혈관

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(1)Original Articles. Korean Circulation J 1998;; 28( (12) ): 1981-1992. 혈관 평활근 세포에 대한 Lovastatin의 항증식작용에 관한 연구 성균관대학교 의과대학 내과학교실 삼성서울병원 심혈관센터 삼성생명과학연구소 임상의학연구센터. 박승우·김덕경·허정은·최윤혁·최윤호·권현철 김준수·이상훈·홍경표·박정의·서정돈·이원로. Antiproliferative Effect of Lovastatin on Vascular Smooth Muscle Cell Seung Woo Park, MD, Duk-Kyung Kim, MD, Jeong-Eun Huh, MS, Yoon-Hyuk Choi, PhD, Yoon-Ho Choi, MD, Hyeon-Cheol Gwon, MD, June Soo Kim, MD, Sang Hoon Lee, MD, Kyung Pyo Hong, MD, Jeong Euy Park, MD, Jung Don Seo, MD and Won Ro Lee, MD Cardiovascular Institute, Samsung Medical Center, Department of Medicine, Sungkyunkwan University School of Medicine, Center for Clinical Research of Samsung Biomedical Research Institute, Seoul, Korea. ABSTRACT Background and Objectives：This study was performed to investigate the antiproliferative effect of lovastatin on vascular smooth muscle cell, especially to determine whether lovastatin induces apoptosis in vascular smooth muscle cell and the products of mevalonate pathway can reverse the antiproliferative effect of lovastatin. Materials and Method：Lovastatin only and lovastatin with one of the products of mevalonate pathway such as isopentenyl adenine, farnesol, mevalonate, cholesterol were added respectively in cultured rat vascular smooth muscle cells stimulated with 10% fetal calf serum. DNA synthesis was measured by tritiated-thymidine incorporation. Cell number was determined by hemocytometric counting. Cells were Giemsa-stained to evaluate morphological changes of apoptosis. Extracted DNA from the cells treated with lovastatin was assessed by gel electrophoresis. Results：1) Lovastatin inhibited DNA synthesis and cell proliferation in a dose-dependent manner. 2) The inhibitory effects of lovastatin could be reversed almost completely by mevalonate, partially by farnesol. 3) Lovastatin-treated vascular smooth muscle cells showed typical morphological changes of apoptosis. 4) A distinct ladder of DNA bands was visualized by gel electrophoresis of the DNA from the cells treated with lovastatin. Conclusion：Mevalonate metabolism is essential for vascular smooth muscle cell proliferation. The antiproliferative effect of lovastatin may result from the induction of apoptosis in vascular smooth muscle cells. (Korean Circulation J 1998;28( (12) ):1981-1992) ) KEY WORDS：Lovastatin·Vascular smooth muscle cell·Mevalonate pathway ・ Apoptosis.. 서. 론. 한 치료법의 하나이다. 그러나 관동맥성형술 후 재협착 의 빈도가 높아 허혈성 심질환의 치료효과를 떨어뜨리. 경피적 관동맥성형술은 관동맥 협착증의 가장 중요. 는 중요한 원인이 되고 있고, 더우기 이에 대한 대책은 아. 논문접수일：1998년 10월 12일 심사완료일：1999년 2월 5일 교신저자：김덕경, 135-710 서울 강남구 일원동 50번지 성균관대학교 의과대학 내과학교실 삼성서울병원 심혈관센터 삼성생명과학연구소 임상의학연구센터 전화：(02) 3410-3419・전송：(02) 3410-3417 E-mail：[email protected]. 1981.

(2) 직까지 확실히 알려진 바가 없다. 이러한 재협착의 원인. 약제들은 cholesterol뿐만 아니라 위에 기술한 다른 여러. 으로는 혈관 평활근 세포의 비정상적인 증식이 가장 큰. 대사산물의 생합성도 억제하게 되는데, 최근에는 이 약제. 1-3). 혈관 평활근 세포의 증식은 혈. 들이 mevalonate 경로의 중간 대사산물인 isopentenyl-. 관 손상에 대한 조직 치유 반응의 일부로 나타나는데, 동. pyrophosphate, farnesyl-pyrophosphate 등의 생성을. 물실험 결과, 혈관벽의 손상은 곧바로 평활근 세포의 증식. 차단하여, 세포증식 신호전달체계에 중요한 p21 ras,16-18). 원인으로 알려져 있다.. 4-6). 그리고 평활근 세포의. G-protein의 r-subunit19-21)과 lamin B22) 등의 isop-. 증식은 정상적인 조건 하에서는 손상후 수주 내에 세포 증. renylation을 방해하고, 그 결과 이들 단백질이 세포의 형. 7-9). 질막과 결합하는 것을 억제할 수 있는 것으로 밝혀짐에 따. 을 유발하는 것으로 알려져 있다.. 식이 감소되어 기저치에 도달하는 것으로 알려져 있다.. 경피적 관동맥성형술 후에도 이러한 조직 치유 반응. 라 더욱 더 이 약제들에 대한 관심이 고조되고 있다.. 의 일환으로 평활근 세포가 증식하리라 생각되는데, 상당. 이와 같은 이유로 lovastatin이 세포주기에 영향을 끼. 수의 환자에서 정상적인 조건에서와는 달리 세포 증식이. 칠 수 있음이 예측되며, 실제로 최근 수년 동안의 여러 연. 과다하게 일어나며, 이렇게 과다하게 증식된 평활근 세포. 구들에서 lovastatin에 의해 여러 종류의 세포주에서 DNA. 는 새로 형성된 섬유성 기질과 함께, 경피적 관동맥성형. 복제 및 세포증식이 억제됨이 관찰되었고,23-25) 또한 이러. 술 후 재협착의 중요한 원인으로 간주되고 있다. 따라서. 한 현상들은 mevalonate를 추가함으로써 회복되어 lov-. 경피적 관동맥성형술 후 이러한 평활근 세포의 증식을 억. astatin의 이러한 효과가 mevalonate pathway의 산물. 제할 수 있으면 재협착을 어느 정도 막을 수 있으리라 생. 들의 합성장애에 의한 것임을 알게 되었다. 더우기 최근. 각되며, 이를 위한 여러가지 약제들이 시도되고 있으나. 에 lovastatin은 몇 종류의 세포주에서 apoptosis를 유발. 아직까지 효과가 증명된 것은 없다.. 하는 것으로 알려져 있다.26)27). 그런데 이전의 in vitro 실험에서, 사람의 섬유아세포, 림. 이러한 in vitro 실험과 더불어 생체실험으로는 토끼의. 프구, 혈관 평활근 세포, 신장의 mesangial cell 등의 성. 대퇴동맥에서 풍선을 이용한 혈관내피손상후 진행되는 동. 장과 분화에 mevalonate가 반드시 필요한 것으로 알려. 맥경화를 lovastatin에 의해 약화시킬 수 있었고, 그 이. 10-12). 져 있어,. mevalonate pathway를 억제하면 혈관 평. 유가 단순히 cholesterol을 낮추는 것 뿐만이 아니라는. 활근 세포의 증식도 억제되리라 기대되는데, 아직까지 이. 것이 시사되었다.28) 토끼의 경동맥을 이용한 실험에서는. 에 대한 연구는 미흡한 실정이다.. HMG-CoA reductase의 길항제에 의해서 내막증식이. Mevalonate pathway는 cholesterol 생합성 과정의 첫. 억제된다는 보고가 있으나,29) 사람에서 경피적 관동맥성. 단계로서 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme. 형술후 lovastatin을 투여한 연구들은 그 결과가 일치하. A(HMG-CoA) reductase에 의하여 HMG-CoA로부. 지 않고 있는데, Sahni등은 lovastatin이 경피적 관동맥성. 터 mevalonate가 되는 과정인데, 이 과정이 cholest-. 형술 후 재협착 예방에 효과가 있음을 보고하였고,30) We-. erol 생합성의 속도조절 단계로서 매우 중요하다.13) 이 과. intraub등은 재협착을 막지 못한다고 보고하였다.31). 정에서는 세포막의 중요 지질 성분인 cholesterol 외에. 그런데 이러한 인체실험들은 lovastatin을 이용하여. 도 일부 tRNA에 존재하는 isopentenyl adenine, 미토콘. cholesterol 수치를 떨어뜨림으로써 관동맥의 재협착을. 드리아에서 전자의 전달에 관여하는 ubiquinone과 ha-. 막고자 하는 것을 목적으로 하였으므로, lovastatin의 평. em-A, 그리고 단백질의 질소연결당화에 필수적인 doli-. 활근 세포 증식억제에 관해서는 생각하지 않았다. 실제로. chol 등 여러가지 중요한 산물들이 생성된다. HMG-CoA. in vitro 실험에서 일반적으로 다른 종류의 세포증식을 억. reductase 효소의 경쟁적 길항제로는 Penicillium citrin-. 제하는데 필요한 lovastatin의 농도는 고지혈증 환자에서. um의 대사물로부터 분리되어 1976년 처음 보고된 me-. cholesterol 수치를 떨어뜨리는 용량에 비해 월등히 높. 14). vastatin,. 그리고 그 이후 Aspergillus terreus에서 분 15). 기 때문에, 기존의 연구 결과들로는 관동맥성형술 후 lo-. 리한 lovastatin 과 그 이외에 반합성약제로 simvast-. vastatin에 의한 혈관 평활근 세포의 증식 억제효과를 확. atin, pravastatin 등이 존재하며, 이러한 약제들은 mev-. 실히 규명할 수 없었다. 따라서 본 실험에서는 lovastatin. alonate pathway의 차단작용을 하게 되어 최근 hype-. 의 농도를 조정하여 혈관 평활근 세포에 대한 억제효과. rcholesterolemia 환자의 치료에 널리 사용되고 있다. 이. 를 명확히 밝히고자 하였다. 즉, lovastatin이 평활근 세. 1982. Korean Circulation J 1998;28(12):1981-1992.

(3) 포의 증식을 억제하는가를 검증하고, 이 약제에 의한 항. 혈관 평활근 세포는 37℃ humidified 5% CO2/95% air 환경에서 키우며 18～24시간 후 첫 배양액을 교환. 증식효과의 발생기전을 밝히고자 하였다.. 하여 주고 그 후로는 48～72시간 간격으로 배양액을 교환. 재료 및 방법. 하여 주었다. 배양된 세포가 혈관 평활근 세포임을 확인하 기 위하여 면역조직학적인 방법으로 α-smooth muscle. 재 료. actin에 대한 항체를 이용하여 배양된 세포가 항체반응 에 양성임을 확인하였다. 세포들을 1：3～1：5의 비율로 passage 후 passage 5～10의 세포를 실험에 사용하였는. 시 약 Lovastatin은 미국의 Merck사 제품을 사용하였고,. 데, 세포들이 confluence 상태에 도달하면 defined se-. α-smooth muscle actin 항체, mevalonic acid lactone,. rum-free media(DSF；DMEF/F12 containing insulin. cholesterol, isopentenyl adenine(IPA), isoprenoid fa-. 5×10-7 M, transferrin(5 mg/ml), ascorbic acid 0.2. rnesol은 미국의 Sigma사 제품을 사용하였으며, methyl-. mM)로 배양액을 교환한 후 48～72시간 배양하여 휴. 3. H-thymidine은 미국의 New England Nuclear 회사. 지기 상태로 만들어서 실험에 사용하였다. 이러한 상태에. 제품을 이용하였다. 그리고 세포배양에 필요한 배지와 항. 서 혈관 평활근 세포는 quiescent, noncatabolic, differ-. 생제, phosphate buffered saline, fetal bovine serum. entiated 상태를 유지하며 혈관 평활근 세포에 특이한 단. 등은 미국의 Gibco-BRL사 제품을 사용하였다.. 백질을 발현하는 것으로 알려져 있다.32). 혈관 평활근 세포. Lovastatin 약제의 활성화. 혈관 평활근 세포는 백서의 대동맥으로부터 혈관 평활. Lovastatin 그 자체는 lactone ring이 있는 prodrug으. 근 세포를 분리하여 이를 배양하여 사용하였다. 태어난지. 로 활성이 없으므로 다음과 같은 방법으로 lactone ring을. 약 12주 된 웅성백서(Sprague-Dawley male rat, 300. 가수분해하여 활성화된 acidic metabolite로 만들었다.33). ～350 g)로부터 흉부대동맥을 떼어내어, 혈관주위의 느. 52 mg의 lovastatin을 취하여 1.04 ml의 95% ethanol. 슨한 결체조직을 제거한 후 enzyme dissociation mixt-. 에 녹인 후 813 ul의 1 N NaOH를 첨가하고 50℃에서. ure(DMEF/F12, 1 mg/ml type 2 collagenase, 0.25. 두 시간 incubation하였다. 그 다음 1 N HCl로 pH를 7.2. mg/ml elastase, 1 mg/ml soybean trypsin inhibitor,. 로 조정한 후 증류수로 최종용적을 13 ml로 만들면 10. 2 mg/ml bovine serum albumin)에 담아 37℃에서 10분. mM의 용액이 되는데 사용시까지 -20℃에 보관하였다.. 간 반응시킴으로써 혈관내벽세포를 제거하고 adventitia. 방 법. 와 media의 분리를 용이하게 하였다. 그리고 dissecting microspcopy 하에서 미세 forceps 을 이용하여 adventitia를 박리한 후 media를 2～3 mm. Lovastatin은 평활근 세포의 증식을 억제하는가?. 의 크기로 잘게 자른 후, media tissue를 다시 enzyme. 백서의 평활근 세포를 배양하여 휴지기(quiescence). dissociation mixture에 담아 진탕기(gyratory shaker). 상태로 만든 후 세포증식(mitogenesis)을 유도하기 위. 내에 넣고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 혈관 평활근 세. 하여 10% fetal bovine serum으로 자극하였다. Lova-. 포가 분리되어 enzyme dissociation mixture가 혼탁해지. statin이 세포증식에 미치는 영향을 세포수 측정법과, 세. 면 fetal bovine serum을 최종농도가 20% 되도록 첨. 포내의 DNA 합성정도를 반영하는 radiolabeled thy-. 가하여 enzyme을 비활성화시킨 후 소독된 gauze로 걸. midine 결합검사를 이용하여 연구하였다.. 러 digestion되지 않은 찌꺼기를 제거하였다. 200 g에 서 5분간 원심분리 후 세포배양액(DMEF/F12 with 10% FBS, 100 mg/ml penicillin, 0.1 mg/ml streptomycin) 2. 3. Lovastatin의 평활근 세포 항증식작용 기전은? Lovastatin의 항증식작용이 mevalonate pathway 차. 에 재부유시켜 25 cm 세포배양 flask에 2-5×10 세. 단작용에 의한 것인지 알아보기 위하여 외부투여 meval-. 포/cm2의 농도로 plating하였다.. onate에 의하여 항증식작용이 역전되는지 관찰하고, 만약 1983.

(4) mevalonate pathway가 관여하는 것이 입증되면 meva-. (Ecolite TM(+), ICN)을 첨가하여 섞은 후 β-counter. lonate pathway의 최종생성물들인 cholesterol, isopen-. (Beckmann)로 정량하여 DNA의 합성정도를 분석하였다.. tenyl adenine, isoprenoid farnesol을 외부투여하여 항 증식작용이 어느 대사산물에 의하여 매개되는지를 관찰 하였다. 항증식능에 대한 검사는 thymidine 결합검사를 이용하여 실험하였다.. Apoptosis의 확인 검사 조직배양판에서 배양된 세포에 lovastatin을 농도를 각 각 1 uM, 3 uM, 10 uM, 30 uM로 달리하여 첨가하였다. 확실한 apoptosis의 형태학적 소견을 확인하기 위하여. Lovastatin은 혈관 평활근 세포의 apoptosis를 유발하는가?. 이중 lovastatin 30 uM을 첨가한 세포주를 택해 48시. Lovastatin 투여 후 Giemsa stain을 통해 apoptosis의. 간후 Giemsa stain을 하여 광학현미경으로 apoptosis. 특징적인 형태를 광학현미경으로 관찰하고, 전자현미경 및. 의 형태학적 특징이 나타나는가를 관찰하고자 하였고 전. DNA ladder assay를 이용하여 apoptosis가 일어났는. 자현미경 사진을 찍어 apoptosis때 나타나는 세포내의 변. 지를 확인하였다.. 화가 나타나는가를 확인하고자 하였다. 그리고 lovastatin이 서로 다른 농도로 첨가된 각각 의 세포주에서 세포배양액을 취하여 원심분리를 통해 세. 세포수 측정에 의한 항세포증식능 검사 항세포증식능의 측정은 hemocytometer를 이용하여. 포를 모으고, genomic DNA를 분리하기 위하여, 세포의. 생존세포 수를 직접 측정하는 방법을 이용하였는데, he-. pellet에 lysis buffer(0.5% SDS, 0.1 M NaCl, 0.05 M. mocytometer를 이용하여 측정하는 방법은 우선 5000/. Tris, 4 mM EDTA, 400 ug/ml proteinase K)를 넣고. ml의 세포를 24-well 조직배양판에 1 ml씩 분주한 후,. 55℃에서 4시간 동안 digestion시켰다. Phenol：chro-. lovastatin의 농도를 각각 1 uM, 3 uM, 10 uM, 30 uM. loform：isoamyl-alcohol(25：24：1, GIBCO B-RL). 로 변화하여 첨가하고 48시간 내지 72시간동안 배양시. 을 사용하여 원심 분리시켰고, ethanol로 침전시켜 DNA. 킨 후, phosphate buffered saline으로 두 번 세척한 다. 를 분리하였다.. 음 trypsin-EDTA를 이용하여 세포를 부유시켰다. Fetal. RNA를 제거하기 위하여 ribonuclease A(1 mg/ml,. bovine serum으로 trypsin을 중화시킨 후, isoton으로. Sigma)를 1시간동안 처리하여 순수한 DNA를 얻었고. 희석한 다음 hemocytometer로 살아있는 세포의 수를 측. 260 nm의 파장에서 DNA의 농도를 정량하였다. 추출. 정하였다. 살아있는 세포와 죽은 세포의 구별은 0.4% tr-. 한 DNA를 ethdium bromide와 섞은 후 2% agarose. ypan blue 염색을 통하여 염색되지 않는 세포를 살아있. gel에 전기영동하여 dry시켜 X-ray에 12시간 동안 노출. 는 세포로 생각하는 dye exclusion 방법을 사용하였다.. 시킨 후 developing하였다. 15 kb 이하의 low molecular DNA에서 세포고사(apoptotic DNA fragmentation)때 나타나는 특징적인 사다리형태(ladder pattern)의 DNA. Thymidine 결합검사 Thymidine 결합검사법은 세포의 DNA 합성 정도를 정. 파쇄(fragmentation)현상을 확인하고자 하였다.. 량화하는 검사법으로 우선 세포를 96-well round bot-. 결. tom 조직배양판에 well당 20,000개의 세포를 분주하고,. 과. lovastatin 또는 lovastatin과 mevalonate pathway의 다른 생성물을 첨가한 후, 48시간 37℃, 5% CO2 배양기 3. 혈관 평활근 세포의 확인. 에서 배양한다. 0.1 uCi/well의 methyl- H thymidine을. 배양된 세포의 종류를 알기 위하여 alpha smooth mu-. 넣고 4시간 더 배양하여 방사성 동위원소를 표지시켰다.. scle actin에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학방법(im-. 1x Phosphate buffered saline(PBS, pH 7.2)으로 배양. munohistochemistry)으로 혈관 평활근 세포임을 확인. 된 세포를 2회 세척한 후, 10% trichloro acetic acid (TCA,. 하였다(Fig. 1).. Sigma)로 4℃에서 30분간 방치하였다. 95% cold ethanol(Merck)로 2회 세척하여 건조시킨 후, 0.25 N NaOH 로 세포를 용해시켜 모으고 scintilation cocktail solution 1984. 혈관 평활근 세포에 대한 lovastatin의 항증식효과 혈관 평활근 세포에 lovastatin을 첨가한 후 48시간 후 Korean Circulation J 1998;28(12):1981-1992.

(5) 에 4시간 동안의 3H-thymidine의 결합정도를 관찰하 3. 대사산물에 의해 영향받는지를 알아보기 위하여, 혈관 평. 였다(Fig. 2). Lovastatin의 농도가 증가함에 따라 H-. 활근 세포에 10 uM의 lovastatin을 첨가하고, 동시에 me-. thymidine의 결합이 lovastatin의 농도에 비례해서 억제. valonate pathway의 대사산물인 mevalonate, IPA, iso-. 되고, lovastatin의 농도가 10 uM을 넘으면 3H-thymi-. prenoid farnesol, cholesterol을 각각 농도를 달리하여. dine의 결합이 거의 이루어지지 않음을 알 수 있었다. 또. 첨가하고 48시간 후의 thymidine 결합정도를 관찰하였다.. 한 hemocytometer를 이용하여 직접 세포수를 측정한 결과, 첨가된 lovastatin의 농도에 비례하여 혈관 평활근 세포의 수가 줄어들었고, lovastatin을 첨가한 시간이 길 수록 세포의 수는 더욱 급격히 줄어들었다(Fig. 3).. Mevalonate를 첨가한 경우 혈관 평활근 세포에 10 uM lovastatin을 넣고 mevalonate를 각각 25 uM, 100 uM, 400 uM씩 첨가하면 mevalonate의 농도가 증가함에 따라 lovastatin의 효과가. Lovastatin의 혈관 평활근 세포에 대한 항증식효과의 기전. mevalonate에 의해서 거의 상쇄됨을 알 수 있다(Fig. 4).. 혈관 평활근 세포에 대한 lovastatin의 항증식작용이 mevalonate pathway의 억제에 의한 것인가를 확인하고, mevalonate pathway에 의해 생성되는 물질 가운데 어느. IPA를 첨가한 경우 혈관 평활근 세포에 10 uM lovastatin을 넣고 IPA를. Fig. 1. Immunohistochemical characterization of vascular smooth muscle cells with antibody to alpha smooth muscle actin. Intracellular linear brown staining indicates positive alpha smooth muscle actin.. Fig. 2. Effect of lovastatin on 3H-thymidine incorporation in VSMCs stimulated with 10% FBS. Lovastatin inhibited 3H-thymidine incorporation in a dose-dependent manner. At the dose of 10 uM or more, 3H-thymidine incorporation was almost completely inhibited. VSMCs：vascular smooth muscle cells, DSF：cells in defined serum free media, FBS：cells in 10% fetal bovine serum, *：p<0. 05, **：p<0.05 vs. 1 uM, ***：p<0.05 vs. 3 uM. 1985.

(6) 10 uM, 20 uM씩 첨가하였으나 lovastatin의 효과가 IPA. 되었다(Fig. 6).. 에 의해서는 영향을 받지 않았다(Fig. 5). Cholesterol을 첨가한 경우 Farnesol을 첨가한 경우. 혈관 평활근 세포에 10 uM lovastatin을 넣고 chole-. 혈관 평활근 세포에 10 uM lovastatin을 넣고 farn-. sterol을 각각 10 ug, 40 ug, 100 ug씩 첨가했으나 lov-. esol을 각각 5 uM, 10 uM, 20 uM씩 첨가하였을 때 lo-. astatin의 효과가 cholesterol에 의해서는 전혀 상쇄되지. vastatin의 항증식효과가 farnesol에 의해서 약간 상쇄. 않았다(Fig. 7).. Fig. 3. Hemocytometric cell count of VSMCs after treatment with lovastatin. The number of VSMCs was decreased by lovastatin in dose- and timedependent manner. VSMCs：vascular smooth muscle cells, *#：p<0.05 vs. 1 uM, **##：p<0.05 vs. 3 uM. Fig. 4. Effect of mevalonate on 3H-thymidine incorporation in VSMCs stimulated with 10% FBS and lovastatin 10 uM. The antiproliferative effect of lovastatin on VSMCs was reversed by mevalonate. At the dose of 400 uM of mevalonate, the effect of lovastatin on VSMCs was almost completely inhibited. VSMCs：vascular smooth muscle cells, DSF：cells in defined serum free media, FBS： cells in 10% fetal bovine serum, L：lovastatin, M： mevalonate, *：p<0.05 vs. 10 uM L, **：p<0.05 vs. L＋25 uM M, ***：p<0.05 vs. L+100 uM M. Fig. 5. Effect of IPA on 3H-thymidine incorporation in VSMCs stimulated with 10% FBS and lovastatin 10 uM. The IPA did not prevent the antiproliferative effect of lovastatin on VSMCs. VSMCs：vascular smooth muscle cells, DSF：cells in defined serum free media, FBS：cells in 10% fetal bovine serum, L：lovastatin, IPA：isopentenyl adenine, *：p<0.05 vs. FBS. 1986. Korean Circulation J 1998;28(12):1981-1992.

(7) Lovastatin에 의한 혈관 평활근 세포의 apoptosis 유발. 광학현미경소견. 혈관 평활근 세포에서 lovastatin에 의해 apoptosis가. 혈관 평활근 세포에 lovastatin 30 uM을 더한 후 48. 일어나는가를 관찰하기 위하여 Giemsa 염색을 통한 광. 시간 뒤에 Giemsa 염색을 실시하여 세포를 현미경을 통. 학현미경소견, 전자현미경 검사소견을 판독하였고, 최종적. 해 1000배로 관찰한 결과 lovastatin 처리를 하지 않은. 으로 DNA ladder assay를 시행하였다.. 정상 대조군에 비하여 세포 크기가 줄어들고 세포의 핵. Fig. 6. Effect of farnesol on 3H-thymidine incorporation in VSMCs stimulated with 10% FBS and lovastatin 10 uM. The effect of lovastatin was partially reversed with the increase of farnesol dose. VSMCs：vascular smooth muscle cells, DSF：cells in defined serum free media, FBS：cells in 10% fetal bovine serum, L：lovastatin, F：farnesol, *：p<0.05 vs. 10 uM L, **：p<0.05 vs. L＋5 uM F, ***：p<0.05 vs. L＋10 uM F. Fig. 7. Effect of cholesterol on 3H-thymidine incorporation in VSMCs stimulated with 10% FBS and lovastatin 10 uM. The cholesterol did not prevent the antiproliferative effect of lovastatin on VSMCs. VSMCs：vascular smooth muscle cells, DSF：cells in defined serum free media, FBS：cells in 10% fetal bovine serum, L：lovastatin, C：cholesterol, *：p<0.05 vs. FBS. Fig. 8. Light microscopic findings of the Giemsa-stained vascular smooth muscle cells treated with lovastatin. The cell indicated by arrow head shows shrinkage of cell size, nuclear fragmentation and chromatin condensation which are characteristic findings of apoptosis.. 1987.

(8) 이 분절되며 핵질(chromatin)이 농축되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 8).. DNA ladder assay 혈관 평활근 세포에 lovastatin 1 uM, 3 uM, 10 uM, 30 uM을 각각 더한 후 48시간 뒤에 세포배양액을 취하여. 전자현미경 소견 혈관 평활근 세포에 lovastatin 30 uM을 더한 후 48시간 뒤에 고정하고 5000배로 관찰한 전자현미경 소. 원심분리를 통해 죽은 세포를 얻고, 죽은 세포의 DNA를 추출하여, 전기영동을 시행한 결과 apoptosis의 특징적 소 견인 사다리 형태를 관찰할 수 있었다(Fig. 10).. 견은 세포의 형태가 비교적 유지되면서 정상 세포에 비하. 고. 여 세포내의 소기관(organelle)의 구조가 그대로 유지되. 찰. 어 있고 그 밀도가 높아져 있으며 핵이 나뉘어진 것을 관찰할 수 있었다. 소기관의 밀도가 높아지는 것은 세포. 경피적 관동맥 성형술 후 재협착의 주요기전인 ne-. 의 크기가 줄어듬을 간접적으로 시사하는 소견이다. 또한. ointimal proliferation은 여러가지 growth factor의 복. 핵질이 핵막의 주변부에 모이기 사작하는 것도 관찰하였. 잡한 작용에 의해 혈관 평활근 세포의 이동과 증식을 촉. 다(Fig. 9).. 진함으로써 일어나므로 특별히 하나의 growth factor만. A. B. Fig. 9. Transmission electron microscopic findings of the vascular smooth muscle cells treated with lovastatin. The lovastatintreated cell shows 1)increased number of intracellular organelles with normal structures which means decreased cell volume, 2)nuclear fragmentation, 3)peripheral condensation of chromatin. These are characteristic findings of the apoptotic cell. A：control cell, B：lovastatin-treated cell. Fig. 10. DNA ladder assay of the vascular smooth muscle cells treated with lovastatin by gel electrophoresis. The ladder pattern of DNA by gel electrophoresis is prominent in cells treated with lovastatin of 3uM or more.. 1988. Korean Circulation J 1998;28(12):1981-1992.

(9) 을 억제해서는 재협착을 완전히 예방할 가능성이 많지 않. 다. 성장 조절 단백질인 p21ras는 공유결합한 farnesyl기. 다. 그러므로 직접 혈관 평활근 세포를 목표로 하여 그 증. 에 의해서 세포막에 붙어서 작용을 나타내므로,13) meva-. 식을 억제하는 것이 재협착의 예방에 유망하다 할 수 있. lonate 합성을 막아서 farnesylation을 방해하면 세포의. 는데, 이러한 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하기 위한. 증식이 억제된다.12) 그러므로 farnesyl기를 공급하기 위. 노력이 그동안 많이 있어 왔으나 아직까지 실제 임상에서. 해 farnesol을 투여하면 lovastatin의 효과가 farnesol. 뚜렷한 효과가 인정된 것은 없다. 그런데 mevalonate. 의 용량에 비례해서 감소되는, 즉 farnesol의 농도가 높. pathway는 혈관 평활근 세포를 포함한 여러 세포의 증. 을수록 lovastatin으로 처리했음에도 불구하고 DNA 합. 10)11)13)34). 식에 반드시 필요한 것으로 알려져 있으므로,. 성의 지표인 thymidine의 결합이 증가하는 것이 예상되. 이를 차단하면 혈관 평활근 세포의 증식을 억제할 가능. 는 소견이다. 그런데 본 연구에서는 farnesol만으로는. 성이 있으며, 본 연구에서는 mevalonate pathway의 가. lovastatin의 효과가 부분적으로만 억제되는 것을 관찰하. 장 중요한 효소인 HMG-CoA 환원효소를 억제하는 lo-. 였다. Mevalonate pathway에 의해 생기는 isoprenoid. vastatin을 사용하여 혈관 평활근 세포의 증식이 억제됨. 계통의 화합물에는 IPA, geranylgeraniol, farnesol 등. 을 관찰하였다.. 이 있는데,10)11)13)34) 최종산물에 해당하는 IPA의 경우는. 특히 mevalonate는 세포의 활동에 반드시 필요한 iso-. 전술한 바와 같다. 그러나 Corsini 등에 의하면38) geran-. prenoid 화합물의 전구 물질이므로 lovastatin에 의한 혈. ylgeraniol이, HMG CoA 환원효소 억제재인 fluvastatin. 관 평활근 세포의 증식억제는 cholesterol의 합성억제뿐. 이나 simvastatin에 의한 혈관 평활근 세포의 증식억제. 아니라 이러한 isoprenoid 화합물의 생성장애에 기인한. 효과를 부분적으로만 감소시킬 수 있다고 보고하고 있. 다고 생각할 수 있는데, 본 연구에서도 실질적으로 chol-. 는 바, 같은 isoprenoid 화합물인 farnesol도 이와 유사. esterol에 의해서는 lovastatin의 혈관 평활근 세포에 대. 한 효과를 나타내리라 생각되므로 lovastatin의 효과를. 한 증식억제작용을 막을 수 없었으므로 cholesterol 합. 전부 상쇄시키기는 어려울 것으로 보인다. Mevalonate. 성억제가 세포증식억제작용의 기전은 아니라 생각되며,. 를 투여한 경우에는 lovastatin의 효과가 거의 완전히 상. 35). 이는 Jakobisiak등 의 결과와도 일치하는 소견이다.. 쇄되는 것을 관찰하였는데, 이는 HMG CoA 환원효소. 혈관 평활근 세포에 대한 Lovastatin의 항증식효과의. 에 의해 첫번째로 만들어지는 것이 mevalonate임을 고. 기전을 알아보기 위해 mevalonate pathway의 대사산. 려할 때 당연히 예상되는 결과라 할 수 있고, 다른 실. 물들을 각각 첨가하고 lovastatin에 의한 세포증식 억제. 험27)37)38)에서도 같은 결과를 보였다.. 효과가 변화하는지 살펴보았다. 이중 IPA를 첨가한 경. 생물체는 정상적인 생리, 생화학 상태를 유지하는 것과. 우에는, lovastatin의 항증식효과에 대한 영향이 없었다.. 는 별개로, 형태학적으로도 조직의 비대(hypertrophy),. IPA는 isoprenoid 화합물 가운데 최종산물의 하나로서. 쇠퇴(involution), 위축(atrophy) 사이의 항상성을 유지. 세포증식에 중요한 역할을 할 수 있다. Quesney-Hun-. 하고 있는데, 이러한 형태학적 균형을 유지하기 위해서는. 36). eeus등에 의하면,. IPA는 세포가 S-phase로 들어가. 필연적으로 정상적인 과정으로서의 세포 죽음(cell death). 는데 중요하며, HMG-CoA 환원효소의 억제제인 com-. 이 필요하다. 이러한 정상적인 세포의 죽음은 비정상적. pactin의 효과를 상쇄시킬 수 있는데, 이것은 단지 com-. 혹은 병적인 상태에서의 세포가 죽는 괴사(necrosis)와. pactin과 IPA가 세포주기 가운데 late G1 phase에서 함. 는 조직학적으로 다른 양상을 보이는 바 이를 apoptosis. 께 투여될 때만 나타나고, early G1 phase에 더해지면. 라 한다.39) Lovastatin은 특정 암세포나 다른 세포에서. DNA 합성을 증가시키지 못한다고 하였다. 본 실험에서. 증식억제의 기전으로 apoptosis를 유발한다는 것이 알. 는 IPA에 의해 lovastatin의 효과가 전혀 억제되지 않았. 려져 왔고26)27)40) 최근에 혈관 평활근 세포에 대해서도. 으므로, 이러한 결과로 미루어 휴지기의 혈관 평활근 세. apoptosis를 일으킨다는 보고가 있어41)42) 본 연구에서. 포에 lovastatin을 넣어주면 IPA가 첨가되더라도 DNA. 이를 확인하고자 하였다. 먼저 apoptosis의 광학현미경. 합성을 증가시킬 수 없음을 의미하며 이는 다른 연구들. 적 특징을 관찰하기 위하여 Giemsa 염색법을 이용하여. 12)37). Farnesol을 첨가한 경우에는 lo-. 핵질이 농축되고 핵이 분절되는 소견을 관찰하였고,43). vastatin의 항증식효과가 farnesol에 의해 약간 상쇄되었. 전자현미경으로는 핵질이 농축되고 주변부로 모이며 세. 과 같은 소견이다.. 1989.

(10) 포가 위축되고 동시에 미토콘드리아 등과 같은 세포내 39). 하여 lovastatin의 효과가 줄어드는가를 관찰하였다. 또. 마지. 한 Giemsa 염색법을 통한 광학현미경 소견과 전자현미. 막으로 DNA 파쇄를 관찰하고자 하였다. Apoptosis가. 경 소견, DNA ladder assay를 통하여 apoptosis가 일. 일어나는 세포의 DNA는 endonulease에 의해서 분해. 어났는지 관찰하였다.. 소기관들이 파괴되지 않고 유지됨을 관찰하였다.. 되는데 histone의 보호에 의해서 잘리지 않는 부위가 있 기 때문에 약 200 염기쌍(base-pair)의 배수로 이루어 지는 다양한 길이의 파편으로 나뉘게 된다. 따라서 apop-. 결 과： 1) Lovastatin은 혈관 평활근 세포의 증식을 농도에 비례하여 유의하게 억제하였다.. tosis가 일어난 세포에서 DNA를 취하여 전기영동을 시. 2) HMG-CoA의 대사 산물 가운데, IPA와 choleste-. 키면 소위 사다리 형태가 나타나게 된다. 본 연구에서도. rol은 lovastatin의 효과를 감소시키지 못하였고, farnesol. lovastatin을 처리한 혈관 평활근 세포에서 이를 관찰하. 은 부분적인 감소를, mevalonate는 lovastatin에 의한. 여 apoptosis가 일어났음을 증명하였다.. 증식 억제 효과를 거의 상쇄시켰다.. 이상의 연구결과를 정리하면 lovastatin은 혈관 평활. 3) Lovastatin으로 처리한 세포를 Giemsa 염색법으. 근 세포의 증식을 억제하며, 이는 mevalonate path-. 로 염색하여 농축된 핵질(chromatin)과 분절된 핵을 관. way의 대사산물 가운데 isoprenoid 계통 물질의 합성장. 찰하였다.. 애와 연관이 있음을 시사한다. 또한 cholesterol의 합성. 4) 전자현미경 상에서는 핵질이 농축되고 주변부로 모. 장애와는 무관함을 알 수 있었다. 그리고 이러한 lovas-. 이며 세포가 위축되고 동시에 미토콘드리아 등과 같은. tatin의 작용은 혈관 평활근 세포에서 apoptosis를 유발. 세포내 소기관들이 파괴되지 않고 유지됨을 관찰하였다.. 하는 것과 관계가 있으리라 생각된다. 그러나 본 연구에 서 사용한 lovastatin의 농도는 실제 고지혈증에 경구투 여하는 lovastatin의 농도에 비하여 약 100배정도 높으 37). 므로,. 5) Lovastatin으로 처리한 세포는 DNA ladder assay 결과 양성 반응을 보였다.. 결 론：. 기존에 사용하는 용량의 lovastatin 경구투여에. 이상의 연구로 lovastatin은 혈관 평활근 세포의 증식. 의해서 경피적 관동맥성형술후 혈관 평활근 세포의 증식. 을 억제하며 이는 혈관 평활근 세포에서 apoptosis를 유. 억제를 통한 재협착방지를 위한 노력은 그 성공가능성이. 발함으로써 나타나고, 이러한 lovastatin의 효과는 me-. 떨어진다고 생각되며, 국소적 약물전달요법과 같은 제한된. valonate pathway와 관련 있다고 생각된다.. 범위에 고농도의 약물을 주입하는 치료법이나, 경구투여 의 경우 대량을 사용하는 방법44)을 고려해야 할 것이다.. 요. 중심 단어：Lovastatin・혈관 평활근 세포・Mevalonate pathway・Apoptosis.. 약. 서 론： HMG-CoA 환원효소 억제제인 lovastatin은 동물 재. 이 연구는 삼성생명과학연구소 연구비(C-95-039)의 일부 보조로 이루어졌음.. REFERENCES. 협착 모델에서 근내막증식(myointimal hyperplasia)을. 1) Essed CE, Van den Brand M, Becker AE. Transluminal co-. 막는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 배양된 혈관 평. ronary angioplasty and early restenosis. Fibrocellular occlusion after wall laceration. Br Heart J 1983;49:393-6. 2) Austin GE, Ratliff NB, Hollman J, Tabei S, Phillips DF. Intimal proliferation of smooth muscle cells as an explanation for recurrent coronary artery stenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty. J American Coll Cardiol 1985;6:369-75. 3) Waller BF, Pinkerton CA, Foster LN. Morphologic evidence of accelerated left main coronary artery stenosis: A late complication of percutaneous transluminal balloon angioplasty of the proximal left anterior descending coronary artery. J Am Coll Cardiol 1987;9:1019-23. 4) Ross R, Glomset JA. The pathogenesis of atherosclerosis. 활근 세포의 증식을 억제하고 apoptosis를 유발하는지 여부와 HMG-CoA 대사산물에 의해 lovastatin의 이러 한 작용이 역전되는가를 보고자 하였다.. 재료 및 방법： 배양한 백서의 대동맥 혈관 평활근 세포에 lovastatin을 투여하여 세포의 증식억제 여부를 관찰하고, HMG-CoA 의 대사 산물인 isopentenyl adenine(IPA), farnesol, mevalonate, cholesterol 등을 lovastatin과 함께 투여 1990. Korean Circulation J 1998;28(12):1981-1992.

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