돼지체외수정 시 Methyl-beta-cyclodextrin이 정자 첨체반응과 분할율에 미치는 영향

(1)

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동용자원연구 2α6-12 ρ0091

Annals of Anima l

^{Rcsouπ 、s} Sc

icnces 20: • ¹² ⁽²⁰⁰⁹¹

돼지체외수정 시 뻐thyl-야흡-cyclodextrin이 정자 첨처|븐띔과 분할율에 미치는영향

박 솔 이용숭 정희태1 양부근 박춘근.

강원대학교 동플생명과학대학， 강원대학교 수의과대학j

Ef fect of Methyl-beta-cyc1odextrin on Spenn Aσosome Reaction and 타nbryo

Oeavage after in vitro Fertilization in Pi g

501 Par k, Yong- Se ung Lee, Hee- Tae

O1eon밍

Boo-Ke un Yang and

마∞n-Keun

Park*

con떻

ofA ’

^'Ù1^1tÙ^I야^Sciena양 ^K^Sl1lguxm

^NatìQllal Ulliversity

띠l앵f

af Veterinnry

ι1etlicinι κ'"8'ωIt NatìCJlln시 바liversity’

ABS mA CT

study

inν'estìgated

the effect of

rre야"y-야ta-cyd‘xiexbin (MB<그))

on spenn

acro∞

re reaction

ru、d

eavage after

;', νitro

fertiliza tion in pi

g. 11、e aCTa'iOIT'Ie

reaction test of pig

5야nn were ev에

uated by Brilliant

에ue

(CBB) stain after încubatatîon (3 9 '(: , 5% CQ) in mTBM

Co

ntrol group

w깅IS

f ertilized.

treatment reagent T reatment

grα'p5

“,...

f，‘πilized

‘Ni th caffeine ,

MB(그)

and caffeine with MBCD for 180 and 360

min.

Porcine oocyte-cumulus complexes

‘"I

ere cultured in

T(M

-199 medium

α>ntaining

f。ω。매ar

f1 uid

(p다1M‘d

hon:rona1 supplerrent with FS H,

나L

hCG

ar엄

S::;F for

21-깅

Ius.

n엠 rultuπrl

in the

εune

medium without honnona1 suppl

em3l

t

fcπ

additional 21-22 hrs.

The matw어

were

denuded by 0

.1

% h ya1 uronidase treatment

까>e oocyæs

“ ^rere ^{in vitro}

fertilαed 써th

1 .5 x10"'

/뼈

in four different mTBM !n!dium not

α)Iltain떠(control)

and contair ‘:rl caffeine , MBCD or for 6 hrs. After in vitro fertîlization ,

emÞrγa;

were

traαsferred

into PZM-3

써 th

O .æ% 16A

The

cleavage

이

embryo

‘ι15

ev

a1

uated at 48

ar、d

96 hrs.

RÆ>S띠，，，""‘Ned 야，，" 、이"" th."야nn

‘"'"

in four different mTBM mxii um, the integrity of acrosorre was signific antly

(p이

05) lower treated than other treatrnent groups at

α 3O and31값nin The

cleavage rates of pig

embrγ05

'"'"

y

(p<O-'폐

lower in

α>ntrol 뼈1

other treatment groUp ‘ ^However ^, ’ ^t ^was ^not signiñcantly different groups. In conclusion, the MBCD

tr영 brent

in pig sperm

양lOWed

effect on acrosome reactiOn, but rate of

embty。 ‘낌 s

not affected

Key w

ords: Met삐y-bet:a-cydodextrin， Caff，잉ne，

bl vitro (ertilizatiOn,

Pig.

Acrosorre reaction, Embry O d eavage

I. 서론

포유통뭉 난자의 제외수정온 외래유전자 도입에 의한 형 질전환풍물 생산파 우수한 형질을 가진 개체의 보존 둥과 같은 수정란 이식 기술로 널리 이용되고 았다 돼지 제외수 정은

lri tani

됨1978)에 의해 최초로 제외성숙파 수갱이 실 시되었고 체외에서 난X 흥 성숙시켜 산지흩 얻었다{O>eng.

19851

이후에도 계속해서 연구되고 있으며 돼지 제외수정

옹 다른 포유동흘의 경우보다 난자의 채외성숙배양 잊 채외 수정에 판한 연구가 다소 늦게 시작되었다 돼지에 있어서는 재외생속， 수정에 의한 산지용 생산하는 것이 타 동몽에 비 해 극히 적온 연이다 이는 타 통뭉에 비해 성숙시간이 길며 이로 인해 용완전한 성숙이 유기왼 체외생숙난지흩 수갱하 였올 때 소에 비해 다정자 수정(polys야nny)이 높옹 비올로 나타나고 있다(Y05뼈 풍.，

1 989;

Ma

ttioli

동.，

1 'ffl)

다갱자 수갱이란 수갱 시 년샤의 세포질 내에 2개 이상의 정자가 갱

*Correspo여 ing

au tror:

Choon-Keun PJα'k， T4리

82-

33-25()..8627,

Fax:

82-33-251-m9,

E-mai l: parkc

k@

kangwon.ac.kr

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당fcctof 씨‘hyl-bcta-cyd여cxtrin ∞

spcnn

Acru;o

rrc

R잉ction ar성

Embryo Oeavage aftcr

in

vitro

Fcti

lization in

Pi

g 7

입하는 것(Hunter， 1991)융 얄한다 또한 웅성전핵형성융이 낮3l..， 4-세포기 받단이 갱지되는 셰외딴생능 정지현상

O ^am?1I

^둥^"

^1991;

잃"""beck 둥， 1992)둥이 제외수정란의 이용성용 강소시키고 있다

다정자 칩입을 악기 위해서 난사와 수정될 예 수정 능력 을 획득한 정자수의 조정(Abeydeera 와 Day， l99ηι

Hunter,

1~)， 돼지 난포액(porcine folli띠 ar f1 uid)의 청개Kim 동，

1996;

Fun빼h 동，

1993) ,

소 혈청 얄부민(bovil’e

ærum

난자의 채외성숙옹 기본얘양액인 TCMI99올 샤용하였다 TCM199 에

pFF (10% ) ,

lJ-i

(5

μg(

m1) , FSH (0 .5

μg( m1)，

hCG (10

IU/뼈γ 또F

(0.01

pgfm잉 을 청가한 1VM-1용액에 서 2]-깅시간 β% α:>， 38.51:;)동안 성숙 배양시키고 호르 온용 제외한 TCMI99에

pFF

(10%) 와

EGF (0.01

μg( m')안을

정가한 IV싸2용액에서 2]-22시간

(5%

α:>，

38 .5<:)

동안

동일한 방법으로 성숙 배양시켰다

띠이min， RSA)의 청 7

K ^Abey ^deern ^b

둥'， 199끼 둥의 많은 연

3

정자의 준비 구가 수앵되고 있다 그러나 여전히 돼지의 수정 웅력은 다

른 동풀에 비해 낮게 나타나고 있다 본 실험에 이용된 갱액은 강원도 원주시 영서인공수정샌 정자는 암컷생식기에 틀어가 활성화 되어 경합해야 년소 터에서 총오핀Duroc)의 시완용 3차 희석 갱액 (회석액，

와 수정이 원다 정자는 수갱능력획득 과정에서 원형질약으 M띠 beny lß)올 사용하였다 호부터 앙충되어 청체반용이 일어나기 쉬운 상태호 전환왼

다 최끈 새포악으후부터 。lOlesterol 방충충 혹진하는

Methyl beta

cycl여extrin (MBCD)이 청제반용용 유발힘으 로 얄혀져 있다{Cho; 와

Gye ^, 2001)

νIBCD는 야b 잉uropyrnnoo;e로 구성되어 있으며 써포악을 자극하여 cholesterol을 유출시키는 것으호 보고되었다(Christian 둥/

1 9'1끼 Ki

lsdonk

둥.，

1 9:;5; KJein

둥.，

1995; Neufeld

둥， 1잇>6;

아'"0 동.，

1997;

pike 와 Mì

ller,

1옛~;

Yancey

풍，

1996)

따라서 돼지의 성제안용을 조절얘서 다정자심입을 악고 수갱 능력올 향상시키고자 온 연구에서는 돼지 정자에 MBCD툴 쳐려하여 청채안용에 미치는 영향과 제외수정에 서의 분할용에 "1치는 영향융 판창하였다

I I.

재료 및 g엠

1

난시의 준이

실험에 A~용한 낭자는 강원도 흥천 도축장에서 도살 된 암돼지로부터 적총한 난소에서 채취짜였다 도살 직후 회수 한 난소흉 30-35도의 생리식영쉬:0.9%， NaO)가 툴어있는 보용뱅얘 당아 3시간 내에 실험싣로 운반하였으여 운반원 난소는 생리식영수로 세척한 후 18G의 주사칩이 장착원

10 '"

주사기를 이용하여 직정

2-6

mm의 난포에서 난포액융 모

아 침전 후 상충액올 걸러낸 뒤에 petri dish내에서 실셰현 미경 허}에서 난세포와 난구깨포가 윤일한 난샤를 선영하여 설험에 이용하였마

2

난자의 처|외성숙

4

세외수징 및 세외배앙

채외수정용 배양액으로

mTBM

뼈o

113.1 mM. KO 3 mM. ea02

앙1ρ

7 .5 mM

Giucα;e

11 mM.

pyruηc

acid 5 mM. L ‘ ^ystein ^0.57 ^mM ^Tris ^:!l ^mM Penicilline G :!l mM.

Strept omycine

s띠/ate)에

0.02% RSA (Sigma

A-ó003)을 청 가한 수정소척에

0.1%

hyaluronidase용 이용하여 난구세포 즐 제거한 성숙난λH즐 이op당 157A 씌 객하한 후 정자의 최

종농도

1 .5 ' 1 0'/""

인 갱액옹 주입하여

38 .51;, 5%

CD，에서

6시간 동안 수갱하였다 수정원 난자는 셰척용 흥하여 난자 주위에 용어있는 정자와 난구세포들융 깨끗이 제거한 후 PZNι3(NaO

100 mM. KO 10 .00 mM. KH,PO, 0.35 mM.

M양Q 가-1:.0， NaH~

25.07 mM G1utlmine 1 mM

Ca~te)，.5H써

2

π1M.，

Hypotaurine 5 mM Cen tamicin

s비fate

0.05 mg!

ml

, MEM.

뻐되에

o.æ%

I5A를 청가한 채의배양 소적으로 옮겨

38 .5 t , 5% coz

^{3:..경애셔}^애양^관

창하였다

5

실험실계

1)

실험

1

수정배양액에 MBCD릅 처리 시 갱자의 청세 반용애 미치는효파

얘양시간 혈 청채 안용 정도흉 경토하기 위해 mTBM에 0 여%

BSA

βgma A-45æ)안 청가한 기본 배양액(Control) 에

Ca ffcine (2 mM), MBCD (50 u M)

및 Caf{eir、e

(2

mM)과

MB<그D (50

ψ’ 풍에

24 0' 1 '"

정자를 넣어주었다

Iocuba tion

후 0분， 3IJ분， 60분.， 180분， 36()분마다 슬라이드에

100

μ썩 용주하여 αB (Cooma똥ie

B rilliant

Blue) 영색 한 후 현미경

(3)

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8

용융자왼연구 져2û 씬 ραIl)

(400얘)에서 갱자 두부 영색 유무 판창용 하였다 청채 상태 의 판독 유무는 두부가 쭈르재 영색원 것온 정상이고 영찍 이 안 왼 것은 갱체 이상 정자로 판정하였다

2)

실험

2

체외수정 시 MBOJ저리가 분할융에 미치는 영향 제외수갱시 기본배양액 mTBM용액에 Caffei야올 청가하 지 않은 배양액 (CootroI)과

Caffeine (2

mM), MκD

(50"

씨 및

Caffeine (2

πM과

MBCD (50

ψO흩 항째 처리한

15 xlif / mt

정액으로

38 .5

t;,

5%

co，에서

6시간 수정한 뒤 IVC

배양액으로 냥지흉 옳겨 48시간과 %시간동안 배양 후 수정란의 분할융을 판창하였q..

6

통계처리

온 실엄얘서 얻어진 경와는

S A9W1 .1

κ>ckall"/I':읍 이용 하여 Duncan의

Multiple

Ran양 Test에 의하여 유의차 (P<Oα커를 겁갱하였다

m

^, ^결과

1

수정t:I H 't:I빽어 I MBCD를 처리 시 접자의 정제 옆킨세 미치는효과

배양시간영 정자의 청제연화흩 판창하기 위해 각각

mTBM

얘 。l우것도 정가하지 않옹 CootroI과

Caffeine

, ι1BCD 잊 Caffeine과 MBCD을 같이 처리하여 배양한 결과는 Fig.l과 같다

각각 처리별 배양시간에 따라 유의적(p<O.C에으로 정상 청에융이 낫게 냐타냥-..Q..oj ， 흔히 O운얘서는 MEκp 쳐 "1군

- -

에 ”

@

--”

g

”

@

a a {5

!R‘。。--。

Ee--s

。~

••

• C

,

^{" i}^..

... oco

ClC . . . iø'

‘ ^oco

，。

~ I ncubøIIon m ""'_뼈

’‘

^g

Fig. 1.

Cha

nge of

^의Jem1

acrosome state by incubation

pen여s

in pig s penn. ‘ ^8: Significant difference in treahnent groUps

(p이 O되

r<I: Bars with different SUperscripts within the same

cat，언l"'Y 이ffer sigr바kantly (p<O.05)‘

과 C빠인re과MBCD훌 딴이 처리했융 때 정상 갱체융이 유 의직@이 ffi)으로 낮재 나타낮다 360분간 배양한 정자의 경 우에는 MκE릉 저리한 정자가 갱상 청체융。l 유의적 (p<O.ffi)으로 낮게 나타났다

2

체외수정 시 MBCD:처리기 분힐율에 미치는 영항

MκD를 처리했융 때 수갱란의 분할융에 미치는 영향옹 검토하기 위해 mT IjM에 아누것도 정가하지 않옹 대조구，

caff，αle， M!l(그D빛 Caffeine파 MBCD륭 동시 처리한 정사로 수갱하였올 때 배양 후 수갱란의 48시간과 %시간 분항융용 판찰한 결과， 48 시 간 분항융에서

Caffeine

(66.3t1 .8%)과

MBCD (65.9

! l

.4%)

및 C앙feine파

MBCD

(73.7!l.7%)를 동 시얘 처리했을 때 유의직ψ<0.05)인 자이가 나타나지 않았 으냐 대조구β4.8:t7.4)에 비해 유의적(p<O'<에으로 높온 비융 의 분할융올 나타냈다σ'able

1)

Table 1.

Ra

te of pig embryo deavage at 48h after fertilization

N。 이

Oeavage No

미

embryos

develo야d

10 (Mean%tSE M)

Dege<、eration

Treatmenls

α>cytes

cxamincd

^(Mean%^:tsa끼

2-cell

4<e

II 8-t

6c

ell

(Mean‘，5."씨

Co

ntrol 363 134 26 48 % 229

β4.8:t7.4%l (19.9' 3.7%) (33.6

>4

.0%) (46"'6.4%) (62.9:18.6% )"

C앙fcinc

288 192 40 32 120 %

(66.3n8%t (21.H4.3%) (14.8' 8.0%) (63.8

t1

0.0% ) (33.6

:tl

.8%)b

MBCD 261 173 38 32 103 98

(65.9H.4%t (21.7;!0.7%) (15.9

^:1:

7.1 %) (6

2.

3 û. 8%) (37.0

fJ

.9%)b

'"κ'eine

272 43 84 145 %

368

σ3.7z1.7'lW

(16.H

1.

8%) (30.9

^:1:

0.4%) (528

:t

2.2% ) ( 26.2

:t;l

.7% )b

+κ'BCD

‘1> Di

fferen “ ^SU

야T.>Cript

letters denote significantly difference in saræ

∞lumns (p<O

.05); n

"'-4

(4)

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당fcctof 씨‘hyl-bcta-cyd여cxlrin ∞

spcnn

^Acru;o

rrc

R잉ction ar성

Embryo Oeavage aftcr

in

vitro

Fcti

lization in

Pi

g 9

96시간 후 분할융은 <!8시간 후와 아찬가지로 처리군 간에 유의걱 (p<O.05) 얀 차이는 없었으나， 대조군과 비교하었을 때 각 처리군에서 유의적 ψ이05)으호 높은 분할융을 나타 냈다 다른 처리군애 비해 대죠군 (20.4t2.4%)과 Ca

ffeine

+

Mκo (19.3t28%)를 처리했올 시 분힐된 수갱란 중 4<e11로 방달된 비융이 유의적 (p이 05)으로 높았고 S<e11이 상 운힐왼 수갱란은

Caffei ne

(83.3tO.8%)을 처리했을 때 유 의적 @이뼈으로 가장 높게 나타났다 πa비e

2)

Table 2

Ra

te

of

pig embryo

c1

eavage a ‘ ^96h ^after

fe:rtili깅tion N。 이

ζleavage N。 이

embryos

^devel얘ed

1 0 (Mean%iSEM)

Dege<、erabon

Treatments

。ocyt'"

examincd

^(M'잉l%^:tSEM)

2-cell

4-æ1l

8-1

6c

ell

(M，~‘ '5EM)

172 19

36 117

191

Conσ。1

363 ₍₄₇

_.4

_i _4.2%)b ₍₁₀

.3::tl

.7%)

α0.4i2.4%)"

(69.H3

.3

%)b (52

.5::t4

.2% )"

205 20 14

^{1 꺼}

83 caffeinc 288

σ1.7::t3.4%)"

(9.6i O.8%) (6.9i O.7%)b (83.3

::t

0.8%)‘ (28

.1i3.4

% )b

187

26

24 137 81

MBCD 261

σ1.0::t2.4%t

(14.3

::tl.l

%) (12.0

::t2.3

%t b (73.6

::tl

.l %)"" (31.0

!2

.0% )b

caffeÎnc 272 26

54

191 %

+MBCD

³⁶⁸

(?3 .3

;:t

l.3% t (9.6i O .7%l

‘19.3소2.8%)' 쩔 O소3.5%t (26.7土l.3%t

‘ b

Differen

t

su야rscript

I얹얹""S denote significantly difference

in 앓.me col뼈lI1S

(p<O .ffi); n

=4

IV. 고찰

돼지는 체내에서 다정자 침입율온 다른 동물에 비해 x←40%갱도로 극히 높다(Polge， 1’연/ 배미y，

1961)

체외수 정에서도 다정자 캠입융이 65% 에 이른다고 보고되었고 (W

ong

동.，

1991)

, 이 때운에 수정 후의 배가 정상객인 개제 로 발생하는데 어려융이 있다 따랴서 본 연구는 왜지정자 의 청체반용 조정용 통해 체외수정놓력을 양상시키고자 실 험을실시하였다

돼지 체내상태에서 배란 원 난자의 정상적인 수갱융은 95%이상으로(Hunter， 1φ3) 01와 대조칙으로 셰"1상태애서 는 수정원 낭X 는 웅성전액형생 기간 통안에 다수의 수정능 획득된 정자에 장시간 노중 되어 다정자 침입이 밭생하게 왼다이.agai 와 Moo

r

,

l m)

이와 같은 사질응 시출갱자나 정소상체 정지흘 이용하였융 예에도 동일한 결과를 냐타낸 다(KiJa띠b 퉁.，

1917; Park

퉁.， 1W끼 셰내외 수정파정에서 정자의 수정농획득과 챔체안용온 수정융 향상훌 라우하는 중요한 요소이기 예문에 갱자외 수갱능 획득용 조정하기 위 얘 카에인N‘Na 와 Ohg.αla， 1~)， 혜와린(hepariα Paπish 둥， 1잊뼈，

caz·

운반체(Ca2> - îonophorε T따=hi 와

Hanada.

198씨퉁이 항유왼 얘양액에서 15분 동안 배양하는 방법이 주로 。l용원다 카왜인용 갱자의 운동성올 강화하고(Ge>-어5 둥，

1973)

수정농용 자극할 분안(Wang 둥，

1991)

아니라 갱 채반응을 일으킨다(Funahashi 와 Na얻i，

2000)

그러나 쩨외 수정 시에는 청제반용 유도에 의한 높온 다정자 캠업용 발

생시키는 데 관련이 았다{Funahashi 와.，

Nagai

,

2001)

카애 인에 의해 발생되는 다정자칭입용 방지하기 위한 앙엉으로 수정란이 카에인에 노출되는 시간올 줄여주는 방법(fu버B야U 와

Ro

nru, 2(04)과 애와수정 시에 정자를

5

mM의 카애인 이 항유된 애양액에 5분 동안 공배양시켜 카페인이 없는 낭 자 배양액에 넣어주어 정지투명대 결함을 조정해주는 앙엉 를아 제시되었다 그러나 용 연구에서는 카쩨인 이외에 정 자 영세만용올 조정하고 체외수갱올 향상시키기 위해 세포 악내 할레스터1룡옹 유충시키는 것으로 얄려진 κ1ethyl.beta 이dedextrin 뼈CD)올 이용{V=t 퉁， 1999)하였다 정자 의 청체반용 정도융 일아보기 위해 6시간동안 첩채반용윷 유도한 결과， 카매인(33.713.9)에 비해 MBCD안 처리한 정

~l{22.6il이와 카에인과 MBCD흉 공통 처리한 정재'27.3i 3 이에서 정상 청체융이 유의적(p<OJ5)으로 낮게 나타나는 것용 확인할 수 있었다 (F

ig. 1)

이와 같옹 결파는 정자 악 내 훌레스태를이 갱제반용~l 결정척인 역할응 한다는

Sha dan

됨2(04)이 보고한 내용과 상용"&-}는 경과로 이는 카 매인요다 MBCD가 갱자의 청째반용 유딴앤안 아나라 더육 효파척인 것융 알 수 있으며， 체외수갱 시 정자의 챔투융올 향상시키기나 정자의 수정능력용 조절하는데 효과적으로 이용될 수 있다는 정을 시사힌다

Fi g.

1에서의 결과를 토대로 M또D흩 이용해 돼지 세외

수정에서의 낮은 운항융파 애 알당융올 향상시키고 애 알당 션 운항융얘서의 효과를 확인하기 위해 Caffeine과

MBCD

퉁올 처리하고 대쇼군으흐 두 시약이 제외왼 수성용 배양액

(5)

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10

용융자핀연구 제20권 (2OCθ)

(mTB씨으로 정중질헝올 실시하였다 。l는 체외수정에 있 어서 다정자 칩입이 호기 배 방당융 저지&J-e 것으혹 암혀 져 있으며t 실험격인 조건에 영향을 받는다고(Hun'ec，

1991)

앙려져 있기 때운에 본 연구에서는 수갱융 보다 수정 후 수 정란 분할융에 초정용 두었마 실험 컬파 대조군파 저리문 툴 간의 유의적ψ<0，[에 차이는 있었으나 처리군툴간의 유 의척ψ어æ) 차이는 보이지 않았다 확실한 경"1흉 위해 전 핵 판창용 통한 다정자 침입융 정사흉 실시하진 않았지만 결과적으로 MBCD는 c뼈eme보다 돼지 제외수갱융 향상용 위한 효과적인 청가제는 되지 않았다 그러나 MBCD가 셰 외수갱 시 CaffeiÆ과 상웅하는 역힐을 하며， 콜래스테흉이 청채 반용조절에 직접적인 영향용 준다는 정파 룡레스태용 조정율 흉한 체외수정능 조정에 대한 가능성을 확인 할 수 있었덩연구였다

최근에 다갱자 칭입을 출여주기 워하여 조직배양을 변앵

(F unahashi

와

Nagai

, 2COJ)하여 생융학적인 생제조직 상태 로 오땅한 M1

crofluidic

장치 (a"，k 퉁， 2005)와 체내상태홍 모빵한 관올 이용i까여 정자의 운동성을 조절한 수정방엉 둥 이 연구되고 있으며， 화학적으호 청체 효소인 벼허uroru야""

의 억제재인 Anti-hyaluronidase을 이용하여 Hyaluro미 dæe 의 활성조정과 투영대에서 야기되던 청처1만용옹 대체하여 다정자싱업을 저지시키는(fa'앤'"。 둥， 2OJ5; Tokes:미 1 둥，

200끼방엉도 제시되고 있다 비록 본 연구의 결과는 효과걱 이지 옷했지만 채외수정융 향상을 위해 정자의 청체 얀용 조정올 통한 가능성융 확인 할 수 있었으며 앞으로 체외수 정융 향상과 더붙어 질 좋은 수정란 생산을 위해 더 많은 연구기 영요하다

V

, 요약

본 연구는 제외수정 능역 향쌍올 워하여 정지에 MκD흩 처리룡 통해 정자의 청채얀용올 죠정과 세외수정에서의 분 할융에 미치는 영향올 알아보고자 하였다 본 연구에 이용 왼 남자는 난!L쟁과 남우세요가 균일한 난자용 선영하여 42-44시간 동안 1α<199 배양액에서 성숙 배양단계 (38.51:，

5%

α‘)률 거쳤다 체외수갱 시 정자 농도는 신선정액 ('.5"0' 유"""1

m잉으로

하였으며

’ ^nTBM

수정액내에 각각

Con

tro l/ caff

eiÆ

l

MB<끄(5(\빼I Caff

eine +

MBC대떠l 씨로 각각 처리하여 6 시간 동안 배양하였다 수정란응 난자 주위 남구쩌포와 정자율 깨끗이 제거한 후，，끼&ι3용액에 융겨 배잉(영.51:，

5% co,)

시키고， 운항융

(48"

96h) 을 판

첼하였다 MBCD 처리 시 정자 내 청채 만용에 대한 연화를 암아보기 위해

Contro 1. Caffeine

, MBCD(5OpA이와 c.κ"""

과 MBCD (50뼈 둘 다 치리한 갱자훌 O운， 30운， 60운， 3시 간 6시간마다 슬라이드에

100

μt씩 분주S↑여 도얄한 뒤

CBB

로 염색해 준 뒤 판창하였다 정자의 갱체반용율 갱샤한 결 과 0분에 MBCD안 처리했율 때 청새 손상율이 가장 높게 나타났다 마찬가지로 30분， 60분， 1시간， 3시간， 6 사간 모두 MBCD만 처리했용 때 청채 손상흉이 가장 높게 나타났다 따라서 뼈CD용 저리 했을 때 청체 반용이 기장 툴리 일어 난 것융 용 수 있었다 제외수정 후 분할융옹 대조군과의 유 의척(P<O뻐 차이는 있었으나 CaffeÎÆ, MBCD 및 CaffeiÆ

+

MBCD간의 유의적 차이는 없었다 본 연구의 경과로 보 아 MBCD는 정자의 청쩨반용이 카애인과 달리 빠르게 일어 났으여t 반연 체외수정 파정에서는 MBCD처리에 따른 운할 융 성에시의 유의적ψ<0.(꾀 효과는 없었다 그러나 기존의 Caffeine과 MBCD 단독처리간의 유의적 차아가 없어

CaffeiÆ

대체 용질로 이용 가능성올 확인 할 수 있었다

사사

본 연구는 농촌진흥청 바이오그련 잉 사업(파제번호;

2OO7OlO1쩌여이의 지웬에 의해 이루어겼으며， 본 연구료 수 앵하는데 있어서 정액의 분석에 도용융 춘 강원대학교 동융 자원공동연구소에 강사드립니다

VJ

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ntrol group

f ertilized.

treatment reagent T reatment

“,...

‘Ni th caffeine ,

and caffeine with MBCD for 180 and 360

Porcine oocyte-cumulus complexes

ere cultured in

-199 medium

f1 uid

hon:rona1 supplerrent with FS H,

hCG

S::;F for

Ius.

in the

medium without honnona1 suppl

t

additional 21-22 hrs.

denuded by 0

% h ya1 uronidase treatment

“ rere in vitro

1 .5 x10"'

in four different mTBM !n!dium not

and contair ‘:rl caffeine , MBCD or for 6 hrs. After in vitro fertîlization ,

were

into PZM-3

O .æ% 16A

cleavage

embryo

ev

uated at 48

96 hrs.

‘"'"

in four different mTBM mxii um, the integrity of acrosorre was signific antly

05) lower treated than other treatrnent groups at

cleavage rates of pig

'"'"

y

lower in

other treatment groUp ‘ However , ’ t was not signiñcantly different groups. In conclusion, the MBCD

in pig sperm

effect on acrosome reactiOn, but rate of

not affected

Key w

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Acrosorre reaction, Embry O d eavage

I. 서론

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E-mai l: parkc

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