소 난자의 체외성숙 시 난구세포와의 공동배양이 체외수정 후 난자의 발육에 미치는 영향

(1)

www.earticle.net

동융자원연구 21(2):82-87 (2010)

Annals of Animal Rcsouπ、s Scicnæs 21α:):82-87 (2010)

소 난자의 체외성숙 시 는댄세포와의 공동배앙이 체외수정 후 난자의 발육에 미치는 영향

전혜레나1 청회태2

.

OJ-부근1 박춘근，.

강원대학교 동붕생명과학대학 강원대학교 수의과대학2

Effects of Co-cuIture with Cumulus Cells on bz Vitro Maturation

뻐d [농velopment

of Bovine Oocytes

Hy~Le-Na

Jeon1

, Hee-Tae Oteong2

,’

ßo<>.K에n

Yang’ and G1oon-Keun Part·

때l쩡

01

Alli"찌

/ife Scie"æs, Kilngux:m Natio^l1o/

미liversity，

‘ Co/l，앵'e of Veterinnry Medicine, ^Kangt

‘

^{xm Nation}^.a1University

ABSfRACf

The ^0따tiveof this study ^뼈^{!。 뼈uate}the effects of ^∞。J1tureof bovine oocytes with αm띠 us cells on in vitro maturation arνj development followîng in vitro fertilization în bovine oocytes, Bovine cum띠u&<JOCyte

∞뼈，Iexes (，α:G) 때 denuded oocytes (00) were co-rultl뼈 with the cumulus cells in 1CM199 for 2(• 22 tu-, and evaluated the nudear type of αx:yte. After i" vitro maturatior、 oocyte;

‘

^w^rt'coio::ubated for ^j"t^,;fro fertilization with frozen-thawed s야rπ\atozoa selected by 65% ^야π011in ^DM-H，야)il.rtn aI、d DM-Caffeine for 1^5-18 tu-. Prεωnptive zygotes W'eI"e 떼 tured for 48 hr în 0깅aa ,’, uitro culture IT생ium with 10% FB5, ar녕 ev피uated the deavage rates. 1he results confirmed that the hi영-.，;1 떠"('ffitage of rret:ap띠"， 11 α4미 stage was observed in ax::s (30.H3.5%, 24.2:1:1.8%) as ∞mpared to 0。σ1:tl.3%， 17.4:tl3.9%) (p에뼈 In addition. the incr얹혀

c1eavage rates were φtained from ax::s (69.6:t21%, 75.6:t2.9%) ‘이m ∞mp'"떠 to DO (.잉 6û.5%, 29.5:!:l26%)

@에 α)). In ∞nclusion， th잉 study suggested that αmulus cells 앙8언ed positive fac

‘

^ors ^during^íll ^vitro

maruration of oocytes and early embryonic development after ;11 vitro fertilization of bovine (x양e

(Key words: Bovine oocytes, Co-c띠bure， 0ωm매 us cells, ItJ vitro maturatioπ Embryo development)

[

서론

2αη년부터 소고기 이력제가 시앵핑에 따라 이력추척을

위해 영확한 개제정보가 핑요하게

되

었고 이러한 개제식영 시스댐용 통해 우수 유전자원의 정보흩 활용하고 있다 기존

얘 개쩨 정보가 영확하지 않았댄 도축왼 압소로부터 채집한 난소흉 。l용항 정우 영확하지 않은 유전정보흉 사용하재 되 므로 우수형질올 활용할 수 없다 한연 영확한 유전정보릉 가진 우수형쟁의 앙소가 도축휠 때 그 개체의 우수행정용

황용할 수 있고 우수형질융 사용하기 위

해서

는 체외수갱용 통한 수정란 생산기술의 영요성이 커지고 있냐 그러나 하나

의 개체에는 두 개의 난소뿐이"， 하나의 난소에서 얻용 수

있는 난자의 개수는 재한적이다 이를 난^fOII서 우수 난

자흉

선병하여 이용원 수 있는 난자의 수는 급격히 떨어지게 되 고 선별한 난자

내

에서도 인공수정에 쓰이는 수정란으후 빵 랄하는 난사는

얘우

척다 따각서 체외수갱란올 수갱란이식 에 도입.j.는데

문재갱융

안견하였고 개채앵 채외수정란 생 산성 향상과 이용 중대률

위

한 안정적인 체외수갱랑 생산은 정상쩍인 셰내 조건과 같은 만촉할만한 수준이1 도당하지 옷 하였다 이려한 문제훌 극복하기 위해 난포액이나 혹」F액퉁과 같은 체액의 이원'CoIlas 둥"

1991),

난굉장피세포.(Eyestone과

First, 19t:에/

난구세포(GoI。 등

IS1'l8)등과

같은 공동배양이

• αI'TCSponding author: Choon-Kcun Park, D:!α 이 Animal Biotcchnology, collcge of A찌"'" 미c SciCOC'CS, Kan양NOn Nati Oi때 University, Dlundleon '2f.μπn， Korea. Tl언 +82-33녕;()&;2]. ε”‘lil: fWi<.ck@kang“~.ιk

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(2)

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황항하게 이루어지고 있다 。l전의 실험올 흥혜 채외성숙시 기에 셰세포와 공동배양이 돼지， 개 등의 난자 핵 성숙에 긍 갱척인

효과가 었다고 뺑졌다κatska 둥

1995; Abeydeern

동.， 11})8; Hewitt와 En잉 and， 1999; Bureau 둥" 200);

&썽jo!，。 둥" 2(x)2; μßsa 둥， 2002; Kid∞n 둥， 2003) 체세포 의

종류인 난판상피세포와 난자와의

공동배양용

제외에서 왜지 난자 성숙과 체외 배

생산

효올올 향상시키고(Ooen

퉁， 20(6)

다정자수정 6낸용

낮추oj，

자용 전핵단계에

도당

하는 난자의 비융율 중가시켰다ρ，buc과

5때'" 1995)

또

한 난구애포는 정자 가능올 향상시키고(G씨kin 퉁， 1m;

Boatrnan과 Rol쳐05， 1991), 다갱자 수정을 제여하며

(Overstreet 퉁.， 1978; Cununiæ와 Yanagimachi, 1쨌)， 수갱

시 정자률 낭사 쪽으로 유도한대Austin과

Brnden, 1952)

한충 더 나아가

난구세 g는

수정이 이루어지는 낭관 앵대부

의

환정에시쳐령

갱자에게

비슷한

직용을

한다따dford와 Ki，π

19Ç에 따라서 본 연구는 소 난구세포올 회수， 배양하 여 체내 난포~정과 비슷한 환정 죠성올 통혜 난구세포와 공동애양

시 난자의 성숙율파 배 발달융에 미치는 영양올

검토하였다

IL

재료및 방법

1 뇨맘새포의 준비

도상

직후

적충원 소의 난소로부터 채취한 난지-난구 복 합체를 인위켜으로 툴리켜얀 아창을 이용해 난자와 난구세

포률

분리시킨 후 낭구써포만용 수집하였다 수짐한

난구세

포률

10% FBS가

챙기핀 TCM-I99배양액으로

2-3회 에척

후 세포수융

1-2x1if

cell/ m1의 농도로 조정하여

4“~Il

<tish에 배양액과 항께 500 이썩 분주하였으며 38.5'(;, 5%

CD，의

조건으로

얘양하였다 24시간

애양 후 상충액융 재거 하고 새로운 배양액올 갱가하여 체외애양에 이용하였다

미성숙 난포란올 채취하었다 채취한 미성숙 난자 중 난구 세포가 치얻하고 3층 이상이여 세포갱이 균칭한 난포란 만

을

선멸하여

난지~난구옥함에툴 대조군으로 난구세포툴 풀 리척인 방법으로 재거한 남자훌 처리군으로 나누어

TCM.

199배양액에 10% FB5, 0.1% fGF읍 정가하여 조성원 배양 액에서 2-3회 세척하였다 이를 난자를 난구세포가 당총으 로 작성왼 4써성l 이sh에 옹겨 500 띠의 배양액올 분주한 :f

20-22시간동안 38.5'(;, 5% αi가 유지되는 인큐베이터에서 공동배양하였다

2)

난자의 성숙융분석

난자의

성숙윷온

mæm염색옹 이용하여 분석하였다 체 외생숙원 낭자릅 난구세포흘 완벽히 제거한 후

211개썩

슬라 이드 글라스

위에

옳긴 후 커버글라스훌 덮어

acetate9J.

이hanol이 1 대 3.91 비융로 혼합한 고정액에서 2-4일 동안

고정시켰다

그

후 난자는

1%

acetic-αæm으로

10분

동안 영씩한 후" aceto-잉y=이로

세척하였다 영색왼

난

'''1볕

현 미정하에서

액형올

판찰함으흐써 성숙융올 분석하였다

3 제외수정

20- 22시간 체외성숙이 유도왼 난자를 난구세포가 화장왼

난포란용 선별하여

제외수정 배양액인 0.1 g ffiA가 청가왼 α싸k뼈rinE.후

3회

세혀

후

157H의 난x←즘 % 띠의

체외

배양 소적으로 융긴 후 보관하였다 동결정액올 37'(;의 항 용 수조에서 45호간 융해 후 1 m!의 65% 어mU에 운주해 3(0) ')'m에서 10분간 원심분리하였다 운동성이 있는 정자

수가 2xl

<f

개1m!가 되도록 하여 채외수정 배양액

DMζaffeine과 혼항해 재외배양 소척에 50 씨씌 분주한 후，

38.5 '(;, 5%

CD，가

유지되는 인큐베이터얘서 15-18시간 수

정시켰다

4 체외배앙

수정배양액으로부터 수정원 난지융 회수하여 난구세포와

2

난자의 핵 싱숙 갱자용 제거 후

10%

FBS가 청가왼 。갱 aa 얘양액으로 3회

새척

:f5O

띠의 셰외배양 소객에 용겨 48시간 배양하였다

1) 난포란외 희수 및 예외성숙

도촉'lNl서 희수한 년소릎 38'(;의 멸균

생리식염수로 5 통계분석 1-2회 새척한 다용 칭척하여 실험실로 운반하였다 난포란

의

채취는

18-gauge의

주사칭이 장작된 주사기로

2-7 mm

온 연구얘서 얻어진 경파를은

SA5 9.1 Duncan

다중검정

의

난포로부터 난포액과 함께 난포란율 홈입하는 땅엄율

사

으로 통계

분석하였jl， p<O.05 야하의

유의성 경과를올 서

용하였대 난포액과 난포란의 혼합올얘 l객&PVA륭 회석해 '" 비교하였다

(3)

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84 용융자원연구 제 21 킨 Z호 (201이

m.

^결과및 ^고찰

셰외성숙 시

난구세포와 공동얘양의 유무에

여흔 난자의 형태학척 변화오습용 Fig. 1 에 나타내었다

난^f.난구쩍←합채를

난구세포와 공동배양

하였올 때

큰 차

이는 나타내지

않았으나 공동배양하지 않온 난지-닌구복합 체에

비해

난구세포 앵창현상이

더

크게

나타냈다 20-22시

간 성숙시킨 난구셰포 제거 난자는 난구셰포와 공동배양하

여

성숙시킨

갱우예 비해 세포질의

용축， 흐릿혜진

또는 어

두워지는 현상이 더 많이 관창되었다 이전에 실험에서 난 구세포는 소(Liu 둥， 1‘195와

깅~ng 둥， 1995)와

버팔로σ)as 풍i

199끼 난자의 세포질

그리고 핵의 성숙에 휠요하다고

보

B

고되었다 아러한 결과흉 통해 난구세포홍 재거해 성숙시켰 용 경우 낭자의 세포갱이 현저히 떨어징이 판한핑얘 따라

셰외에서 성숙이 되었다고 해도 질 좋은 수정란 생산응

툴

가능할 것으료 생각되며， 또한 남구세포의 존재는

핵

성숙

완 아니라 난세포질에도 영향용 미치는 것으로 추측되었다 제외생숙

시 난구세포와 공동배양의 유우에

따흔

난자의

성숙정도를 Table 1에 나타냈다

체외생숙 후 남자의

핵형용 관창한

경파 수정이

가농한

성

숙낭자 단계인 M-U단계에서 난À}- 난구욕합체그훌(24.2:!:

1.8%, 30.1>3.5%)이 난구세포률 재거한 난자그룹(l.1>1.3%，

17.4:!:l3.9%)보다 성숙융이 유의책A로 높게 나타났다

@예 05)

또한 공동배양하지 않온

난자

내에서

난구세포룡

E 훌’·

• • ~훌

Fig. 1. Morphol야~ of bovine oocytes during in vitro maturation

" CIJCS (Cum버잉 Oocyte ∞nψlexes) before maturation,. B: cocs 하ter rnaturatiOl、 " CIJCS 따ter maturati^Ollco-cultured with rumulus α:11， D: 00 (denud띠 Ch:ytes) bcfore maturation. E: ∞ 따ter maturati^on,F: D。따tcr maturatlon ∞αJtured WÎth

마mul야 " ,11

Tablc 1. Nuclcar typc of bovinc 。‘>cytcs c<H:ulturcd with cumulus cclls during in νitro maturation Group No. of Nuc1"" ψ1"' of

@"""

^αgruSEM.^%)

00ni\e QI P-I M-I A-I T-I p.I1 wι11

CIJCS 66 0 11 10 1 4

2

‘

¹⁶

(0'이

06.7t3이i (l5.2i4외

(1.5t1 끼

‘ ^(6.1^t。이 (21.7'21) (24.2:tl.8)ab

=“

^?꺼 ^(L4:t¹^l.2)

{13.7i2.피i

¹⁰ (6.IHl⁵끼 (1.4:t¹l.6)" ('.1tU³3) (잉 5:t3.1) ³¹ (잉1>3.5)" ^깅

DO 70 ⁵ ^깅 ¹⁰ 8 7 ^U ³

(7.1:1:21) (329I9.에. 04.3t5 이 (11.4:1:1에‘ (10:1:4.6) (17.1:1:5 씨 σ l:tl.3)"

CO-D。 46 1 6 3 1 10 17 8

(22t3끼

(13.0:1:5.이b

(65:1:2에 (22)28)' (21.7:1:21) (37.0:1:14.1) (17.4:t13 의@

CIJCS, cum비야 oocψe Complexes, CD-OXS: cxxs ^roαltured^‘Nith^cum띠usælls, ro. ^D:muded 。∞_CO-oo D。

∞αltuæd with rumulus ccll, GV: Genninal Vesiclc, p.[: Prop벼'" 1, ^샤^1:Metaphase 1, A.I: Anaphase 1, T.I: ^Tcl。뼈.se1, M-II

M-ta"""'"

11

AA\<" Va1ues ‘^{Mth 이hπnt}letters within colWTll""lS are signilicantly dj떠'erent (p<O.ffi)

(4)

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Table 2 Oeavage of bovine embryos co-cu1tured with cumu1us cells during ;', vitro maturation

Group No 。이

C1 cavagl이%) ^{N。 이}embroys developed (Mean;tSEM,%)

αX'yte 2 cell 4 cell 8-16 cell Deg^‘

COCs 110 69^‘6%2.1' 20 20 32 33

(20.0::t3 끼 (20.9:t2.4t (29.H3.0)"

(30.0소

2.1)b

co-ccεs 155 75.6:t2.9" 38 30 48 39

(24.5::t3 이 (19.4:t2히. (31.0::t1.5)" (25.2소O.9)b

α〕 76 21.6!7.Sb 11 4 1 60

(14.5::t3.1) (5.3:t2.9)b (1.3::tl꺼b (78.9::t7.5)"

CO-OO 73 29.5::tl2.6b 12 10 1 %

(16.4::t6 이 (13.7:t6.2)‘ (1.4::tl.4)b (68.5! 12.6)"

O:DC cun 띠잉 。ocyte Complexes, CO-COCS: cocs co-cultured with αm띠잉 cells, 00: 다:!nuded Ch:ytes, CO-OO: 00

∞αltured with cumulus cell, I:kg.: IR양’lE!ration.

..., Va\ues wilh differcnl lclters wilhln ∞lumns are significantly 이fferent ψ얘뼈

제거히여 성숙사켰융 경우 이성숙난지 단계인 A-I (11.4::t 1 에단계가 유의척으로 높게 나타났고 같옹 미성숙난자 단 계인 P-I (329i9.8%)단계에서 공동배양하지 않옹

난구세포

제거낭자가 공동 배양한

남구세포

재거낭자{13.0::t 5.6%)보 다

유의격으로

높제 나타났다@이뼈

이성숙

난자의 비융 이

높아짐으로서

낮옹

성숙융에 따용

쩨외수정

또한

낮옹 수정융올

보일것이라고

추측왼다

본

실험응 난자의 높응 수정란 생산올 옥표도 하기에 체외성숙 시 난구세쪼의 필요

가 용가피하다고

생각된다 본 연구훌 통해 남구세포 유우에 따라 성숙난사 단계까지의 성숙융이 높아지는 것용 확인할

수 있었고 난구에포와 공동배양함에 따라 생숙융에 긍정걱

인 효과가 있응용 확인하였다

체외성숙

시 난구써포외

유우에 따라 성숙시킨

난자외

제 외수정 후 분할용용 Table 2에

나타냈다

수정 후 운할율을 판창환 경과 공용배양한 낭자난구북합 체 그흉{75.6소29%) 의 분항융이 일반객인 방엄으흐 체외생 숙시킨 난자난구복합체의 경우，69.6>2.1%)보다 높은 것으 호 나타났지만 유의직인 자이는

없었다

또한 닝구세포를 제거 .f여 낭구세포와 공동 배양환 경우，29.5<126%)와 대조 구j21.6<7.5%)에서

제외

성숙시킨 난자와도 유의적

차이가

냐타나지 않았다

그러나 난자-난구복합체용 성숙시켰흘

때의 분할융(69.6.

21%,

75.6>2.9%)이 난구세포용 제거혜

성숙시킨 난자의

분

할융ρ1.6::t7.5%， 29.5::tl26%) 에 비해 유의껴으로 높게 나타

났대P<O，뼈， 이러한

결파는 성숙시키기 션 남구세포의 유

무가

수갱얘

영향융

끼지는 것으로 생각된다

이전의

실험

에서는

취의

경우

난구세포흉 제거한 난자룡 쳐|외에서

배양 하었올

때 투영대가 정화되고(De f，마.e과 Siracusa. 1982), 투

영대의 경화는 수갱 비율의 갑소와 판언이 있다 (Gianfortoni 와 C띠yas， 198.되고 보고되었다 소에서는 채외수갱 이전에

난구세포 제거의 해로훈 효파가

관찰되었대'Co， 동.， 1993 zhang

둥，

1995: Fatehi 웅， 2002) 수갱

시 남구세포는 성숙 원 난자의

수정

비융을

향상시키고.(Co' 둥" 1993), 소 α.enz 둥， 198잉， 엠스터(Bavister， 1982), 얀간βock 둥" 1989)의 경 우 난구세포의 몇몇

요소을온

정자의 청제반용올 측진시킨 다 또한 체외수정 이진에 남구세포의 쩌거는 세포에 의해 분비되는 요인의 손실로 인해 분할율에 해로운 영향을 끼친 다{Fa핸j 둥， 2002) 이전의 실험파 본 설험올 통해 난구세

포의 유무에 따를 수정 에 는 여허 가지 요얀에 의해 와우핍

올 확인할 수 있었Jl， 난구세포가 난사의 분할융훌 높이는

데

효과가 있융올 확인하였다

본

연구의

결과로부터 닝구세포는

소

남자의 체외성숙과 셰외수정 후의 초기 애 말육에 긍정적인 효과가 았으며/ 추 후 이에 따릉 난구써포의 효과에 대한 얘카니즘옹 규명할 수 있도록 추가

실험이

필요하다고

생각완다

W

요약

용 연구는

소 난사의

체외생숙

시 낭구새포와의

공동배양

。1 체외수정 ~

낭자의

발육에

미치는

영향을 검토하였다 난.~~난구복합체와 난구세포용 채거한 난자로 나누어 TCM 199배양액에서 앙22시간동안

난구세포와

공동배양

시킨 후 。rrem

영씩올 실시해 난자의 빽형옹 운석하였다 성숙배

양

시킨

후

O싸야wπ1

배양액으흐

낭자흩 보관하고 65%

며℃이l로 운려한 풍결-융해왼 정자를 DM<affeine 배양액과

(5)

www.earticle.net

86 용융자원연구 제 21 킨 Z호 (201이

혼합해 15-18 시간수정시켰다 。l툴 난자는 α1 혀 배양액에 서 48시간 배양시켜 용항융을 완창하었다 난자의 성숙융융

관창한 결과

M-I딴계에서

난자난구복합체가(3O.H3.5%，

24.2.1.8%)가 난구세포훌 제거한 남자(7.1.1.3%， 17.4.13.9%)

보다 성숙융이 유의척으료 높게 나타났으며ψ<0뼈‘ 또한 공동배양하지 않옹 난자 내에서 난구세포용 쩌거하여 성숙 시켰올 정우 P-I β，29.9.8%) 이 유의적으로 높게 나타났다

(p<OO5)

분할용용 관창한 결과

난자-난구복합체률

성숙시

컸을

때의

분할융{f:8.6:t2.1%， 75.6:t29%)이 난구세포률 재거

해 성숙시킨 난자의 분할융{21.6.7.5%， 29.5t126%)에 "1해

유의적으로 높게 나타났다@이 O히 온 연구의 절과로부터 난구세포는 소

난자의

채외성숙파 체외수정 후의 초기 배 방육에 효과객인 울질의

분비가 있는

것으로 추측되며， 추

후 배반￥모의 방당을 지켜보는 추가싱험이 훨요하다고 생

각핑다

사사

본

연구는 농링수산식풍부 농링기술개벨사업(Grant N。

1α>007-3)의 지왼에

의해

이추어진

것이여， 연구의 수앵 시

소 정액의 보존파 분석을 위해 협조한 강원대학교 동율자원

공동연구소에 감사드립니다

V.

^인용문현

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(투고일 외10.12~ 수정일 2010.1213 판정일 2010.1214)