대한비과학회

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알레르기비염환자 코점막 상피세포에서 IL-4, IL-13, TNF-α 자극에 의한 Thymus and

Activation-Regulated Chemokine의 발현

경희대학교 의과대학 이비인후과학교실

이건희·김성완·신승엽·조중생

Expression of TARC in Nasal Epithelial Cells by IL-4/IL-13 and TNF-α in Allergic Rhinitis

Kun Hee Lee, MD, Sung Wan Kim, MD, Seung Yup Shin, MD and Joong Saeng Cho, MD

Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Kyung Hee University, School of Medicine, Seoul, Korea

ABSTRACT

Background：Thymus and Activation-Regulated Chemokine (TARC) is a highly specific ligand for CCR4 expressed in Th2 lymphocytes. Local production of TARC may play an important role in the induction and maintenance of allergic inflammation with the infiltration of Th2 lymphocytes. However, the cellular sources of TARC among patients with allergic rhinitis (AR) remain unclear. Objective：We investigated that nasal epithelial cells from AR could produce TARC and that they could produce TARC differently by various stimulation of cytokines. Methods：Inferior turbinate mucosal tissues were collected from six patients with AR sensitized to house dust mite. Nasal epithelial cells were isolated, cultured and stimulated with IL-4, IL-13 or TNF-a alone or in combination. The level of TARC in the supernatant was measured by ELISA and mRNA expression of that in the cells by RT-PCR. Results：The level of TARC from cultured nasal epithelial cells (CNEC) among allergic rhinitis patients was higher than that in the control group. IL-4 or IL-13 or TNF-a alone did not upregulate TARC production from CNEC. However, Th2 cytokines in combination with TNF-a increased the production of TARC in CNEC.

Conclusion：IL-4, IL-13 and TNF-a could upregulate TARC production from nasal epithelial cells in allergic rhinitis and contribute to the infiltration of Th2 cells to the tissue during allergic inflammation.

KEY WORDS ：TARC·Epithelial cells·Allergic rhinitis.

서 론

알레르기비염환자 코점막의 조직학적 특징은 호산구, 비만 세포, Th2림프구의 유입이고 그 중 Th2림프구는 세포표면 에 CC 케모카인 수용체 인 CC chemokine receptor3(CCR3), CCR4, CCR8을 발현한다.¹⁾²⁾

이 중 특히 CCR4는 Th2림프구에 선택적으로 발현하기 때

문에 CCR4 배위자인 Thymus and Activation-Regulated Chemokine(TARC)이 Th2림프구에 대한 강력한 화학주성 인자이며 TARC의 조직 내 생산을 통한 Th2림프구의 조직 내 유입이 알레르기 반응을 유도, 유지하는데 중요한 역할 을 하는 것으로 알려져 있다.³⁾ 알레르기 천식환자의 기관지 상피에 TARC 발현이 증가되어 있으며,⁴⁾ 알레르기 천식환 자를 항원으로 자극하면 기관지폐포세척액에서 TARC 생산 이 증가된다.⁵⁾ 천식동물모델에서도 항TARC 항체를 처치한 후 항원으로 자극하면 기도내로 호산구유입이 Th2 싸이토카 인 양과 CD4+ 림프구의 수와 비례하여 감소함이 밝혀졌다.⁶⁾

TARC를 생산하는 세포들로는 말초혈액의 단핵세포, 대식 세포, 흉선세포, 수지상 세포, 혈관내피세포, 기관지 상피세포 등이 알려져 있다.^4)7-9) 알레르기비염환자에서는 점막조직에서 이 논문은 경희대학교 2006년도 신임교수 연구비 지원에 의한 논문임

(과제번호 KHU-20060457).

논문접수일：2008년 7월 4일 / 심사완료일：2008년 10월 2일 교신저자：이건희, 134-090 서울 강동구 상일동 149번지 경희대학교 의과대학 이비인후과학교실

전화：(02) 440-6181·전송：(02) 440-7336 E-mail：[email protected]

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TARC 생산이 증가되어 있음이 보고되었으나,¹⁰⁾ TARC를 생산 하는 세포와 생산에 영향을 미치는 싸이토카인에 대한 연구는 미약하다. 이에 본 연구에서는 알레르기비염환자의 코점막 상피세포에서 TARC가 생산되는 지를 확인하고 알레르기염증 과 관련이 있는 싸이토카인으로 자극하였을 때 TARC 단백질 의 생산과 mRNA발현에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

검체 수집

검체는 알레르기비염 증상이 중등도/중증 지속성 알레르기 비염에 해당되고 집먼지 진드기(Dermatophagoides farinae, Allergopharma, Reinbek, Germany) 알레르기 피부단자검 사 시약을 이용한 피부반응검사에서 히스타민 대조액과 반 응의 크기가 같거나 더 큰 경우를 양성으로 판정하여 양성 을 보이는 알레르기비염환자에서 하비갑개 절제술시 얻은 하비갑개점막을 사용하였으며 수술 전 한 달 이내에 전신 혹은 국소 스테로이드를 사용한 경우와 만성부비동염, 비 중격 만곡증, 비용이 동반된 경우, 코수술을 받은 과거력이 있는 환자, 아토피 피부염이나 천식의 증상이 있는 경우는 대상에서 제외하였다(n=6). 채취된 코점막을 상피세포의 배 양을 위해 사용하였다. 대조군으로 만성비후성비염으로 하 비갑개절제술을 시행받는 환자들의 코점막을 사용하였다.

본 연구는 임상시험윤리위원회의 심의를 거쳐 승인 받았으 며, 모든 환자들에게 동의를 받은 후 시행되었다.

상피세포의 배양

분리된 상피층을 0.1% protease(type 14, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 함유한 McCoy ’s 2+ 배양액(GIBCO, Grand Island, NY)에 옮겨 4℃에서 16시간 동안 처치하였 다. 배양액에 15% FCS을 첨가한 후 거즈를 통해 분리된 세 포를 여과시키고 200 g로 10분간 원심 분리시켰다. 얻어진 침사를 McCoy ’s 2+ 배양액으로 다시 부유시키고 콜라겐 이 처리된 24well 배양접시에 1×10⁵개씩의 세포를 분주하 고 5% CO2, 37℃에서 24시간 배양하였다. McCoy ’s 2+

배양액으로 3회 세척하여 유리세포를 제거한 후 15% FCS, 1% penicillin-streptomycin(GIBCO)을 함유한 McCoy ’s 2+ 배양액에서 합류(confluence)될 때까지 5% CO2, 37℃

에서 5~7일간 배양하였다. 배양된 세포는 cytokeratin양 성인 상피세포로 이를 이용하여 실험하였다.

싸이토카인 자극

싸이토카인은 재조합된 인간 Interleukin-4(IL-4), IL-

13, Tumor necrosis factor-α(TNF-α, R&D system, Min- neapolis, MN)를 사용하여 자극하였는데 72시간동안 1×10⁵ 개의 세포에 IL-4 (10 ng/mL), IL-13 (10 ng/mL), TNF-α (50 ng/mL) 단독으로 처리하거나 IL-4와 TNF-α, IL-13 과 TNF-α 함께 처리하여 상청액을 얻은 후 -70℃에 보 관하였고, 세포는 6시간동안 싸이토카인 처리한 후 세포를 얻어 0.05% trypsin으로 5분간 처리한 후 인산완충용액으 로 세척하고 14,000 rpm으로 5분간 원심 분리시켜 얻어진 침사를 1 mL의 Trizol^®로 녹인 후 RNA를 추출하기 전까 지 -70℃에 보관하였다.

세포에서 총 RNA추출

세포가 녹아있는 Trizol^® 용액을 가압 멸균된 RNA 미세 원심 분리시험관에 넣고 200 μL의 클로로포름을 첨가 후 흔들어 잘 섞이게 하고 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리 하여 상청액에서 500 μL를 취하였다. 상청액과 동량의 iso- propanol을 넣고 에펜도르프 튜브를 위, 아래로 흔들어 잘 섞이게 하고 10분간 방치 후 13,000 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 얻어진 RNA 침사를 70% 에틸 알코올로 세척한 후 13,000 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 용액을 버리고 말리다가 diethyl pyrocarbonate를 처리한 증류수 5~10 μL 로 RNA 침사를 녹여서 RNA를 추출하였다.

역전사중합효소 연쇄반응(RT-PCR)

역전사중합효소연쇄반응 키트(Takara Shuzo, Tokyo, Ja- pan)를 이용하여 각 군마다 2 ug의 RNA를 역전사반응액(5 mM MgCl2 4 μL, 1xRNA PCR buffer 2 μL, 1 mM dNTP 2 μL, 1 unit/μL RNase inhibitor 0.5 μL, 0.125 μM oligo dT 1 μL, 0.25 unit/μL Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase 1 μL)과 혼합하여 수조에서 42℃, 1시간을 반응시키고 94℃에서 5분간 유지한 후 증류수로 희 석하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 3~5 μL를 중합효소연 쇄 반응액(5 unit/μL TaKaRa Taq polymerase, 10 x PCR buffer, 2.5 mM dNTP mixture)과 혼합한 후 β-actin을 대조군으로 이용하고 1 uM의 TARC 특이 시발체(sense；

5’-CTCCTCCTGGGGGCTTCTCT-3’, anti-sense ；5’-GT-

TGGGGTCCGAACAGATGG-3’)를 이용하여 중합효소연쇄

반응을 시행하였다. DNA Thermal Cycler(Gene Amp PCR system 2400, Foster city, CA)를 이용하여 TARC의 경우 94℃ 1분(변성반응, denaturation), 60℃ 2분 (결합반응, annealing), 72℃ 3분(연장반응, extension)으로 30회를 증 폭한 후 72℃ 10분(재연장반응, reextension)으로 마쳤다. 증 폭된 산물은 2% 아가로오즈 젤에서 전기영동한 후 ethium

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bromide용액으로 30분간 염색하여 확인하였다. 중합효소 반응 띠의 밝기를 농도분석기(Image analyser, Bio-Profile, Vilber Lournat, France)를 사용하여 측정한 후 β-actin과 의 상대적인 정량비를 백분율로 구하였다.

TARC 정량

배양된 상피세포를 싸이토카인으로 72시간 자극 후 상청액 에서의 TARC 농도를 TARC Quantikine ELISA kit(R&D system)를 이용하여 측정하였고 민감도는 7 pg/mL이하였다.

통 계

대조군과의 차이를 Wilcoxon 검증을 이용하여 비교하였고 SPSS 12.0 for window 프로그램(SPSS Inc., Chicago)을 이 용하여 p<0.05인 경우를 통계학적으로 의미 있다고 하였다.

결 과

알레르기비염환자의 코점막에서 배양된 상피세포에서 대조군인 만성비후성비염환자의 코점막상피세포에 비해 의 미있게 많은 TARC생산이 있음을 알 수 있었고(Fig. 1), 알 레르기비염환자의 코점막 상피세포를 IL-4, IL-13나 TNF- α 단독으로 자극하였을 때 음성대조군과 비교했을 때 유 의한 차이를 보이지 않았으나 IL-4와 TNF-α, IL-13과 TNF-α로 함께 자극한 군에서 각각 274.15±32.68 pg/mL,

244.88±23.09 pg/mL로 의미 있게 TARC 생산량이 증가 하였다(Fig. 2). IL-4 혹은 IL-13과 TNF-α로 6시간 자극 한 상피세포에서 TARC mRNA의 발현이 증가되었다(Fig. 3).

고 찰

1996년 Imai 등이 처음으로 말초혈액의 단핵구에서 시그 날 배열방법을 이용하여 TARC를 분리하였으며,⁷⁾ TARC는

Fig. 1. The level of TARC protein in the culture supernatant of epithelial cells in perennial allergic rhinitis (PAR) and chronic hypertrophic rhinitis (CHR). Both cultured epithelial cells were incubated with PBS for 72 hours and then analyzed for TARC by ELISA. The level of TARC in PAR is significantly higher than that of CHR (p<0.05). Data are mean±SEM of values from 6 patients.

Pg/mL

250

200

150

100

50

0

PAR CHR

*

Fig. 2. Synergistic effect of IL-4, IL-13 and TNF-α on TARC pro- duction from cultured nasal epithelial cells. Cells were stim- ulated with IL-4 (10 ng/mL) or TNF-α (50 ng/mL) and IL-13 (10 ng/mL) or TNF-α (50 ng/mL) for 72 hours. Control was incu- bated in PBS for the same time period. Data are mean±SEM of values from 6 patients (*：significantly differ from control, p<0.01).

TARC protein (pg/mL)

500

400

300 200

100

0 C

* *

IL-4+

TNF-α IL-13+

TNF-α

IL-4 IL-13 TNF-α

Fig. 3. Semi-quantitative mRNA level of TARC in cultured nasal epithelial cells (CNEC). Cultured cells were incubated with IL- 4 (10 ng/mL) or IL-13 (10 ng/mL) and TNF-α (50 ng/mL) for 6 hours and then analyzed for mRNA expression of TARC by RT- PCR. The ratio of TARC mRNA to β-actin mRNA was determin- ed as percentage. A representative data of three independent experiments is shown.

Ratio of TARC expression to β-actin

80

60

40

20

0

CNEC (PBS)

CNEC (IL-4+TNF-α)

CNEC (IL-13+TNF-α) (%)

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염색체 16q13에 위치하며 2176 염기쌍의 길이를 가진다.¹¹⁾ 인간에서 TARC에 대한 연구는 Sekiya 등에 의해 시작되었 는데 면역조직화학염색을 통해 천식환자의 기관지 상피에서 정상인에 비해 TARC의 면역반응성이 높게 발현되었다.⁴⁾ 본 연구의 결과에서도 코점막 상피세포에서 TARC 생산을 확 인하여 알레르기비염 환자의 코점막으로 Th2세포의 침윤 을 촉진하는 하나의 인자로 생각된다.

여러 싸이토카인의 자극에 의해 TARC를 생산하는 세포에 대해서는 각막의 섬유아세포, 피부의 상피세포와 섬유아세 포, 폐나 코점막의 상피세포 등이 알려져 있는데 기관이나 조직에 따라 TARC를 생산하는 세포가 서로 차이가 있음을 알 수 있다.⁴⁾¹⁰⁾ 시험관내 실험을 통해 TARC의 분비를 증 가시키는 싸이토카인에 대해서도 서로 다른 보고들이 있는 데 폐암 세포주인 A549에서는 IL-4와 TNF-α, TNF-α /IFN-γ/IL-4의 동시 자극에 의해서, 기관지 상피세포주인 BEAS-2B에서는 TNF-α/IFN-γ/IL-4 동시자극의 경우 에 TARC의 mRNA 발현이 증가한다는 보고가 있었다.⁴⁾ 본 연구에 IFN-γ를 이용해 실험하지 않아서 기관지 상피세포 주를 이용한 연구와 정확한 비교는 되지 않지만 IL-4 혹 은 IL-13과 TNF-α의 동시자극에 의해서 TARC 단백질 생산량이 증가하는 결과를 얻었다. 또한, IL-4나 IL-13 단 독으로 자극한 경우 TARC 생산이 증가하지 않았기 때문에 TARC 생산 증가에는 Th2싸이토카인과 proinflammatory cytokine인 TNF-α의 동시자극이 필요함을 알 수 있었다.

알레르기비염환자의 코점막내에서 TNF-α를 분비하는 세 포로는 비만세포를 생각할 수 있고, 비만세포는 TNF-α 뿐 아니라 IL-4, IL-5, IL-6, IL-13과 같은 Th2 싸이토카인 이나¹²⁾ GM-CSF의 주요 세포원으로 알려져 있다. 추가 연 구가 필요할 것으로 생각되지만, 알레르기비염환자에 있어 서 중요한 역할을 하는 비만세포로부터 분비된 IL-4, IL- 13, TNF-α가 코점막의 상피세포에서 TARC를 생산하고 이를 통해 Th2세포가 유입되며, 유입된 Th2림프구에서 분 비되는 IL-4와 IL-13이 TARC 생산 증가에 참여하는 양성 되먹임순환(positive feedback loop)의 기전도 조심스럽게 유 추해 볼 수 있다.

Th2 싸이토카인과 TNF-α가 협동적으로 코점막 상피세 포에서 TARC 생산을 일으키는 정확한 기전은 아직 명확하 게 알려져 있지 않고 촉진부(promotor region)에 대한 정 보도 없지만, 기관지 상피세포에서 TARC 생산은 NF-κB에 의해 조절된다는 보고가 있다.⁵⁾ 최근에는 IL-4와 TNF-α 가 기관지 상피세포에서 TARC를 생산하는 신호전달체계로 표피성장인자 수용체의 인산화를 통해서 이루어진다는 보 고도 있지만¹³⁾ 코점막 상피세포에서의 Th2 싸이토카인과

TNF-α의 동시자극에 의한 TARC 생산기전과 신호전달체 계에 대해서는 앞으로 더욱 많은 연구가 필요할 것이다.

결 론

알레르기비염환자의 코점막 상피세포에서 TARC가 생산 되고 발현되는 것을 확인할 수 있었으며 Th2 싸이토카인 과 TNF-α에 의해 TARC 생산이 증가되었다. 이는 알레르 기비염의 코점막에서 Th2 싸이토카인과 proinflammatory cytokine인 TNF-α와 동시에 작용하여 TARC의 생산을 증 가시키고 이로 인해 Th2 림프구가 점막내로 유입되어 알 레르기 염증반응을 일으키는 것으로 이해되며 알레르기비염 의 만성염증의 하나의 기전으로 생각할 수 있을 것이다.

중심 단어：Thymus and Activation-Regulated Chemo- kine·상피세포·알레르기비염.

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