미니돼지 정액의 보존온도가 체외수정 및 발육에 미치는 영향

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(1)동물자원연구. Annals. of. 17:147-153. 2006. Anirn al. Resource Sciences 17:147-153, 2006. 미니돼지 정액의 보존온도가 체외수정 및 발육에 미치 는 영향. 안신혜 · 이주형 • 정희태1) 이동석 · 양부근 · 검정익 · 박춘근* 강원대학교 동물생명과학대학 1)강원대학교 수의학부대학. [Provider:earticle] Download by IP 118.70.52.165 at Monday, December 20, 2021 8:17 PM. 많fect. of Semen Storage Temperature on in vitro Fertilization and Development in Miniature Pig. Sin-Hye 뻐n， ]oo-Hyung Lee, Hee-Tae 다leon링)， [bn앙Seok Lee, Boo-Keun y，뻐용 Choung-Ik Kim and αlOon-Keun p，따k* Dφartment of Animal Biotechn1Jl ogy, Ka ngwon National Univer없ity S마001 of Veterinary Medicine, Kan，聊n Nati‘ onal Universityl J. ABSTRACf πús. study was to. investi쩔te. s야nn. the effect. storage temperature on in vitro fertilization. in miniature pig. When the spenn was storaged with different were. si맑ific없떠Y. (P<O.05). hi양ler. terrψerature，. the portions of nuclear formation. 0. in 17 C than that of 4 and 37"C. The portions of cleavage at 48h of. insemination were not significantly different among the spenn storaged at 4, 17 stages of. e않lyembry여. 뻐d developm앙\t. the portions of 4-16 cells and. 바빠ocysts. were. hi양ler. 뻐d. 37"C. In developmental. in spenn storaged 17"C than. 4 and 37"C. However, there were no significantly different among storage temperatures. In cell numbers of 비astocysts，. there were no significantly different among the various storage. te빼erature. in miniature. spenn Jn conclusions, tlús study suggest that the spenn storage temperature effect in vitro. pi양s. fe며lization th뻐. embryo development in miniature pig. Key words : Semen storage temperature, In vitro fertilization, In vitro development, Miniature pig. www.earticle.net I.. 서. 론. 최근 돼지는 인간의 건강을 위한 장기이식의 모델로 충분히 고려되고 있는 동물이다. 그러나 인간에게 도움이 되. 는 잠재성을 지니고 있음에도 불구하고 소에 비해 돼지의 번식기술은 뒤떨어져 있다"(Nie뼈nn. and Rath, 2001). 돼지. 난자의 체외수정은 매우 중요하지만 생물공학에 적용은 초기단계이며 아직 많은 문제점들이 개선되어야 한다. 즉 체외수정 또는 체세포 핵이식에 사용되어지는 많은 수의 돼지들을 출산시키는데 좀 더 많은 수정란들이 필요하지만 이러한 생물공학 기술들은 수정란의 발육을 위해 아직 이용되지 못하고 있다(Be빠lauser. et al., 2:聊1; Kikuclú et 머.，. 1999, 2002; Yin et al., 2002). 한편/ 돼지는 체외수정시 높은 다정자침입이 일어나며(Abeydeera and Day, 1997; Niwa, 1됐;. Wang and Niwa, 1995; Wang et a1., 1997, 1994), 또한 수정란의 질이 좋지 않고 발육능력이 매우 낮다뼈n et 매.， 1999; 뼈C뼈ty et al., 1998). 최근에 돼지수정란의 체외생산 시스템은 개선되었지만 다정자수정의 문제점과 수정란 질적인 문제는 여전히 남아있다(Kikuchi. * Corresponding author : Omon-Keun Park,. et al., 2002;. TI리: 82-끊2밍.f!fJ27 E없;. 뼈C뻐ty. et a1., 1998;. 82-3.>-244-2532,. Yos비0뼈. et. 머.，. E-rr뻐l’ 뻐[email protected]. 2002).

(2) 148. 동물자원연구 제 17권. (2006). 체외수정으로 생산된 돼지 수정란의 낮은 질은 다른 장애요소와 함께 체외생산 기술의 장애요소로 남아있다. 특히 IVF로 생산된 배반포들은 체내수정 배반포에 비해 세포수가 적디β꿇n et 매.， 1999; 뼈chaty et al., 1998). 배반포에서 Iαf 또는 TEcell의 상대적인 숫자는 발생의 착상 전 단계의 수정란의 질을 평가õ}는 기준으로 충분히 고려할만 하다. (Giles and Foote, 1995). 특히 홍미로운 것은 다정자 수정 후 발달된 배반포는 단일 정자 수정란과 비교해 보았을 때 좀 더 적은 ICM cell을 가지며 이것은 Iαf의 성장 방해를 시 사한대Giles and F∞te， l995). 최근 연구에 따르면 체외수정 조건이 돼지 수정란의 질과 발달능력에 영향을 주는지 아닌지가 조사되어졌다. 한편， 발달능력에 관한 연구. 에서는 체외에서 잘 성숙된 난자는 다양한 농도의 정자로 수정되었고/ 신선한 정액을 이용하여 다양한 조건하에서 보존하였다. 그 후 7일 동안 체외에서 배 OJ=한 후 배반포 단계로 평가되어지는 수정난을 실험하였으며 배반포의 구조. 상 좋은 것은 수정란 질을 평가하는 겁 λ까 진행되었다. 따라서 본 연구에서는 양질의 miniature pig의 수정란을. [Provider:earticle] Download by IP 118.70.52.165 at Monday, December 20, 2021 8:17 PM. 확보하기 위한 기초연구로 정액의 채취 후 보존온도가 체외수정 및 발육에 미치는 영향에 대해 검토하;묘자 하였다.. 11.. 재료 및 방법. 1. 난자의 준비 실험에 공시한 난자는 발정주기와 종에 상관없이 도축장에서 도살 직후 암돼지로부터 적출한 난소에서 채 취하였 다. 도살 직후 회수한 난소를 30 - 35 C 의 생리식염수(0.9% Nacl) 가 들어있는 보온병에 담아 3시간 내에 실험실로 0. 운반하였다. 운반된 난소는 생리식염수로 2 - 3회 세척한 후 18G의 주사침이 장착된 2α피 주사기를 이용하여 직경. 2-6mrn의 난포에서 난포액을 모아 침전 후 TIrHepes로 3회 세척하여 Peσi dish내에서 실체현미경 하에서 난세포 질이 균질하고 난구세포가 균일한 난자를 선별하여 피렛을 이용해 회수하였다.. 2.. 정자의 준비 미나돼지 정액은 강원대학교 목장 내에서 사육중인 미니돼 지 2두에서 채취하여 각각 4 C, lTC 및 3TC 에서 24시 0. 간 보존하였다. 24시간 보존된 정 액은 1500 φm으로 5분간 1 회 원심분리 후 sperm washing mediurn(Table 1) 에 혼합하여 3회 더 원심 분리하여 was비ng하였다.. www.earticle.net. (A) Fig.. 1.. (B). Prepara히on. of miniature pigs sperm (A) semen storaged at 4 C, (B) semen storaged at 1TC and (디 semen storaged at 3TC have a sink s야rm. 0. (C).

(3) Effect of 앉~ storage temperature on in vitro fertilization 뻐d dev리opment in miniature pig. 149. Table 1. Composition of sperm washing medium DPBS(-). 20ml. BSA (sigma 8022). 0.1%. O.02g. Penici파1. 1oo11g/ml. O.α12g. Streptomycin. 7511g/ml. 0.0015g. filtrate (0.45. tun 퍼t앉). & Keep at refrigerator (39 "C) p H7.2-7.3. [Provider:earticle] Download by IP 118.70.52.165 at Monday, December 20, 2021 8:17 PM. 3. 난자의 체외성숙 난자의 체외성숙은 기본 배양액인 NCSU-23을 이용하였으며， Table 2에 나타내었다. 와 Hypotaurin O.oo546g cysteine solution 1m! PMSG 100111 및 HCG10μm를 첨가한. 를 넣어 Z시간(5%. C02,. NCSU-23. IVMI. 배양액에. PFF 1m!. 용액에 100여개의 난자. 39 C 의 조건) 동안 배양시킨 후 NCSU-23에서 호르몬을 제거한 후 IVM I1용액에서 재차 0. 22시간 (5% α)2.， 39 C 의 조건) 통일한 방법으로 성숙배양 하였다. 0. 4. 체외수정 미니돼지 정액을 수정하기 전날 받아와서. 4 C, 1TC 0. 및 37 "C 에 각각 보존한 후 수정당일， 왜1 성숙시킨 난자와. 체외 수정하였다. 수정 후i IVF drop에서 2좌1동안 보관한 후 2엠1 후에 IVC drop으로 옮겨주었다. 이틀간격으로 drop 을 1:l}꿔주면서 이툴째에 분화율 검사를 실시하였다.. 5. 난자의 관찰 체외수정 후 난자를 was비ng하여 투명대에 붙은 정자를 제거뼈 체외배양 하였고. IVF 24시칸 후 수정란을 O뾰in. 염색하여 핵형을 관찰하였고.， IVF 7일 후 배반포의 형태를 띈 수정 란을 hoechst 염색하여 uv현미경 하에서 발광하 는 핵의 숫자를 관찰하여 세포수를 조사하였다.. 6.. 실험설계. www.earticle.net. 실험 1: 4, 17및 3TC 에서 보존 된 정액을 이용하여 체외수정 후 정자침입에 미치는 영향을 검토하기 위하여 난자와. 정자를 체외 수정하여 24시간 후 슬라이드글라스에 고정하여 orcein 염색을 하여 핵형을 관찰하였다. 실험. 2 신선정액의 보폰온도 4, 17 및 3TC 가 체외수정란의 분할율에 미치는 영향을 검토하기 위하여 난자와 정자 를 체외 수정하여 48시간 후 실체현미경을 이용하여 분할율을 관찰하였다.. 실험 3: 신선정액을 4, 17 및 3TC 에서 보존한 경우 체외수정란의 발육율에 미치는 영향을 검토하기 위하여 난자와 정자를 체외 수정하여 7일 간 배양 후 형광염색 m잃양2) 하여 발육율을 관찰하였다. 실험 4: 신선정액을 보존옹도 4, 17 및 37 "C 에서 보존한 경우 배반포로 발육한 수정란의 세포 수에 미치는 영향을. 검토해1 위해 난자와 정자를 체외 수정하여 7일 간 배양 후 배반포의 형태로 발육한 체외수정란의 세포수 를 형광염색 m잃342) 를 이용하여 관찰하였다.. 川 .통계처리.

(4) 150. 동물자원연구 제 17권. (2006). 실험의 결과는 다mcan의 다중검정에 의해 유의성을 검정하였다.. IV.. 결. 과. 실험 1: 미니돼지 정액의 보존온도가 체외수정에 미치는 영향. Table 2에서 나타낸 바와 같이 정액은 4, 17 및 3TC 에 보존 후 체외수정한 결과 전핵형성 비율은 4 't 및 37 't에 비해 1TC 에서 유의적으로 높았다-(P<O.05).. 이것은 4 C 및 3TC 에 비해 전핵형성 시기가 1TC 가 가장 빨리 진행되었다는 것을 확인 할 수 있었다. 전체 수정율에 0. 0. 서는 76.5%로 4 C 에 보존된 정액이 가장 높게 나타남을 알 수 있었고7 다정자 수정의 경우 3TC 에서 보폰된 정액이. [Provider:earticle] Download by IP 118.70.52.165 at Monday, December 20, 2021 8:17 PM. 4 't에 비해 유의적으로 낮게 나타났다(P<O.06).. 실험 2: 미니돼지 정액의 보존온도가 체외수정란의 분활율에 미치는 영향. 체외수정 후 48시간 후에 판찰한 분할윷은 4 't, lTC 및 37''C에서 유의적 차이가 없었다. 수정 후 24시간 후 전핵형 성의 속도는 차이가 있었던 반면에 분할 시기는 차이가 없으며 분활율 역시 차이가 없다는 것을 확인할 수 있었다. (fable 3). 실험 3: 미니돼지 보존온도가 체외수정란의 발육율에 미치는 영향. 체외수정하여 7일 후 발육을 관찰한 결과 유의적인 차이는 없었지만 4-16 cell과 배반포의 비율이 1TC 에서 높게 나타났대Table 4).. Table 2. 타fect. of semen storage temperature on in vitro fertilization oocytes using miniature pigs semen No.of. Pronuclear. Exp없lSion. oocytes. fonnation. sperm head. examined. (%). (%). Tem야rature. CC). Polyspermy. Total (%). (%). 4. 153. 42(27.4)" 44(28.9)" www.earticle.net. 31(20.2)". 11끼76.5)". 17. 167. 6O (36.1)b. 36(21.6)b. 29(16.9)ab. 125(74.9)"b. 37. 162. 47(26.이a. 46(28.6)". 18(10.6)b. l11(68.5)b. a ,b Values with different supE뾰α'ipts in the same column differ (p<O.05). T'a ble 3. Effect of semen storage temperatures on cleavage rates in miniature pigs Temperature. CC) 17 37. %a. mμ 쟁. 4. No. of oocytes examined. Oeavage(%). 147. (61.끼. 160 (61.1) 155 (60.1).

(5) Effect of 앉:men storage t，없-.perature on in vitro fertilization 뻐d developrnent in miniature pig. 151. 실험 4: 미니돼지 정액의 보존온도가 체외에서 발육한 수정란의 세포수에 미치는 영향. 체외 수정하여 7일 후 배반포의 형태로 발육한 체외수정란의 세포수를 형광염색뼈3짚)를 이용하여 관찰한 결과 1TC 에서 보존된 정액을 이용한 체외 수정된 배반포에서 18.27ß 로 4 C， 37''C에 보폰된 정액을 이용한 배반포에 비해 0. 높게 나타났지만 유의적인 차이를 보이지 않았다(I'able S).. Table 4. Effect of semen storage temperatures on in vitro development of oocytes plgs No.of. Temperature. [Provider:earticle] Download by IP 118.70.52.165 at Monday, December 20, 2021 8:17 PM. ("C). fe야ilized. in vitro núniature. No.(%)of oocyte developed. ∞cytes. examined. 4-16떠1. 2 ce11 (%). (%). Blastocyst (%). 4. 264. 55. (20.에. 86 (32.5). 6. (2끽. 17. 2%. S3. (17.키. 116 (39.1). 10. (3.긴. 37. 305. 60 (19.6). 104 (31.1). 6. (1.키. Table 5. Effect of semen storage temperatures on cell number of blastocyst developed in vitro miniature pigs Temperature ("C). 4 17 37. v.. 고. No. of. em벼r∞ ex뻐1ined. 6. m 6. Ce11 number / blastocyst. 16.7. 18.2 16.3. 찰. 현재 인간의 공여 장기 부족으로 이종장기이식/ 특히 미니돼지 이종이식(Xenotransplantation) 에 대한관심이 높아. www.earticle.net. 지고 있다. 뿐만 아니라 미니돼지는 복제수정란 생산기술의 효율성 향상 및 무균돼지 작출 기술 개발을 위한 연구가 차세대 성장 통력산업으로 이뤄지고 있다. 이는 줄기세포의 연구를 통한 난치병 및 질병치료와 무균돼지 생산으로. 바이오 장기를 생산하여 이종 간의 장기 이식을 가능케 할 것으로 기대된다. 하지만 미니돼지에서 미성숙 난포를 이용한 체외성숙과 체외수정의 연구는 다른 동물에 비해 늦게 이 루어졌으며l 돼지 난자의 성숙과정이 타 동물에 비 하여 길고 체외수정 시 다정자 침입 율이 높으며 웅성 전핵 형성 율이 낮다는 문제점을 가지고 있다어빼 둥 1991; Sch∞nbeck 둥， 1992). 최근 연구에 따르면 체외수정 조건이 돼지 수정난의 질과 발달능력에 영향을 주는지 아닌지 가 조사되어졌다. 체외에서 다양한 농도의 정자로 수정되었고/ 신선한 정액을 이용하여 다양한 인큐베이션에 보존하 였다. 체외수정이 이루어지기 위해서는 난자와 정자의 체외배양이 뒷받침 되어야 한다. 본 연구는 미니돼지의 정액을. 채취하여 보존온도를 달리하여 체외수정에 이용하여 체외수정 및 발육에 미치는 영향을 검토하그l자 하였다. 체외수. 정 24시간 후 전핵의 형성과 다정자 수정 율을 관찰하였고1 체외수정 후 7일 동안 체외에서 배양한 후 발육 율을 조사하였고 배반포 단계로 평가되어지는 수정란을 수거하여 배반포 형태까지 발달한 수정란은 수정난의 질을 평가 하기 위해 세포수를 조사하였다.. 현재의 연구에서 전핵형성은 정액의 보존온도가. 1TC, 3TC, 4 C 의 0. 순서로 높게.

(6) 152. 동물자원연구 제 17권 (2006). 나타났다. 이와 같은 결괴는 정액의 보존온도가 17 'C 일 때 가장 빠른 발육을 보이며y 다정자 수정의 경우 3TC 에서 보폰된 경우. 4'C ,. 1TC 에 비해 낮게 나타난 것은 4 C， lTC 에 비해 3TC 에 보존된 정액의 활력이 떨어짐을 시사한 0. 다. 그러나 분할율은 정액의 보존온도에 의한 3가지 실험 구에서 유의적인 차이를 보이지 않았다. 또한 1TC 에서 보 존된 정액을 이용해 수정한 난자에서 4-16cell과 배반포의 비율이 높게 나타났지만 유의적인 차이는 없었으며 배반 포의 æll수에서도 조사한 결과 유의적 차이를 보이지 않았다. 이와 같은 결과는 미니돼지의 경우 채취한 정액을 이용. 하여 체외수정 시 1TC 에서 보존하는 경우 전핵형성에서， 3TC 에서 보폰하는 경우 다정자 침입의 억제에 효과가 나 타난 것으로 평가할 수 있지만， 그 후의 수정란의 체외발육에는 영향을 미치지 않은 것으로 사료된다.. VI. 요. 약. 본 연구는 미니돼지로부터 채취한 정액을 각각 4 'C, lTC 및 3TC 에 보존하였을 때에 체외수정 및 발육에 미치는 [Provider:earticle] Download by IP 118.70.52.165 at Monday, December 20, 2021 8:17 PM. 영향을 검토하그l자 수행되었다.. 첫 번째 실험에서 미니돼지 정액의 보존온도가 체외수정에 미치는 영향에 대해 검토한 결과 전핵형성비율은. 4'C. 및 3TC 에 비해 1TC 에서 유의적으로 높았대P<O.05) . 두 번째 실험에서 미니돼지 정액의 보존온도가 체외수정란의 분할율에 미치는 영향에 대해 검토하였다. 그 결과 체외수정 후 48시칸 후의 분할율은 4 C, lTC 및 37 'C에서 유의적 0. 차이가 인정되지 않았다. 세 번째 실험에서는 미니돼지 보존온도가 체외수정란의 발육율에 미치는 영향에 대해서 검토하였다. 그 결과 17 'C에서 4-16 cell 및 배반포 형성율이 가장 높았지만 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 네 번째 실험에서는 미니돼지 정액의 보폰온도가 체외에서 발육한 수정란의 세포수에 미치는 영향에 대해서 검토하였. 다.1TC 에서 보폰된 정액을 이용한 경우 배반포에서 세포수가 18.27R 로. 4'C. 및 3TC 에 보존된 정액을 이용한 배반포. 에 비해 높게 나타났지만 유의적인 차이를 보이지 않았다. 본 연구의 결과로부터 미니돼지로부터 채취한 정액의 보존온도는 체외수정에는 영향을 미치지만 그 후의 초기 배 발육에는 영향을 미치지 않는 것으로 사료되었다.. 감사의글 본 연구는 농림부 바이오장기 생산 연구사업의 연구비 지원을 받아 수행되었습니다. 본 연구의 수행 시 동물자원 공동연구소의 정액보존시설의 지원에 감사드립니다.. www.earticle.net VII. 참고문헌 1. Abeydeera,. L.R., Day, B.N.,. 1997.. Fer버ization 뻐d. subsequent development in vitro of pig oocyt않. inseminated in a modified tris-buffered medium with frozen-thawed. 57,. 머a때ated. spermatozoa. Biol. Reprod.. 729-경4.. 2. Abeydeera, L.R.,. W.없1용. W.H, Cantley, T.C, Rieke, A., Prather, R. S., Day, B.N., 1998.. pres밍lce. of. epid앉mal. growfu factor during in vitro maturation of pig oocytes and embryo culture can modulate. bl잃t따1St. development. 하ter. in vitro fertilization Mol. Reprod. Dev. 51, 395 - 때1.. 3. Funahashi, H , Day, B.N., 1993. Effects of the duration of 마toplasmic. maturation of pig oocytes in vitro.. J.. eψos따e. to hormone supplements on. Reprod. Fer삐. 98, 179 - 185.. 4. Giles, J. R., Foote, R. H , 1995. Rabbit blastocyst: allocation of cells to the inner cell mass and trophectodenn Mol. Reprod.. [농v.. 41, 204 - 211..

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