수핵란의 활성화 시간과 성숙이 소 핵이식란의 체외발육에 미치는 영향

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수핵란의 활성화 시간과 성숙이 소 핵이식란의 체외발육에 미치는 영향

남희선 · 이준흐1. 정희태 박춘근** 김정익 강원대학교축산학과

강원대학교 수의학과*’ 강원대학교 부속목장**

Effects of Recipient Cell Activation Time and Aging on in Vitro Development of Nuclear Transfer Bovine Embryos

H. S. Nam , J. H. Lee , H. T. Cheong* , C. K. Park** , C. I. Kim

Department of Animal Science

Department of Veterinary Medicine* , Animal Farm **

Kangwon National Univerisity

ABSTRACT

Nam H. S.,

H. Lee, H. T. Cheong,

K. Park,

Kim. 1997. Effects of recipient cell activation time and aging on in vitro development of nu cI ear transfer bovine embryos. An

Anim. Resources S

8

12-21

The present study was conducted to examine the effect of recipient ce l1 activation time and aging on in vitro development of nu c1 ear transfer bovine embryos. A blastomere derived from the 16-32-cell stage bovine embryo was transferred into an enucleated metaphase II (M ll) oocyte matured for 22-24hr before or after activation. A donor blastomere was also transferred into an enucleated and aged oocyte for 40h

Some enu cI eated and aged oocytes were activated at 32hr of maturation. Developmental rate to the morula stage was relatively higher (1 3.8%) when a donor blastomere was transferred into an aged cytoplast compare with control(3.2%).

Activation prior to nu c1 ear transfer in aged cytoplast did not enhance the development of nu c1 ear transfer embryos. Activation treatment time did not affect the developmem of nu cI ear transfer embryos when enu cI eated young oocytes were used as recipient cytoplasts. The result of this study suggests that the aging, but not activation, of recipient ooplasts prior to nu cI ear transfer can enhance the development of nu cI ear transfer bovine embryos.

Key words : nuclear tran야η oocyte aging , activation treatment time , bovine

?

‘ ----•

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수핵란의 활성화 시간과 성숙이 소 핵이식란의 체외발육에 미치는 영향

1 . 서 론

최근 영국의 유전공학자들이 세계 최초로 완 전히 자란 포유동물을 복제 (cloning) 하는 데 성공하므로써 (Wilmut 등， 1997) 생명공학에 대한 관심이 커지고 있다. 포유동물의 복제에 관한 연구는 McGrath 와 Solter( 1993) 가 생 쥐의 핵이식기술의 개발에 성공한 이래， 생쥐 (McGrath 와 Solter , 1986: Howlett 등， 1987:

Cheong 등， 1994) 빛 토끼 (Stice 와 Robl , 1988: Collas 와 Robl , 1990: Collas 등，

1992a ，b) 뿐 아니라， 면양 (Willadsen， 1986:

Smith 와 Wilmut , 1989: Wilmut 등， 1997) , 돼 지 (Prather 등， 1989) 빛 소(Prather 등， 1987:

Bondilli 등， 1990: Barnes 등， 1993b: Pinto- Correia 등， 1995) 등의 가축에서도 활발한 연 구가 이루어져 왔다.

핵이식 기술은 발육도중에 있는 배 유래의 핵을 미수정란의 탈핵 셰포절에 이식하여 개 체를 생산해 내는 기술로서， 이 과정 중에 수 핵란으로 사용되는 미수정란 셰포질의 활성화 가 필수적이다. 세포융합시 부여되는 전기자 극은 셰포융합 뿐 아니라， 세포질의 활성화도 동시에 유기할 수 있다. 그러나 셰포질의 활 성화 빈도는 미수정란의 성숙후 경과시간 또 는 배란 후 경과시간에 따라 차이가 있어서，

어린 난자의 경우 전기융합시 부여되는 자극 으로는 셰포질의 활성화가 이루어지지 않지 만， 배란 또는 성숙후 시간이 경과함에 따라 활성화율이 증가한다( Collas 와 Robl , 1990).

소 핵이식시 난세포질의 활성화처리 방법으로 최근에 주목되고 있는 것이 기존의 전기 또는 알코올 등에 의 한 활성 화 처 리 와 cycloheximide 처리를 병행하는 방법이다( First 등， 1992:

Presicce 와 Yang , 1993: Aoyagi 등， 1994). 이 방

법은 성숙배양 후 20~24시간째에 핵이식을 실 시하고， 전기융합 후 계속하여 cycloheximide( 10 뼈/ml) 로 6시간 정도 배양하는 방법으로 90%

이상의 활성화율을 얻을 수 있다.

핵이식의 효율성에 영향을 주는 요인들은 위 에 언급한 기술과정의 효율성 외에 핵과 세포 질의 상호작용 등의 생물학적 요인들도 중요 한 요인이 된다. 대표적인 것으로 핵과 세포 절간의 셰포주기 동기화를 들 수 있다. 수정 란의 분할구 핵을 탈핵 미수정란 세포질에 이 식할 경우， 이식된 핵은 다양하고 복잡한 변 화과정을 거친다( Collas 등， 1992a , b: Cheong

등， 1994). 이러한 변화는 핵의 세포주기 단계

에 영 향( Collas 등， 1992a , b: Cheong 등， 1993) 을 받아， G171 의 핵을 이식할 경우 발육능이 현저하게 증가한다고 보고되었다(Cheong 등，

1993). 반면에 후기 S기의 핵을 이식할 경우에

는 발육능이 극히 저하된다고 보고( Collas 등，

1992a: Cheong 등， 1993) 하여 , 셰 포주기 동기 화 이식의 중요성이 인식되었다. 그러나 동물 에 따라서는 G171 가 아주 짧거나 결여되어 있는 경우도 있기 때문에 핵을 G171 에 동조 시키는 일은 쉬운 일이 아니다. 소 수정란의 경우는 2 세포기 이후에는 G171 가 거의 없는 것으로 보고 (Barnes 와 Eyestone , 1990) 되 어 있는 반면， 체내에서 회수된 25~48 세포기 수 정란의 약 90%정도가 DNA 합성기언 S기에 머물러 있음이 밟혀졌다 (Barnes 등， 1993a).

이러한 결과를 토대로 소 핵이식에 있어서의 셰포주기 동기화는 핵의 셰포주기를 G171 에 동조시키는 방법 대신， 역으로 핵이식전에 미 수정란 세포질의 활성화를 유기하여 S기에 동 조시킨 후， 공핵란의 분할구 핵을 이식하는 방법 이 연구되고 있다 (Barnes 등， 1993b:

Kono 등， 1994; Aoyagi 등， 1994: Takano 등，

1996). Aoyagi 등(1994) 은 소 난포란의 성 숙

끼 j 1 , _i

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후 2시간째에 미수정란의 탈핵을 실시하고， 즉 시 Ca2 + -ionophore , 전기 자극 및 cyclohe피mide 로 활성화처리하여 셰포질의 셰포주기단계를 S기에 동조시킨 후， 공핵란의 분할구핵을 이식 하는 방법으로 핵이식 배반포를 얻었다고 하였 다.

본 연구는 핵과 셰포질간의 복잡한 상호작용 이 핵이식배의 발육에 영향을 미칠 것으로 판 단하여， 수핵란 셰포질의 활성화 시간과 성숙 이 소 핵이식배의 체외발육에 미치는 영향을 검토하기 위하여 실시하였다.

n . ^{채료 및 방법}

1. 난자 및 수정란의 준비

도축장에서 회수한 난소로부터 난포액을 흡 입하는 방법으로 미성숙난자를 채취한 후， 실 체 현미경하에서 난자 주위의 난구세포가 균 일하고 셰포질이 균질한 것 만을 션별하였다.

난포란의 체외성숙은 TCM-199배양액에 10%

FBS(fetal bovine serum , Gibco , NY , USA) 과

FSH(Sigma , St. Louis , MO , USA) 0.02IU/ml 및 17

-estradiol(Sigma) 때/쩌 이 함유된 배

양액 50씨의 소적중 10여개씩의 난포란을 넣 고 mineral oil로 피 복하여 5% C02 , 95% 공기 및 39

C 의 온도조건하에 22-24시 간 배 양하였 다.

성 숙된 난포란은 5mM caffeine , 10 맹 /ml heparin , 3mg/

BSA와 2.5 x10

정 자/ml 가 함유 된 BO 액 (Brackett 와 Oliphant , 1975) 50 때의 소적중 10여씩 옮겨 넣고 5% C02 , 95% 공기 및 39

C 의 온도조건하에서 12-20시간 체외수 정 하였다. 수정후 난자는 체외배양액 (TCM-

199 + 3mg/

BSA) 으로 세척하고 난구셰포가 붙어있는 채로 체외배양액 내에서 4-5 일간 난구세포더미와 공동배양하여 16-32 세포기 로 발육된 수정란을 공핵란으로 공시하였다.

한편， 수핵란은 22-24시간 체외성숙된 난포란 을 15

U/ml 의 hyaluronidase를 함유한 1ml 의 체외배양액이 틀어있는 원섬관에 옮겨， vortex mixer로 3분간 처리하여 난구세포를 제거한 후， 셰포질의 색조가 균일하고 제 1극체가 확 인된 난자만을 공시하였다.

2. 미수정란의 탈핵

미 수정 란의 탈핵 은 5 때 /

cytochalasin

B(CB) 와 20% FBS가 함유된 mPBS (modified phosphate buffered saline) 액 내 에 서 Prather 등

(1987) 빛 검 등(1993) 의 방법에 준하여 염색 체를 제거하는 방법으로 실시하였다. 미수정란 의 염색체 제거는 injection pipette를 이용하여 제 1극체와 주변의 세포질을 약 1/3정도 흡입 제거하고 (Fig. 1a) , 나머지 난셰포질 부분을 1 때/ml 농도의 hoechst. 33342로 20분간 처 리 하 여 형광현미경 하에서 염색체의 유무를 확인 하고， 탈핵이 확인된 난자만을 수핵란 세포질 로 사용하였다.

3. 핵이식

Donor용 수정란은 0.5% pronase용액으로 2- 3분간 처리하여 투명대를 제거하고， Ca

및 Mg

+ 이 포함되 지 않은 PBS 액 내 에 서 pipetting 에 의하여 분할구를 분리하였다.

Donor배의 단일할구는 injection pipette내로 홉 인하여 탈핵을 실시한 구멍을 통하여 탈핵란 셰포질의 위란강내로 주압하였다(Fig. 1b , c).

핵이식란은

BSA를 함유한 TCM-199액

”

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수핵란의 활성화 시간과 성숙이 소 핵이식란의 체외발육에 미치는 영향

중에서 전기융합 전까지 30분간 배양하였다.

4. 전기융합 및 활성화

핵이식란의 전기융합은 BTX-200 세포융합장 치 (BTX， San Diego , CA , USA) 및 O.5mm폭의 때re chamber를 사용하여 Cheong 등(1993) 및 검 등(1994) 의 방법에 준하여 실시하였다. 핵이 식 란은 O.1 mM MgS04 , 0.05mM CaClz 및 0.05mg /ml BSA가 첨 가된 0.3M mannitol 용액 을 넣은 wire chamber의 양전극 사이로 옮겨， 1MHz , 6V/mm의 교류(AC) 전류를 6초간 통전하여 분 할구와 세포질의 접촉면이 양전극에 수평이 되 도록 유도하고， 이어서 1. 0 kV /cm의 직류(DC) 전류를 70뿜ec 간 2회 통전하여 셰포융합을 유 도하였 다. 통전 후 핵 이 식 란은 즉시 3mg/ml

BSA가 첨가된 TCM-199액내에서 수회 세척후 체외배양용 배지내에서 융합여부를 관찰하였다.

미수정란 셰포질의 활성화처리는 10μM의 Ca

+- ionophore(A23187; Sigma) 로 5분간 처려한 후 곧바로 10μg/ml 농도의 cyclohe회mide(CHXM，

Si웰la) 와 3mg/ml BSA가 첨 가된 TCM-l99용액 의 소적 (50띠)내로 옮겨 6시간 동안 배양하였 다.

5. 핵이식배의 체외배양

핵이식배는 3mg/ml BSA가 첨가된 TCM-199 액의 50 씨 소적내에서 5% C02 , 95% 공기 빛 39

C 의 온도조건하에서 배양하다가 4 셰포기

이상부터는 CR1aa + 10% FBS의 소적내로 옮 겨 Buffalo rat liver cells(BRLC: American Type Culture Collection , Rockuille , MD , USA) 과 공동배양하며， 분할율 및 발육율을 검사하 였다. 배양액은 매 2~3 얼마다 신선한 배양액 으로 1/2씩 교환하였다.

Fig.

Nuclear transfer procedures.

a) Enuclea tíon of ma ture oocyt~s.

b) A blastomere from a 16~32-cell stage embryo was aspirated into the injection pipette.

c) A donor blastomere was inserted into the perivitelline space of an enuclea ted oocyte.

6. 실험설계

1 ) 수핵란 성숙(aging) 으| 영향 검토

수핵란에 있어서 성숙 (aging) 이 핵이식배의 발육에 미치는 영향을 검토하기 위하여， 16~

ζ 、, ) 1 l ’ l

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32 세포기배 유래의 분할구를 체외 성숙 22~

24시간째에 탈핵란 세포질에 이식， 융함한 후 활성화 시킨 대조구와， 성숙배양후 22~24시간 에 탈핵을 실시하고， 40시간까지 셰포질을 과 성숙시킨후 핵이식 빛 전기융합을 실시한 aging구로 나누어 체외발육능을 검토하였다.

Aging의 경우는 핵이식 후 전기자극에 의해 세포융합과 셰포질 활성화를 유기하였다.

2) 성숙시 수핵란의 활성화처리 영향 검토 성숙 (aging) 시 수핵란의 활성화 처리가 핵이 식배의 발육에 미치는 영향을 검토하기 위하 여， 성숙배양후 22~24시간에 탈핵을 실시하고，

일부는 40시간까지 셰포질을 과성숙한 후 핵이 식 빛 융합을 하였고， 일부는 세포질을 과성숙 하는 도중， 32시간째에 수핵란에 활성화처리를 실시한 후 핵이식 및 전기융함을 실시하였다.

3) 활성화 시간의 영향

성숙직후의 어린난자를 수핵란으로 이용할 경우， 활성화시간이 핵이식배의 체외 발육능에 미치는 영향을 검토하기 위하여， 성숙배양 22

Table 1. Efficiencies of manipulation procedures

Parameters

Trea ted eggs Eucleated eggs

(confirmed with hoechst

33342)

2. 수핵란에 있어서 성숙(aging) 으| 영향 수핵란에 있어서 성숙의 영향을 검토한 결

~24시간째에 미수정란으로부터 핵을 제거하 고， 일부는 즉시 16~32세포기배 유래의 분할 구를 난세포질에 이식한 후 활성화(post

구) 시켰고， 일부는 탈핵 후 핵이식전에 활성 화(pre AC구)를 유기하였다.

7. 통계처리

실험 결과는

test에 의 하여 유의 성 을 검정하였다.

II[. 결과 및 고찰

1. 핵이식과정의 효율성

핵이식과정 중 탈핵 빛 핵이식의 효율성을

Table

1 에 나타내었다. 342개의 탈핵조작된 난

자 중에서

33342 염색에 의해 탈핵이 확인된 난자가 272개로 79.5%가 성공적으로 탈핵되었고， 이중 2177R 가 핵이식되어 핵이식 성공율은 79.8% 였다.

No.

(%)

342 272(79.5) 217(79.8)

과， 분할율은 aging한 경우가 82.8%로 대조 구의 53.1% 에 비하여 높았으며， 상설배 빛 배반포 (Fig. 2) 로의 발육율도 13.8 % ( 4/29 )로，

- 16 -

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3.2% (1 /32) 언 대 조구에 비 하여 aging한 경 우 가 비교적 높았다 (Table 2).

이는 aging 된 난셰포질은 어린 난세포질 의 경우에 보이는 성숙촉진인자 (MPF:

ma tura tion promoting factor) 에 의 한 염 색 체 응축 (PC C: perma ture chromosome condensation) 현 상 이 억 제 되 어 donor 핵 의 세포주기 stage 에 의한 영향이 감소된 때 문인 것으로 판단된다( Cheong 등， 1993:

Collas 와 Robl , 1990).

Fig.

Two blastocyst stage embryos derived from nuclear transfer.

Table 2. Effect of recipient cell aging on in vitro development of nuclear transfer bovine embryos

Treatment

N o. (%) of embryos developed to No. (%) of eggs

fused/ manipula ted 2-cell 4-cell 8-cell M + B*

Control** 32/46( 69.6) 1(3.2)

Aging*** 29/ 42( 69.0)

17(53.1) 14( 43.8) 6 (1 8.8)

24(82.8) 15(5 1.7) 5( 17.2) 4 (1 3.8)

* M + B: Morulae + Blastocysts.

** Nuclear transfer eggs were activated with a combination of A23187 and CHXM after fusion.

*** Enucleated eggs were cultured for 15-16hr before nuclear transfer.

3. 성숙(aging)AI 수핵란의 활성화처리 의 영향

성숙시 수핵란의 활성화처리 유무가 핵이식 배의 발육에 미치는 영향을 검토한 결과， 분할 율은 핵이식전 활성화 유무에 영향을 받지 않 았다. 한편， 상실배기 이상의 발육율은 핵이식 전에 활성화하지 않는 경우가 13.3% 였고， 활성 화처리한 경우는 6.1%였다 (Table 3).

이와 같은 결과는 활성화 후 9시간에 핵이식 및 융합을 실시하여 24%의 배반포 발육율을

얻었다는 Kono 등(1994) 의 보고와는 다른 경 향을 보였다. 핵이식전에 활성화처리를 하여 주므로서 세포질의 세포주기 단계를 S기로 동 조시키는 효과를 얻을 수 있으나(Barnes 등，

1993a) , 소에서는 셰포질의 S기 동조가 세포주

기가 불명확한 donor세포를 이식할경우에 핵 이식배의 발육율을 증진시킬 수 있다고 한 반 면 (Barnes 등， 1993a: Aoyagi 등， 1994) , 생 쥐 에 서는 염색체 이상을 초래할 수 있는 것으로 보고되고 었다 (Cheong 등， 1994).

「l

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Table 3. Effect of preactivation in aged oocytes on in vitro development of nuclear transfer bovine embryos

Treatment

Aging w 1

preA C Aging wl preAC**

No. (%) of eggs fused/ manipula ted

30/39(76.9)

33/41

(80.5)

* M + B: Morulae + Blastocysts.

N o. (%) of embryos developed to 2-cell 4-cell 8-cell M + B*

19( 63.3) 16(53.3) 4(13.3) 4(13.3) 2 1( 63.6) 14( 42.4) 12(36.4) 2(6. 1)

** Enucleated eggs were activated at 32hr of IVM and aged before nuclear transfer

4. 활성화 시간의 영향

성숙직후의 어린 난자를 수핵란으로 이용할 경우， 활성화 시간이 체외발육에 미치는 영향 을 검토한 결과， 분할율은 활성화 시간에 영향 을 받지 않았다. 또한， 핵이식전 활성화처리를 실시한 경우의 상실배기 이상 발육율은 4.7%

였고， 핵이식후 활성화 처리한 경우는 0%로 나타났으나 유의적인 차이는 없었다(1빼le 4).

미수정란 세포질의 핵이식전 활성화처리는 세포질의 세포주기를 Mll 기에서 간기로 이행 시키게 되며， 활성화 후 경과시간에 따라 대략

적인 세포주기단계를 추정할 수있다. 소 1 세 포기 수정란의 경우는 수정 후 6시간까지 G1 기이며， 8기는 G1기 종료 후 약 8시간 동안으 로 추정하고 있다(Bames 와 Eyestone , 1990).

따라서 본 실험에서 난세포질의 셰포주기단 계는 최초 활성화처리 후 약 6시간 이후부터 대략적인 S기로 추정할 수 있다. 본 실험의 결 과， donor핵 의 세 포주기 단계 를 동조하지 않은 상태에서 S기 핵이식의 경우에 상실배기 이상 의 발육이 얻어쳤으나， 8기 동조 핵이식의 비 교우위를 판단할 수 없었다. Aoyagi 등(1994) 및 Barnes 등(1993a) 은 S기 동조 핵 이 식 에 의

Table 4. Effect of activation time on in vitro development of nuclear transfer bovine embryos

Treatment

Post AC**

Pre AC***

No. (%) of eggs fused/ manipula ted

23/55(60.0)

43/54 (

79.6)

* M + B: Morulae + Blastocysts.

N o. (%) of embryos developed to 2-cell

18(54.5) 22(5

2)

4-cell 16( 48.5) 14(43.8)

8-cell 5(15.2)

(16.3)

M + B*

2(4.7)

** Enucleated oocytes fused with a donor blastomere followed by activation treatment.

*** Enucleated oocytes were activated with a combination of A23187 and CHXM before nuclear transfer.

- 18

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수핵란의 활성화 시간과 성숙이 소 핵이식란의 체외발육에 미치는 영향

하여 핵이식배의 발육능이 향상되었다고 보고 하였다. 공핵란의 세포주기단계가 대부분 S기 에 동조된 것으로 가정하고， 수핵란 세포질의 세포주기단계를 S기에 동조시켜 핵이식한 경 우， 이식된 핵은 PCC 현상을 보이지 않고 세포 질과 세포주기단계가 동조되기 때문에 정상적 인 염색체구성을 가지고 정상적으로 발육을 할 수 있는 것으로 판단된다.

N. 적 요

본 연구는 수핵란의 활성화 시간과 성숙이 소 핵이식란에 미치는 영향을 검토하기 위하 여 실시하였다. 소 16-32 셰포기 수정란 유래 의 분할구를， 체외성숙 개시 후 22-24시간에 탈핵한 미수정란 세포질에 이식한 후 활성화 를 주거나， 또는 탈핵세포질을 40시간까지 과 성숙시킨 후 핵이식을 실시하여 핵이식란의 발육능을 비교하였다. 또한 성숙 (aging) 시 32 시간째에 수핵란에 활성화처리를 주어 성숙시 활성화처리의 영향을 검토하였다. 마지막으로 어린난자를 수핵란으로 이용할 경우， 핵이식 전 · 후에 활성화처리를 실시하여 핵이식란의 발육능을 비교하였다.

셰포질을 과성숙시킨 후 핵이식한 경우， 상 실배기 이상 발육율은 13.8%로 대조구의 3.2%

에 비하여 다소 높았다. 세포질의 과성숙시，

핵이식전 활성화 처리는 핵이식배의 발육율에 영향을 주지 못했다. 성숙직후의 어린난자를 수핵란으로 이용할 경우， 핵이식전 활성화 처 리에 의해 상실배기 이상으로의 발육율 (4.7%) 을 얻을 수 있었으나， 핵이식 후 활성화 처리 구와 차이가 없었다.

이상의 결과는 소 수정란의 핵이식시 핵이식 빛 융합전에 탈핵란 셰포질을 과성숙하므로써 핵이식배의 발육을 증진시킬 수 있으나， 핵이

식전 활성화처리 유무는 핵이식란의 발육에 영향을 미치지 않음을 시사한다.

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