부피로 표현한 종양성장곡선으로 나타냈다. 그 결과 약물
Fig. 3. Body weight change curve of the mouse during the ex- perimental periods.
Fig. 4. Histological features of KB tumors and cervical lymph node (H&E staining, original magnification ×200). (A, B) Tumor cells are infiltrated into the tissue (A: Control group, B: Experimental group). (C) The tumor cells in cervical lymph nodes of control group.
Table 1. Incidence of regional metastasis in the murine orthotopic tumors of human oral squamous cell carcinoma
Mouth floor Cervical lymph nodes
Control group 5 1
Experimental group 5 0
Table 2. Quantitative immunohistochemical analysis of bio- markers from tumor specimens of mouse, xenografted with hu- man OSCC cell line (Unit: Pixel/slide, P＜0.05)
Control group Experimental group P VEGF-C 2,484±557.76 1,069±418.05 0.064 VEGFR-2 450.33±296.17 210.33±119.51 0.204 VEGFR-3 2,487.33±389.79 1,681.67±630.26 0.132 pVEGFR-2/3 3,105.67±506.07 538.33±215.78 0.008a D2-40 410.67±163.08 68.67±34.78 0.048a
aP value: between the control group and the experimental groups (Student t-test).
투여를 시행한 실험군과 대조군 모두에서 시간이 경과함에 따라 종양부피의 증가가 관찰되었으며 특히 대조군에서의 증가 양상이 더욱 뚜렷하였다(Fig. 2).
3. 체중변화 곡선
실험기간 동안 실험동물의 건강 상태와 숙주에 대한 약물의 독성 정도를 간접적으로 평가하기 위하여 체중 변화를 측정하였 다. 종양세포의 이식후 시간이 경과함에 따라 체중의 감소가 관찰 되었다. 특히 약물 투여를 시행한 실험군에서는 체중 감소가 미약 하였으며 실험동물이 비교적 건강한 상태로 유지된 반면, 대조군 에서는 시간이 경과함에 따라 체중의 급격한 감소가 나타났고 건강 상태 또한 악화된 소견을 보았다(Fig. 3).
4. 부검 소견
실험동물의 희생 시점을 기준으로 부검한 결과 조직학적으로 원발성 종양부위의 조직 내에서 종양세포가 발견되었다(Fig. 4A, B). 또한 조직학적으로 발견된 림프절 전이 병소는 대조군에서
1마리에서만 발견되었으며 실험동물 전체에 대한 림프절 전이율 은 10%였다(Table 1 & Fig. 4C).
5. 면역조직화학적 분석
인간의 구강 편평상피세포암 세포주에 의해 유도된 누드 마우스 종양에서 신생 혈관 생성과 신생 림프관 형성을 통한 종양 증식 및 전이관련 인자들이 약물 투여 여부에 따라 어떠한 발현 차이를 나타내는지 알아보기 위해 VEGF-C, VEGFR-2, VEGFR-3, pVEGFR-2/3, D2-40 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 시 행하였다. 실험동물의 희생 시점을 기준으로 부검한 결과 약물 투여를 시행한 실험군에 비해 대조군에서 모든 관련 인자들의 발현이 증가되어 나타났다(Fig. 5). 관련 인자 중 VEGF-C와 VEGFR-2, VEGFR-3에 대한 면역조직화학 반응의 강도는 통계적 으로 유의한 차이는 없었으나(P＞0.05), pVEGFR-2/3와 D2-40 에서는 유의한 차이가 관찰되었다(P＜0.05, Table 2 & Fig. 5).
Fig. 5. Immunohistochemical stain- ing of KB tumor in athymic nude mice (original magnification ×400).
Intensity of staining for VEGF-C, VEGFR-2, VEGFR-3, pVEGFR-2/3, D2-40 were higher in the control group than in the experimental group. Representative pictures were shown. Negative controls were stained without application of pri- mary antibody.
6. 림프관 밀도
인간의 구강 편평상피세포암 세포주에 의해 유도된 누드 마우스 종양에서 신생 림프관 형성 정도를 평가하기 위해 D2-40 항체로 면역조직화학 염색을 시행한 후 림프관 밀도(LVD)를 측정하였 다. D2-40에 양성반응을 보인 림프관 내피세포를 연구방법에 기술한 대로 계산한 결과, 대조군에서 5.1±2.2개인 반면 약물 치료를 시행한 실험군에서 2.8±1.6개로 유의한 차이를 보였다 (P＜0.05, Fig. 5).
고 찰
구강점막 편평상피세포암종은 두경부 영역에서 발생되는 대표
적인 구강암으로 림프관을 통하여 전이되는 경향이 강하며 이러한 전이 병소의 존재는 치료에 있어 불량한 예후 인자로 평가되고 있다. 신생 혈관 형성은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되 는 현상을 통틀어 의미하며, 정상적인 생리현상으로는 태생기의 발생 과정과 상처 치유, 여성의 생리주기 등을 예로 들 수 있다.
세포는 생존을 위해 혈관으로부터 공급되는 산소와 영양분을 필요 로 하며 이는 혈관으로부터 산소의 확산 범위에 해당하는 거리 내에 존재하게 된다. 이 범위를 벗어나게 되는 경우에는 생존을 위해 새로운 혈관의 생성을 유도하게 되며 이 과정은 정상 조직에 서는 종합적인 균형에 의해 엄격히 통제되어 있다. 종양조직 또한 성장과 증식을 위해서는 지속적인 산소와 영양공급이 필요하다.
즉 종양에 있어서 신생 혈관 형성과 신생 림프관 형성 과정은 종양 조직의 지속적인 증식과 악성 전이에 있어 필수적인 것이다
[21]. 따라서 만약 이 과정을 억제시킨다면 종양의 증식이 억제되 고 인접 림프절이나 원격 장기로의 전이를 억제되어 결국 암환자 의 생존율을 높이고 삶의 질을 높일 수 있을 것이다.
이와 같은 배경으로 저자는 본 연구를 통해 구강 편평상피세포 암 세포주를 이종이식한 마우스 모델에서 혈관내피성장인자 수용 체의 억제제 투여를 통해 신생 혈관 형성과 신생 림프관 형성 억제에 따른 치료 효과를 평가해 보았다. 우선 사용된 약물의 표적이 되는 VEGFR-2와 VEGFR-3뿐만 아니라 이 수용체와 결합 하는 리간드인 VEGF-C에 대한 발현 양상을 평가하였으며 또한 수용체가 활성화되어 실제로 기능을 하였는지에 대한 평가를 위해 pVEGFR-2/3의 발현 양상을 평가하였고 마지막으로 VEGF-C와 VEGFR-2, VEGFR-3 경로를 통한 신생 림프관 형성 여부를 알아 내기 위해 D2-40에 대한 발현 양상을 평가해 보았다.
기존의 수많은 연구에서 VEGF-A와 VEGFR-2를 통한 경로가 신생 혈관 형성에 관여한다는 것을 밝혔으며[12], 최근의 여러 연구에서 VEGF-C와 VEGF-D 또한 VEGFR-2나 VEGFR-3와 결 합하며 이 경로가 신생 혈관 형성과 신생 림프관 형성에 관여하는 것을 추가적으로 밝혔다[22]. VEGFR-2는 혈관 내피세포에 발현 되는 주 혈관 형성 매개인자로써 리간드로 VEGF-A뿐만 아니라 VEGF-C와 VEGF-D를 결합하며, VEGFR-3는 림프관 내피세포 에 발현되는 주 림프관 형성 매개인자로써 VEGF-C와 VEGF-D와 의 결합을 통해 활성화된다[23,24].
종양세포와 종양조직에서 검출된 VEGFR-3와 그 리간드인 VEGF-C와 VEGF-D가 어떤 발현 분포를 갖는지에 대해 밝힌 기존의 연구를 참조한 결과, 리간드인 VEGF-C와 VEGF-D는 종양세포 주변에 분포하는 종양관련 내피세포뿐만 아니라 많은 표본의 종양세포에서도 발현되고 있음을 알 수 있었다. VEGF-C 와 그 수용체인 VEGFR-3가 정상조직에 비교하여 두경부 편평상 피세포암 조직에서 과발현되어 있다는 보고도 있었으며[25], 특히 여러 종양세포 중에서도 주변 조직으로의 침습능이 강한 종양세포 일수록 이들 인자가 더욱 강하게 발현됨이 발견됨에 따라 VEGF-C와 VEGF-D 인자가 구강암 종양세포의 성장과 전이에 있어 중요한 역할을 할 것으로 추측할 수 있었다[26]. 이 중 VEGF-D보다 VEGF-C의 발현 빈도나 강도가 더 높아 구강점막 편평상피세포암종에서 주 림프관 형성인자는 VEGF-C로 추정하 였다[27]. 하지만 수용체인 VEGFR-3가 정상적인 발현을 보이는 상태에서 VEGF-C의 과발현만으로는 충분한 림프절 전이는 이루 어지지 않는다는 보고도 있다[19].
성숙한 림프관 내피세포는 podoplanin을 발현하며 이는 림프 관 형성에 중요한 뮤신형 막당단백으로 D2-40항체는 이를 감지하 며 생활력 있는 조직뿐만 아니라 파라핀 포매된 조직에서도 림프 관 형성을 간접적으로 식별해 낼 수 있다고 알려져 있다[28].
따라서 본 연구에서도 D2-40 항체의 면역조직화학 염색을 통해 혈관과 구분되는 림프관을 계수함으로써 림프관 밀도(LVD)를
평가하였으며 이를 통해 종양조직에 의한 신생 림프관 형성 여부 를 알 수 있을 것이다. 종양조직을 정상조직과 비교를 한 결과에서 종양조직에서의 종양관련 신생 혈관 형성은 종물 내에서 전체적으 로 나타나는 반면에 신생 림프관 형성은 심부 종물 부위에서는 그 분포가 감소되며 이와 관련해 종물의 심부에서 VEGF-C의 발현이 감소되어 있었다[29]. 실제로 종물의 크기가 일정 수준을 넘어서게 되면 종물의 심부는 혈관과의 거리가 멀어져 상대적으로 산소와 영양분의 공급이 부족하게 되어 점차 조직의 괴사가 진행 된다.
본 연구 결과에서 인접 림프절로의 악성 전이는 실험군의 1개체 에서만 발생되었는데 이것이 약물 치료에 따른 신생 림프관 형성 억제에 의한 것인지 아닌지에 대해서는 명확하지 않다. 따라서 약물에 의한 신생 림프관 형성 억제 효과를 정확히 평가하기 위해서는 더 많은 개체수의 실험동물을 대상으로 해서 림프절에 대해 추가적인 면역조직화학염색이 필요할 것으로 생각된다. 종 양성장 곡선에 대한 분석에서 대조군과 실험군 모두에서 시간이 경과함에 따라 종양의 부피가 계속 커지고 있음을 보여주었으나 실험군에서는 상대적으로 종양성장이 억제되어 증가 속도가 둔화 된 소견을 보였다. 이는 혈관내피 성장인자 수용체의 억제제를 지속적으로 투여하여 종양부피가 감소되었다는 기존 문헌의 결과 와 달랐는데[30,31], 이것은 사용된 약물의 용량과 투여 기간의 차이로 인한 것으로 추정된다. 하지만 체중변화 곡선에 대한 분석 에서 시간이 경과함에 따라 급격히 체중이 감소되었던 대조군과 달리 약물을 투여한 실험군에서는 시간이 경과함에도 불구하고 체중이 비교적 안정되게 유지되는 소견을 보였다. 따라서 본 연구 에서 투여한 약물의 용량은 종양부피의 절대적인 감소를 보여주지 못하였지만 최소한의 종양성장 억제능을 나타냈다고 생각된다.
VEGF와 결합하여 신생 혈관 형성을 억제하여 항암효과를 나타 내는[32] 것으로 알려진 기존 약물과 달리 본 연구에서 사용된 약물은 VEGF가 아닌 수용체인 VEGFR을 표적으로 한다. 따라서 수용체의 활성화를 의미하는 인산화된 형태의 수용체의 발현은 약물 투여로 인해 억제될 것으로 결과를 예상하였으며 실제 결과 에서도 대조군에 비해 실험군에서 유의한 차이로 pVEGFR-2/3의 저발현이 나타났다. 또한 수용체의 활성화를 억제시킴에 따라 신생 림프관 형성이 억제되어 D2-40의 저발현 및 낮은 림프관 밀도를 예상하였으며 실제 결과에서도 대조군에 비해 실험군에서 유의한 차이로 D2-40의 저발현이 나타났다. 또한 관련 인자들 중에서 VEGF-C와 비활성화 상태의 수용체도 포함되는 VEGFR- 2, VEGFR-3에 대한 면역조직화학 염색의 발현 정도에 대해서는 대조군과 실험군 간에 차이가 없을 것이라는 예상을 하였다. 하지 만 실제 결과에서는 유의한 차이는 아니었지만 대조군에 비해 실험군에서 저발현되는 소견을 보여주었는데 이는 약물의 표적이 되는 VEGFR-2와 VEGFR-3가 약물에 의해 지속적으로 억제됨으 로써 수용체와 결합해야할 리간드인 VEGF-C 생성의 down-reg-
Acknowledgements
This study was supported by a grant of the Korea Healthcare technology R&D Project, Ministry of Health &
Welfare, Republic of Korea (A080293).
References
1. Kupferman ME, Myers JN. Molecular biology of oral cavity squamous cell carcinoma. Otolaryngol Clin North Am 2006;
39:229-47.
2. Silverman S Jr. Demographics and occurrence of oral and pharyngeal cancers. The outcomes, the trends, the chalenge.
J Am Dent Assoc 2001;132(Suppl):7S-11S.
3. Stacker SA, Achen MG, Jussila L, Baldwin ME, Alitalo K.
Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer 2002;2:573-83.
4. Gershenwald JE, Fidler IJ. Cancer. Targeting lymphatic metastasis. Science 2002;296:1811-2.
5. Sticht C, Freier K, Knöpfle K, et al. Activation of MAP kin- ase signaling through ERK5 but not ERK1 expression is as- sociated with lymph node metastases in oral squamous cell carcinoma (OSCC). Neoplasia 2008;10:462-70.
6. Ho CM, Lam KH, Wei WI, Lau SK, Lam LK. Occult lymph node metastasis in small oral tongue cancers. Head Neck 1992;14:359-63.
7. Ferrara N. VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors. Nat Rev Cancer 2002;2:795-803.
8. Alitalo K, Carmeliet P. Molecular mechanisms of lym- phangiogenesis in health and disease. Cancer Cell 2002;1:
219-27.
9. Willett CG, BoucherY, di Tomaso E, et al. Direct evidence that the VEGF-specific antibody bevacizumab has antivascu- lar effects in human rectal cancer. Nat Med 2004;10:145-7.
10. Motzer RJ, Michaelson MD, Redman BG, et al. Activity of SU11248, a multitargeted inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor and plateletderived growth factor re- ceptor, in patients with metastatic renal cell carcinoma. J Clin Oncol 2006;24:16-24.
11. Escudier B, EisenT, StadlerWM, et al. Sorafenib in advanced clear-cell renal-cell carcinoma. N Engl J Med 2007;356:125- 34.
12. Joukov V, Sorsa T, Kumar V, et al. Proteolytic processing regulates receptor specificity and activity of VEGF-C. EMBO J 1997;16:3898-911.
13. Nakamura Y, Yasuoka H, Tsujimoto M, et al. Lymph vessel density correlates with nodal status, VEGF-C expression, and prognosis in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2005;91:
125-32.
14. Tsurusaki T, Kanda S, Sakai H, et al. Vascular endothelial growth factor-C expression in human prostatic carcinoma and its relationship to lymph node metastasis. Br J Cancer
1999;5:1823-9.
16. Niki T, Iba S, Tokunou M, Yamada T, Matsuno Y, Hirohashi S. Expression of vascular endothelial growth factors A, B, C, and D and their relationships to lymph node status in lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res 2000;6:2431-9.
17. Lee CC, Faries MB, Wanek LA, Morton DL. Improved sur- vival after lymphadenectomy for nodal metastasis from an unknown primary melanoma. J Clin Oncol 2008;26:535-41.
18. Karpanen T, Egeblad M, Karkkainen MJ, et al. Vascular en- dothelial growth factor C promotes tumor lymphangio- genesis and intralymphatic tumor growth. Cancer Res 2001;
61:1786-90.
19. Roberts N, Kloos B, Cassella M, et al. Inhibition of VEGFR-3 activation with the antagonistic antibody more potently sup- presses lymph node and distant metastases than inactivation of VEGFR-2. Cancer Res 2006;66:2650-7.
20. Park YW, Younes MN, Jasser SA, et al. AEE788, a dual ty- rosine kinase receptor inhibitor, induces endothelial cell apoptosis in human cutaneous squamous cell carcinoma xenografts in nude mice. Clin Cancer Res 2005;11:1963-73.
21. Fidler IJ, Ellis LM. The implications of angiogenesis for the biology and therapy of cancer metastasis. Cell 1994;79:185- 8.
22. Stacker SA, Williams RA, Achen MG. Lymphangiogenic growth factors as markers of tumor metastasis. APMIS 2004;
112:539-49.
23. He Y, Rajantie I, Pajusola K, et al. Vascular endothelial cell growth factor receptor 3-mediated activation of lymphatic endothelium is crucial for tumor cell entry and spread via lymphatic vessels. Cancer Res 2005;65:4739-46
24. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Med 1995;1:27-31.
25. Neuchrist C, Erovic BM, Handisurya A, et al. Vascular endo- thelial growth factor C and vascular endothelial growth fac- tor receptor 3 expression in squamous cell carcinomas of the head and neck. Head Neck 2003;25:464-74.
26. Park YW, Kim SG, Kim SH, Kim HS, Kim MK. Gene ex- pression for lymphangiogenic factors in oral mucosal squ- amous cell carcinoma. J Korean Acad Maxillofac Plast Reconst Surg 2009;31:453-60.
27. Van Trappen PO, Steele D, Lowe DG, et al. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF)-C and VEGF-D, and their receptor VEGFR-3, during different stages of cer- vical carcinogenesis. J Pathol 2003;201:544-54.
28. Gombos Z, Xu X, Chu CS, Zhang PJ, Acs G. Peritumoral lymphatic vessel density and vascular endothelial growth factor C expression in early stage squamous cell carcinoma of the uterine cervix. Clin Cancer Res 2005;11:8364-71.
29. Ohno F, Nacknishi H, Abe A, et al. Regional difference in intratumoral lymphangiogenesis of oral squamous cell carci- nomas evaluated by immunohistochemistry using D2-40 and podoplanin antibody: an analysis in comparison with angio- genesis. J Oral Pathol Med 2007;36:281-9.
30. Matsui J, Funahashi Y, Uenaka T, Watanabe T, Tsuruoka A, Asada M. Multi-kinase inhibitor E7080 suppresses lymph
node and lung metastases of human mammary breast tumor MDA-MB-231 via inhibition of VEGFR-2 and VEGFR-3 kinase. Clin Cancer Res 2008;14:5459-65.
31. Matsui J, Yamamoto Y, Funahashi Y, et al. E7080, a novel inhibitor that targets multiple kinases, has potent antitumor activities against stem cell factor producing human small cell
lung cancer H146, based on angiogenesis inhibition. Int J Cancer 2008;122:664-71.
32. Hurwitz H, Fehrenbacher L, Novotny W, et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 2004;350:2335-42.
