대한비과학회

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기도 알레르기 마우스 모델에서 기도재형성에 관한 연구

충남대학교 의과대학 이비인후과학교실, 암공동연구소

김효선·김동현·박재용·최진웅·김용민·나기상

Airway Remodeling in Mice with Experimentally Induced Airway Allergy

Hyo Seon Kim, MD, Dong Hyun Kim, MD, Jae Yong Park, MD, Jin Woong Choi, MD, Yong Min Kim, MD, PhD and Ki Sang Rha, MD, PhD

Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Chungnam National University College of Medicine, Daejeon, Korea

ABSTRACT

Background and Objectives：Allergic rhinitis and asthma display many similarities in their epithelial and inflammatory responses to allergens. However, one notable difference is that disruption and desquamation of the epithelium is a characteristic feature of asthma, whereas, in allergic rhinitis, the epithelium is intact. Airway remodeling is a well-recognized feature among patients with chronic asthma but not in allergic rhinitis. The purpose of this study is to investigate the airway remodeling in mice with experimentally induced airway allergy. Subjects and Method：Male BALB/c mice were systemically sensitized with ovalbumin mixed with aluminum hydroxide gel solution and were challenged with aerosols of ovalbumin. Then, the mice were chronically exposed to aerosols of ovalbumin for 5 weeks to 10 weeks. After the last exposure, bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and nasal lavage fluid (NLF) were collected. Next, the number of inflammatory cells and the concentrations of IL-5, IL-13, TGF-β and IFN-γ in BALF and NLF were measured. Finally, nasal cavity and lung specimen were obtained to evaluate the subepithelial fibrosis by trichrome stain and the expression of MMP-9 and TIMP-1 by immunohisto- chemical stain. Results：The concentrations of IL-5, IL-13, TGF-βwithin the BALF & NLF were found to have significantly increased in the 10-week exposed group compared with the control group. The expression of MMP-9, TIMP-1 and subepithelial fibrosis in the lung tissue were also found to have significantly increased in the 10-week exposed group comparative to that of the control group. But the expression of MMP-9, TIMP-1 and subepithelial fibrosis in the nasal mucosa were not prominent in the 10-week exposed group compared with the control group. Conclusion：The results suggest that airway remodeling may be induced by repeated allergen exposure in allergic rhinitis but the structural changes of the nasal mucosa by remodeling process are less prominent compared with the lung tissue.

KEY WORDS：Allergic rhinitis·Airway·Remodeling.

서 론

기관지 천식과 알레르기 비염은 임상적으로 공통점이 많 은 기도 알레르기 질환으로 알려져 있다. 기관지와 비강 점막의 상피층은 조직학적으로 같은 종류의 세포와 유사한 점막하 조직으로 구성되어 있으며, 각각 외부의 자극이나 알레르기 항원에 대하여 혈관 확장, 혈장 유출, 선분비 증 가, 호산구를 비롯한 염증 세포의 침윤 등 유사한 염증 반

응을 보인다. 따라서 최근에는 두 질환이 같은 증후군의 서 로 다른 임상적 표현형이라는 개념 즉‘one airway disease ’ 라는 개념이 받아들여지고 있다.¹⁾²⁾

그러나 기관지와 비강은 위에서 언급한 공통점 이외에 해 부학적 차이점을 가지고 있다. 우선 비강에는 비모가 있어 하기도까지 입자가 들어가지 않도록 막아준다. 또한 비점 막에는 상피하 모세혈관 및 동정맥 문합이 잘 발달되어 있 어 점막의 두께 및 기도의 저항을 조절하는데 중요한 역할 을 한다. 알레르기 비염에서 비폐색의 악화를 가져오는 주 된 원인은 이러한 점막 혈관의 조절이 원활하지 않기 때문 으로 알려져 있다. 이에 반해 하기도인 기관지에는 비점막 에 존재하지 않는 평활근이 있고, 이러한 평활근의 수축은 기관지 천식에서 기도 폐쇄를 일으키는 주된 원인이 된다.

논문접수일：2007년 2월 21일 / 심사완료일：2007년 6월 28일 교신저자：나기상, 301-721 대전광역시 중구 대사동 640 충남대학교 의과대학 이비인후과학교실, 암공동연구소 전화：(042) 220-7698·전송：(02) 253-4059 E-mail：[email protected]

기관지 천식과 알레르기 비염환자는 조직학적 변화에서 도 분명한 차이를 보인다. 천식 환자에서는 알레르기 항원 에 지속적으로 노출될 경우 상피세포의 와해 및 탈피가 발 생하지만 알레르기 비염에서는 비강 내 상피세포가 비교적 잘 보존되어 있는 경우가 대부분이다.^1-4) 기관지 천식에서 는 상피조직이 와해되고 배세포 증식, 점액선 비후, 섬유아 세포 증식, 콜라겐 및 세포 외 기질 단백질 침착, 상피하 조 직의 섬유화에 의한 기저막의 비후 등이 일어나게 되는데, 이러한 일련의 조직학적 변화를‘기도재형성 ’이라고 한 다.⁵⁾ 이러한 기도재형성 과정은 기관지 천식에서 많이 알려 져 왔으나 알레르기 비염에서는 보고된 바가 거의 없었으 나,⁶⁾ 최근 이에 대한 연구 결과가 발표된 적이 있다.⁷⁾

본 연구에서는 난알부민을 이용한 마우스 기도 알레르기 모델을 만들고 장기간 항원에 노출하였을 때 상기도에서도 하기도에서와 같은 기도재형성이 나타나는지 알아보고자 하 였다. 최근 발표된 연구⁷⁾를 참고하였으며 이에 추가적으로 비세정액 및 기관지폐포세정액에서 호산구와 림프구의 수 를 측정하였고, 기도재형성과 연관이 있다고 알려진 IL-5, IL-13, TGF-β와 IFN-γ 등의 사이토카인을 측정하였다.

대상 및 방법

실험 동물 및 실험군

무균상태로 사육된 3주령의 수컷 BALB/c 마우스 30마 리를 사용하였다. 실험 1주일 전부터 온도 20~23℃, 습도 45~70%의 실험실에서 사육하여 실험실 환경에 적응하도 록 하였으며, 이 기간 내에 상기도 감염의 증상이나 다른 질 환이 관찰되는 마우스는 실험에서 제외하였다.

실험동물은 대조군(A군), 난알부민에 대한 알레르기를 유 발 후 5주 동안 난알부민 분무를 시행한 군(B군)과 10주 동

안 난알부민 분무를 시행한 군(C군)으로 나눈 다음 각각 10 마리씩 배정하였다.

난알부민을 이용한 기도 알레르기의 유도

전신감작용 난알부민 용액은 난알부민(Ovalumin, chicken egg albumin, Sigma Chemical Co. Phillipsberg, NY) 0.25 mg과 aluminum hydroxide {Al(OH)3} gel 10 mg을 PBS용 액 3 ml에 30분 이상에 걸쳐 혼합하여 3.3 mg/ml Al(OH)3

에 흡착된 0.25 mg의 난알부민 혼합액을 만들었다. 그리 고 이 혼합액 0.3 ml을 복강 내에 주사하고, 7일과 14일째 에 각각 한번씩 더 주사하여 전신 감작을 시켰다.

국소감작을 위한 분무용 난알부민 용액은 PBS 1 ml에 난 알부민 10 mg을 녹여 만들었다. 40×40×30 cm크기의 아 크릴 상자를 만들고 그 옆면에 구멍을 내어 분무기(jet nebu- lizer, Pulmo-Aide^®, Devilbiss, Somerset, PA)와 연결하였 다. 21일째부터 27일째까지 7일간 마우스를 아크릴 상자 내에 넣고 1% 난알부민의 용액을 분무기를 이용하여 매일 30분간 분무하여 국소감작을 시켰다.

이후 반복적인 항원노출을 유도하기 위하여 28일째부터 같은 방법으로 주 3회 1시간씩 난알부민 용액을 분무하였 으며 각각 유도 후 5주와 10주에 희생하였다. 대조군에서는 난알부민 혼합액 대신 동량의 phosphate buffered saline (PBS)을 복강 내에 주사하였으며 난알부민 용액 대신 PBS 를 분무하였다(Fig. 1).

알레르기 유발에 대한 확인

알레르기 증상 점수

알레르기가 유발되었는지 확인하기 위하여 국소 감작 후 5주, 10주째 희생시키기 전 15분간 각각의 마우스에서 재

Fig. 1. Experimental protocol. Systemic sensitization was performed by intra- peritoneal injection of OVA on days 0, 7, 14. After 1 week later, mice were challenged OVA aerosol daily for 1 week to induce local sensitization. After then, mice were further exposed OVA aerosol three times a week for 5 or 10 weeks. Control mice were injected and challenged with PBS instead of OVA solution. Mice were killed 24 hour after the last OVA challenge.

OVA or PBS inhalation OVA or PBS inhalation

Day 0

Day 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 Day 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 대조군

5 노출군

10주 노출군

Intraperitoneal injection of OVA or PBS

7 14 21 28 35 42 49 63

1 week 2 week 3 week4 week5 week 1 week 2 week3 week4 week5 week

1 week 2 week 4 week5 week

56 91 98

채기 횟수와 코를 비비는 동작의 횟수를 측정하여 이들의 합을 증상점수 (symptom score)로 기록하여 비교하였다.

난알부민 특이 항체(OVA specific IgE) 측정

마지막 노출 24시간 후 마우스를 드라이아이스를 넣은 스 티로폼 상자 안에 넣어 마취한 다음 혈액을 채취하였다. 개 복하여 하대정맥을 노출한 후 26G 1 cc 주사기를 이용하여 혈액을 채취하였다. 평균 채취량은 0.6 ml이었다. 채취한 혈 액을 4℃에서 2~4시간 동안 보관한 후 원심분리(1,200 g, 15분)를 시행하여 혈청을 분리한 다음 ELISA를 이용하여 OVA-specific IgE를 측정하였다.

96-well ELISA plate에 난알부민 용액(10 μg/ml OVA in PBS, pH 9.5)을 입힌 후 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였 다. 완충액으로 세척 후 비특이적 반응을 억제하기 위하여 Assay Diluent를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였 다. 다시 완충액으로 3회 세척한 다음 2-fold serial dilution 을 이용하였다. 혈청은 1：100으로 희석하여 0.1 ml를 넣 고 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 완충액으로 세척한 다 음 Working Detector(biotinylated anti-mouse IgE+strepta- vidin-HRP, BD Biosciences, San Diego, CA)를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 다시 세척한 후 기질용액 (tetramethylbenzidine-H2O2)을 넣은 다음 어두운 곳에서 30분 동안 보관하였고, 그 후 중지용액(H2SO4)을 이용하여 반응을 정지시키고 microplate spectrophotometer(SPECT- RA MAX Plus, Molecular Devicies, Sunnyvale, CA)를 이용 하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

비세정액과 기관지폐포세정액의 채취

혈액을 채취한 후 비세정액과 기관지폐포세정액을 채취하 였다. 기관절개를 하고 기관절개 창을 통해 cut-down tube 를 삽입하여 관의 끝을 기관 분기부에 위치한 다음 0.1 M PBS 용액 1 ml를 5분 이상에 걸쳐 서서히 주입하였다가 빼 내어 기관지폐포세정액을 얻었다. 기관지폐포세정액은 평 균 0.8 ml이 회수되었다. 이후 비세정액을 받기 위해 머리 를 신전하여 전비공이 가장 낮게 위치하도록 한 다음 기관 절개 창을 통해 cut-down tube를 삽입하여 관의 끝을 후 비공에 위치한 다음 0.1M PBS 용액 1 ml를 5분 이상에 걸 쳐 점적하고 전비공으로 흘러나오는 비세정액을 받았다.

비세정액은 평균 0.9 ml가 회수되었다.

세정액 내의 cytokine을 측정하기 위하여 윈심분리(100 g, 5분)한 다음 상청액 0.5 ml을 채취하여 측정 전까지 -70℃

에서 보관하였다.

비강 조직과 폐 조직의 채취

Trichrome 염색과 면역조직화학염색을 시행하기 위하여 비강과 폐 조직을 채취하였다. 마우스의 머리를 몸통에서 절단한 후 비강을 둘러싸고 있는 골을 포함하여 채취한 후 하악, 피부와 근육 등을 제거한 다음 24시간 동안 10% pa- raformaldehyde 용액에 넣어 고정한 후 탈회를 위해 0.25 M ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)용액에 담가두 었다. 상절치 바로 뒤에서부터 경구개의 절치 유두(insicive papilla)의 약 2 mm 전방부위까지 절단하여 블록을 만들고 파라핀 포매 후 5 μm의 두께로 절편을 만들었다.

폐 조직은 흉부를 절개하여 채취한 후 10% paraformal- dehyde 용액을 이용하여 고정하고 paraffin block을 제작하 였다.

비세정액과 기관지폐포세정액 내의 Cytokine 측정

비세정액과 기관지폐포세정액 내의 호산구와 림프구 수 측정

세정액을 원심분리하여 상청액을 분리하고 남은 액을 이 용하여 호산구 수와 림프구의 수를 측정하였다. Cytospin (Shandon Cytospin 4, Thermo UK)을 이용하여 slide glass 위의 5 mm의 직경을 갖는 원 안에 세포들이 고르게 분포

하도록 한 다음 Wright Giemsa염색을 하였다. 400배의 현 미경 하에서 무작위로 다섯 시야를 선정하여 호산구와 림프 구의 수를 세고 평균을 내어 비세정액 및 기관지폐포세정 액 내의 한 시야당 평균 호산구 및 림프구 수를 구하였다.

Trichrome 염색

상피하 조직의 섬유화 정도를 관찰하기 위하여 비강 조직 과 폐 조직의 슬라이드에서 trichrome 염색을 시행하였다.

면역조직화학염색

비강과 폐 조직 절편을 탈파라핀화한 다음 비특이적 반 응을 억제하기 위하여 3% H2O2와 10% FBS를 첨가한 후 각 각 rabbit anti-mouse MMP-9 또는 rabbit anti-mouse TIMP-1 항체(Santa Cruz, San Diego, CA)를 1：200으로 희석하여 4℃에서 반응시켰다. 이후 biotinylated anti-rabbit antibody와 streptavidin HRP(DAKO, LSAB kit)를 각각 약 1시간과 30분 동안 반응시켰다. 이어 3,3-diaminobenzi- dine tetrahydrochloride 용액에 의한 발색반응을 거친 후 hematoxylin으로 counterstain하였다.

통계분석

통계학적 검증을 위해 SPSS for window version 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL)을 이용하였다. ELISA 측정값의 세

군간의 검정에는 One way ANOVA와 Scheffe post-hoc test 를 이용하였으며, 유의수준은 각각 5% 이하로 하였다.

결 과

알레르기 유발 확인

A, B, C군의 알레르기 증상점수는 각각 49.6±6.8, 195.3

±13.1, 226.6±24.9으로 B, C군 모두 대조군인 A군보다 유의하게 증상점수가 높았다(p=0, 0)(Fig. 2).

A, B, C군의 혈액 내 OVA-specific IgE의 농도는 각각 12.8±2.3 pg/ml, 77.1±5.8 pg/ml, 80.8±11.3 pg/ml이 었다. B군과 C군은 A군보다 유의한 증가를 보였으나(p=0, 0), B군과 C군 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었다 (Fig. 2).

비세정액 내의 호산구와 림프구

A, B, C군의 비세정액 내 호산구 수는 각각 0.1±0.3, 4

±2.1, 4.8±1.9로, A군에 비해 B군과 C군에서 유의한 증 가를 보였으나(p=0, 0), B군과 C군 사이에는 유의한 차이 가 없었다. 림프구 수는 각각 0.3±0.6, 1±1.3, 5.2±2.1이 었으며, A군과 B군에 비해 C군에서 유의한 증가를 보였다 (p=0, 0)(Fig. 3).

Fig. 2. Allergic symptom score (A) and the concentration of OVA-specific Ig E (B). A：The symptom scores of group B and C were higher than that of con- trol group. The symptom score of group C was higher than that of group B.

B：The concentration of group B and C was significantly higher than that of

control group. *：p<0.05 versus the control group †：p<0.05 versus the group B (5weeks OVA)

*†

0 25 75 100 125 150 175200 225 250

Symptom score

Control OVA 5w OVA 10w

*

50

Ig E (ng/ml)

0 20 40 60 80 100

* *

Control OVA 5w OVA 10w

B A

Fig. 3. The number of eosinophil (A) and lymphocyte (B) in nasal lavage fluid (NLF) and BALF. A：The number of eosinophil of group B and C was higher than that of controls in NLF and BALF. B：The number of lymphocyte of group C was higher than that of group A and B in NLF. The number of lymphocyte of group B and C was higher than that of group A in BALF.

BALF

Number/HPF (×400)

0 2 4 6 8 10 12

*

*

*

*

Number/HPF (×400)

0 10 20 30 40 50

*

*

*†

*：p<0.05 versus the control group †：p<0.05 versus the group B (5weeks OVA)

B A

1 Control

2 OVA 5w

3 OVA 10w

1 Control

2 OVA 5w

3 OVA 10w 0

0

NLF NLF BALF

기관지폐포세정액 내의 호산구와 림프구

A, B, C군의 기관지폐포세정액 내 호산구 수는 각각 0.2

±0.4, 7.2±2.3, 8.8±2.6로, A군에 비해 B군과 C군에서 유의한 증가를 보였다(p=0, 0). 림프구 수 역시 각각 0.4±

0.6, 15.2±6.3, 25.5±18.9로 A군에 비해 B군과 C군에서 유의한 증가를 보였다(p=0.038, 0)(Fig. 3).

비세정액내의 Cytokine 농도

A, B, C군의 IL-5 농도는 각각 32.5±2.7 pg/ml, 46.9

±7.5 pg/ml, 56.9±7.8 pg/ml이었다. A군에 비해 B군과 C군에서 유의한 증가를 보였으며(p=0, 0), B군에 비해 C 군에서 유의한 증가를 보였다(p=0.011)(Fig. 4).

A, B, C군에서 IL-13의 농도는 각각 20.6±0.7 pg/ml, 27.8±1.8 pg/ml, 33.2±3.6 pg/ml이었다. A군에 비해 B 군과 C군에서 유의한 증가를 보였으며(p=0.001, 0), B군에 비해 C군에서 유의한 증가를 보였다(p=0.011)(Fig. 4).

A, B, C군에서 TGF-β의 농도는 각각 776.9±16.1 pg/ml, 795.2±67.1 pg/ml, 993.49±79.8 pg/ml이었다. C군에서 A군과 B군에 비해 유의한 증가를 보였다(p=0, 0)(Fig. 4).

A, B, C군의 INF-γ농도는 각각 20.6±0.7 pg/ml, 27.8

±1.8 pg/ml, 33.2±3.6 pg/ml이었다. A군에 비해 B군과 C군에서 증가되긴 하였으나 통계적으로 유의한 차이는 없 었다(Fig. 4).

기관지폐포세정액 내의 Cytokine 농도

A, B, C군에서 IL-5의 농도는 각각 96.94±8.3 pg/ml, 149.9±8.9 pg/ml, 198.8±44.72 pg/ml이었다. A군에 비 해 B군과 C군에서 유의한 증가를 보였으며(p=0.003, 0), B 군과 C군 사이에도 유의한 차이를 보였다(p=0.001)(Fig. 4).

A, B, C군의 IL-13농도는 각각 21.1±1.9 pg/ml, 31.8±

4.1 pg/ml, 36.1±4.5 pg/ml이었다. A군에 비해 B군과 C 군에서 유의한 증가를 보였으나(p=0.001, 0), B군과 C군 사이의 유의한 통계적 차이는 없었다(Fig. 4).

A, B, C군의 TGF-β 농도는 각각 1757.1±146.1 pg/ml, 2007.1±231.9 pg/ml, 2276.1±217.7 pg/ml이었다. A군에 비해 B군과 C군에서 유의한 증가를 보였으며(p=0.047, 0), B군에 비해 C군에서 유의한 증가를 보였다(p=0.03)(Fig. 4).

A, B, C군의 INF-γ 농도는 각각 21.1±1.9 pg/ml, 31.9

±4.2 pg/ml, 36.1±4.5 pg/ml이었다. A군에 비해 B군과 C 군에서 유의한 증가를 보였으나(p=0, 0), B군과 C군 사이 의 유의한 통계적 차이는 없었다(Fig. 4).

Trichrome 염색 결과

비중격 점막에서 상피하 섬유화 정도는 대조군에 비해 실 험군에서 증가하였으며 이러한 현상은 5주군보다 10주군에 서 좀 더 뚜렷하게 관찰할 수 있었다.

폐 조직에서도 peribronchial area를 관찰한 결과 상피하 섬유화 정도는 대조군에 비해 실험군에서 증가하였으며 이

Fig. 4. The concentration of IL-5, 13, TGF-β, IFN-γ in nasal lavage fluid (NLF) and BALF. A：The concentration of IL- 5 in group B and C was higher than that of group A in NLF. The concentra- tion of IL-5 in group C was higher than that of group A and B in BALF. The concentration of IL-5 in group B was higher than that of group A in BALF.

B：The concentration of IL-13 in group B and C was higher than that of group A in NLF. The concentration of IL-13 in group B and C was higher than that of group A in BALF. C：The concentra- tion of TGF-β in group C was higher than that of group A and B in NLF.

The concentration of TGF-β in group C was higher than that of group A and B. The concentration of TGF-β in group B was higher than that of group A in BALF. D：The concentra- tion of IFN-γ was not statistically dif- ferent between groups in NLF. The con- centration of IFN-γ in group B and C was higher than that of group A in BALF.

0 500 1000 1500 2000 2500

20 40 60 80 100

0

BALF

*：p<0.05 versus the control group †：p<0.05 versus the group B (5weeks OVA) 0 0

IL-5 (pg/ml)

1 Control

2 OVA 5w

3 OVA 10w

*

*†

*

*^†

1 Control

3 OVA 10w 0

10 20 30 40 50

0 50 100 150 200 250 300

0 0 2

OVA 5w

*

* * *

* *

*

*†

*^†

IL-13 (pg/ml)

1 Control

2 OVA 5w

3 OVA 10w

1 Control

3 OVA 10w 2

OVA 5w

IFN-γ(pg/ml)

TGF-β (pg/ml)

NLF

러한 현상은 5주군보다. 10주군에서 좀 더 뚜렷하게 관찰할 수 있었다.

면역조직화학염색

MMP-9

비중격 점막에서 MMP-9의 발현은 점막하 조직에서 대조

군에 비해 실험군에서 크게 증가하지 않았다.

폐 조직에서는 기관지 주위에서 MMP-9의 발현이 대조군 에 비해서 실험군에서 다소 증가되었으며 5주군보다 10주 군에서 발현이 더욱 증가되어 있었다.

TIMP-1

비중격 점막에서 TIMP-1의 발현은 점막하 조직에서 대

Fig. 5. Micrographs of nasal septum (A) and lung tissue (B) stained by Mas- son trichrome. Repetitive OVA expo- sure for 5 weeks and 10 weeks induc- ed subepithelial fibrosis in lung and nasal mucosa (×400).

A

B

Control OVA 5w OVA 10w

Fig. 6. Immunohistochemical staining of MMP-9 and TIMP-1 in the nasal septum (A), (B) and lung tissue (C), (D). Repetitive OVA exposure for 5 weeks and 10 weeks induced increased MMP-9 and TIMP-1 expression com- pared with control group in lung. Ho- wever, the expression of MMP-9 and TIMP-1 in the nasal mucosa was not different between groups (×400).

A

B

C

D

Control OVA 5w OVA 10w

조군에 비해 실험군에서 크게 증가하지 않았다.

폐 조직에서는 기관지 주위에서 TIMP-1의 발현이 대조 군에 비해서 실험군에서 다소 증가되었으며 5주군에서보다 10주군에서 발현이 더욱 증가되어 있었다.

고 찰

기관지 천식은 호산구, 림프구, 비만세포와 같은 여러 종 류의 염증세포와 이들에서 분비되는 다양한 cytokine, che- mokine, 접착분자들이 관여된 만성 염증성 질환이다.⁸⁾ 기 관지 천식에서는 이러한 염증반응으로 섬유아세포의 증식이 유발되고 기관지의 상피하 조직의 섬유화 및 콜라겐과 세 포외 기질의 침착이 발생한다. 이로 인해 기도의 벽이 두 꺼워지는 것을 소위‘기도재형성’이라고 한다. 기도재형성 은 결국 기관지 과민반응을 유발하는 원인이 되고 결국 기 관지의 기능을 상실하게 한다.⁹⁾

최근에 소위‘unified airway ’ 개념에 의하면 알레르기 비염은 기관지 천식과 같은 질환의 유사한 임상적 형태로 받아들여지고 있다.¹⁰⁾ 상기도는 하기도와 비슷한 상피조직 을 가지고 있으며 여러 가지 자극에 대해 유사한 염증 반 응을 일으킨다.¹⁾ 따라서 비강 내에서도 알레르기 항원에 의한 반응으로 기관지에서와 같은 기도재형성 과정이 일어 날 것으로 생각되며, 본 연구에서는 동물 실험을 통해 이 를 확인하고자 하였다.

기관지 천식 환자의 기관지폐포세정액에서 IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 등 다양한 사이토카인이 증가되어 있음이 잘 알려져 있다. 이러한 염증 조절 인자들은 호산구 등 염증 세포의 숫자를 증가시켜 기관지의 과민성을 가중시키고, 점액 분비를 증가시킨다. 특히 IL-5와 IL-13은 염증반응 이외에 상피 세포의 비후와 상피하 조직의 섬유화를 촉진 하는 것으로 알려져 있다.¹¹⁾

본 연구에서는 비세정액과 기관지폐포세정액에서 대조군 에 비해 실험군에서 IL-5와 IL-13의 유의한 증가를 확인 하였다. 그리고 IL-13은 5주 노출군(B군)과 10주 노출군(C 군) 사이에 유의한 차이를 보이지 않은 반면 IL-5는 10주 노출군에서 유의한 증가를 보였다. 따라서 IL-5와 IL-13 모두 반복적인 항원 노출시 기도재형성 과정에 관여하며 이 중 IL-5가 더욱 큰 역할을 할 것으로 생각한다.

TGF-β는 대식세포, 섬유아세포, 상피세포, 호산구 등 에서 생산, 분비되는 사이토카인으로, 조직의 섬유화 과정 에 관여하며, 세포외 기질의 분해와 합성과정을 매개하는 것으로 알려져 있다. Duvernelle 등¹²⁾은 기관지 천식환자의 기관지폐포세정액 내에서 TGF-β의 농도가 증가되어 있

으며 항원에 노출되어 염증 반응이 진행됨에 따라 그 농도가 더욱 증가함을 관찰하였으며, 생체 외 실험에서도 TGF-β 가 섬유아세포의 증식과 기질 단백 합성을 촉진시킴으로써 상피하 조직의 섬유화를 촉진시켜 천식환자에서 기도의 재 형성을 유도할 것이라고 하였다.

본 연구에서도 10주 노출군에서 대조군과 5주 노출군에 비해 비세정액과 기관지폐포세정액 내의 TGF-β가 유의 하게 높았다. 따라서 TGF-β가 중요한 염증반응 조절인자 로써 기관지 천식뿐만 아니라 알레르기 비염에서도 기도재 형성 과정에 관여함이 간접적으로 증명되었다.

INF-γ는 IgE 증식을 억제하고 호산구 활동을 방해하여 알레르기 염증반응을 감소시키는 역할을 하는 것으로 알려 져 있다. Zhang 등¹³⁾에 의하면 알레르기 염증 반응을 유도한 마우스 모델에서 INF-γ가 감소함을 발표하였고, Robinson 등¹⁴⁾에 의하면 기관지 천식환자의 BALF에서 INF-γ가 증 가하지 않았다고 하였다. 또 Hessel 등¹⁵⁾은 항 INF-γ 항 체가 알레르기 염증반응과 호산구의 활동에 영향을 주지 못 한다고 주장하였고, Coyle 등¹⁶⁾은 INF-γ receptor가 없는 마우스를 이용한 천식 모델에서 호산구 활동에 변화가 없 다고 보고하였다.

본 연구에서는 실험군과 대조군 사이에 비세정액 내의 INF-γ는 정량적 차이를 보이지 않았으나, 기관지폐포세 정액에서는 대조군에 비해 실험군에서 유의한 증가를 보였 다. 따라서 기도에서 INF-γ가 알레르기 염증반응에 어떠 한 역할을 하는지 그리고 기도재형성에 어떤 영향을 미치 는지에 더욱 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Masson trichrome 염색으로 기도의 세포외 기질에 결체 조직의 침착이 되었는지를 알 수 있으며, 콜라겐 아형에 대 한 항체를 사용하면 기도에 침착된 결체조직의 아형에 대 한 특징을 좀더 명료하게 알 수 있다.¹⁷⁾

본 연구에서 상피하 조직의 섬유화를 확인하기 위해 Masson trichrome 염색을 시행한 결과 비강 점막과 폐 조직 모두 대조군에 비해 실험군에서 상피하 섬유화의 발현이 증가하 였으며, 5주 노출군보다 10주 노출군에서 더욱 증가함을 관 찰하여 장기간 항원에 노출시 폐조직 뿐만 아니라 비점막 에서도 기도재형성이 일어남을 확인할 수 있었다.

MMP-9과 TIMP-1이 기질 및 상피하 조직의 재형성 과 정에서 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려져 있는 사실이 다. MMP-9은 주로 조직을 구성하는 세포와 염증세포로부 터 합성되는 효소로서 조직 재형성 과정에서 세포외 기질을 파괴하는 단백분해효소의 일종으로 알려져 있다. 이와는 반 대로 TIMP-1은 MMP-9의 길항제로 MMP-9의 작용을 억 제하는 역할을 한다. Cho 등¹⁸⁾은 천식이 있는 환자를 대상

으로 한 연구에서 기관지폐포세정액 및 객담에서 MMP-9과 TIMP-1이 증가되어 있음을 보고하였으며, 이후 많은 연구 를 통해 MMP-9과 TIMP-1이 천식환자의 기도재형성 과 정에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고 있다. 그러나 알레르기 비염에서도 이들의 발현이 증가되어 있는지는 아 직 잘 알려져 있지 않다.

본 연구에서는 면역조직화학염색을 통해 폐 조직뿐만 아 니라 비점막에서도 MMP-9과 TIMP-1가 발현되는지, 그 리고 장기간 항원에 노출시 그 발현 정도가 증가하는지 알아 보고자 하였다. 그 결과 폐 조직에서는 대조군에 비해 실험 군에서 MMP-9과 TIMP-1의 발현이 증가되었으며 5주 노 출군보다 10주 노출군에서 발현 정도가 더욱 증가함을 관 찰하였다. 이로서 장기간 항원에 노출시 폐 조직에서 기도 재형성이 이루어짐을 관찰할 수 있었다. 반면 비점막에서 는 MMP-9과 TIMP-1의 발현이 대조군에 비해 실험군에 서 크게 증가하지 않았다. 이는 기도재형성의 활성화 정도 가 각 조직에서마다 다르기 때문일 것으로 생각되어진다.

따라서 비강 조직에서도 폐 조직과 마찬가지로 기도재형 성이 이루어지지만 그 변화 정도는 미약할 것으로 생각한다.

결 론

난알부민을 이용하여 마우스 기도 알레르기 모델을 제작 한 후 폐 조직뿐만 아니라 비점막에서도 기도재형성이 일 어나는지 알아보았다.

그 결과 장기간 항원에 노출시 비세정액과 기관지폐포세 정액 내의 염증세포 수와 기도재형성에 관여한다고 알려진 IL-5, IL-13, TGF-β 등의 사이토카인은 증가하였으며, trichrome 염색에서 상피하 섬유조직이 증가함을 관찰하였 고, 폐 조직에서의 MMP-9과 TIMP-1의 발현은 대조군에 비해 실험군에서 증가하였다. 그러나 비점막에서 MMP-9 과 TIMP-1의 발현은 큰 차이를 보이지 않았다.

이와 같은 결과로 장기간 항원에 노출하였을 때 폐 조직 에서와 마찬가지로 비점막에서도 기도재형성이 일어난다고 생각한다. 그러나 비점막에서의 기도재형성은 폐 조직과 비교하여 그 변화 정도가 미약할 것으로 생각한다.

중심 단어：알레르기 비염·기도·기도재형성.

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