말기심부전

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(1)Original Articles. Korean Circulation J 1998;; 28( (9) ): 1527-1537. 말기심부전 환자의 부전심장에서의 장바이러스와 인형 거대세포바이러스 감염양상 1. 2. 3. 서울대학교 의과대학 내과학교실, 세종병원 내과, 서울대학교 의학연구원 심장연구소. 최성준1,3·김석연1·홍석근2·김효수1,3·오병희1,3. Screening of the Presence of Enterovirus and Cytomegalovirus Infections in Terminally Failing Human Hearts Seong-Choon Choe, MD1,3, Seok-Yeon Kim, MD1, Suk-Keun Hong, MD2, Hyo-Soo Kim MD1,3 and Byung-Hee Oh, MD1,3 1 2. Department of Internal Medicine, Seoul National University College of Medicine, Internal Medicine, Sejong Hospital, 3Heart Research Institute of Seoul National University, Seoul, Korea. ABSTRACT Background：In order to evaluate the prevalence of enterovirus and cytomegalovirus infections to terminally failing hearts, the presence of enteroviral RNA and cytomegaloviral DNA was screened in the explanted hearts of transplantation recipients. Methods：RNA and DNA extractions were performed from explanted failing hearts (N=22) and normal hearts (N=5). Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) of enterovirus and polymerase chain reaction (PCR) of cytomegalovirus were performed. In situ RT-PCR and in situ PCR were performed with positive nucleic acids of viruses. Results：The positivity of enterovirus in failing hearts was 4.4% (1/22) and 0% (0/5) in normal hearts in nested RT-PCR. There was no significant difference in positivity of enteroviral RNA between failing and normal hearts. Nuclei of myocardium was stained in darkviolet color with in situ RT-PCR. The positivity of cytomegalovirus in failing hearts was 45% (10/22) and 40% (2/5) in nested PCR. There was no significant difference in positivity of cytomegaloviral DNA between failing and normal hearts. Nuclei of myocardium was stained in dark-violet color with in situ PCR. Positive chambers of cytomegalovirus were in decreasing tendency according to increasing patient’s age. Conclusion：Enterovirus was very rarely observed in explanted terminally failing hearts and cytomegalovirus was frequently found both in explanted failing hearts and normal. These viruses have little direct causal relationship with the development of heart failure. (Korean Circulation J 1998; 28( (9) ):1527-1537) ) KEY WORDS：Heart failure·Idiopathic dilated cardiomyopathy·Enterovirus·Cytomegalovirus·Polymerase chain reaction.. 논문접수일：1998년 8월 10일 심사완료일：1998년 9월 25일 교신저자：오병희, 110-744 서울 종로구 연건동 28 서울대학교 의과대학 내과학교실 전화：(02) 760-3345・전송：(02) 744-2819 E-mail：[email protected]. 1527.

(2) 장성 심근증에서 거대세포바이러스가 존재하는지를 관찰. 서. 론. 한 연구를 살펴보면, 구미에서도 그리 많지 않으며, 우 리 나라에서도 본 저자들에 의한 연구10) 외에는 없는 실. 말기심부전을 일으키는 심질환은 매우 다양하지만 특. 정이다. 심근염 및 말기심부전에 대한 기여가 높은 것으. 히 심근증은 심부전의 중요한 원인중 하나로 알려져 있. 로 알려진 Coxsackie 바이러스를 포함한 장바이러스는. 다. 심근증은 원인에 따라서 두 가지의 유형으로 나눌 수. 구미에서는 정상인에서 유병률이 높으며, 이 바이러스들. 있는데, 특별한 원인을 찾을 수 없는 특발성 심근증과 원. 은 급성 심근염을 일으킬 수 있으며 이는 확장성 심근증. 인을 알 수 있거나, 다른 장기를 침범한 질환과 연관된. 의 18~50%에서 연관성이 있다고 보고하였다.11) 한편. 1). 이차적 심근증으로 분류한다. 대부분의 경우 특별한 원. 우리 나라에서는 장바이러스의 유병률에 대한 자료가 없. 인을 찾을 수 없으므로, 보통 심근증은 병태생리, 임상. 는 상태로 말기심부전에 대한 기여에 대한 연구도 역시. 상에 따라서 분류한다. 심근증 중에 확장성 심근증은 임. 없는 실정이다.. 상에서 가장 흔하게 관찰되는 질환으로 우리 나라에서는. 현재 우리 나라에서는 1993년 이후 심장이식술이 점. 발병률이 잘 알려져 있지 않으나 미국에서의 통계에 따. 차로 증가하고 있고 따라서 말기심부전환자의 심장이 적. 르면 인구 100만 명당 200명 이상으로 알려져 있다. 최. 출되어 심장조직에서의 바이러스 검출여부를 검사하는. 근에 발생률이 상승하고 있는데 그 이유는 진단방법이 향. 것이 가능하게 되었으며, 심근생검을 통하여 이식후 거. 상되고 심근증에 대한 의사의 인지도가 상승하였기 때. 부반응이나 바이러스의 감염을 알 수 있게 되었다. 본. 문이다.. 연구는 말기심부전 환자에서 적출된 심장조직에서 중합. 특발성 확장성 심근증의 병인론은 여러 가지로 제시되. 효소 연쇄반응법에 의하여 장바이러스 및 인형 거대세포. 고 있고, 심근세포에 대한 여러 가지 세포성, 체액성 면역. 바이러스 핵산의 빈도를 살펴보고자 하였으며, 조직내 중. 에 대한 이상으로 설명하고 있는데, 이 중 자가면역성이. 합효소 연쇄반응법에 의하여 장바이러스 및 인형 거대세. 2). 가장 대두되는 이론이다.. 다음에 주목받는 가설은 바. 포바이러스의 핵산이 존재하는 부위를 밝히고자 하였다.. 이러스에 의한 심근염 후에 심근증이 발생한다는 것인데. 재료 및 방법. Gilbert 등3)은 동물실험과 심근생검으로 증명된 임상연 구에서, 바이러스성 심근염이 소실된 후 특발성 확장성 심근증과 유사한 임상증후군이 발생함을 보고하였다. 이. 대 상. 는 임상적으로 발견되지 않을 정도의 무증상의 바이러. 서울대학교병원과 세종병원에서 1994년 4월부터 19. 스성 심근염도 확장성 심근증으로 진행할 수 있음을 시. 96년 9월까지 시행되었던 총 24례중 22례의 심장이식술. 사하였다. 연구자들의 보고를 종합하면 급성, 만성 또는. 시 적출된 말기심부전 환자의 심장으로부터 좌심실, 좌. 확장성 심근증환자의 심근생검에서 장바이러스(enterov-. 심방, 우심실, 그리고 우심방의 심근조직을 액체질소에 냉. irus)의 RNA를 발견한 경우가 5~50%에 이른다고 하. 동후 영하 70℃의 냉동고에 보관하였다. 또한 심장이식. 였다.4-9) 바이러스성 심근염이후 확장성 심근증의 발생기. 술의 장기 공여자로 예정되었던 뇌사자중 여러 가지 원. 전으로 바이러스가 심근 내에서 일련의 면역반응을 일으. 인으로 심장공여를 하지 못하였던 5례의 정상 심장도 같. 키고, 이러한 면역반응의 결과로 심근이 파괴되어 종국에. 은 방법으로 보관하였다. 말기심부전으로 이식술을 받. 확장성 심근증을 일으키는 것이 제시되고 있다.. 은 환자들은 남자 17명(37±14세), 여자 7명(39±17. 우리 나라에서 바이러스에 의한 질환이 주목을 받는. 세)이었고, 수술당시의 진단은 확장성 심근증 17례(70.. 이유는 바이러스에 의한 감염이 매우 흔하며, 아직 이 분. 8%), 제한성 심근증 2례(8.3%), 허혈성 심근증 2례(8.. 야의 연구가 잘 이루어져 있지 않기 때문이다. 특히 인. 3%), 판막질환 2례(8.3%) 그리고 선천성 심질환의 말. 형 거대세포바이러스(human cytomegalovirus) 및 장. 기 심부전증이 1례(4.3%)였다. 장기공여자로 예정되었. 바이러스처럼 심근염을 유발할 수 있는 바이러스에 대한. 던 정상인의 경우 남자가 3명(평균 17세), 여자가 2명. 역학적 연구는 거의 없는 실정이다. 인형 거대세포 바이. (평균 46세)이었다. 환자의 연령, 진단명, 심초음파에서. 러스가 급성 심근염을 일으킬 수 있는지, 또는 특발성 확. 의 좌심실지표와 구혈률은 Table 1과 같다.. 1528. Korean Circulation J 1998;28(9):1527-1537.

(3) RNA의 분리. -70℃에 보관한다.. 심근조직 100 mg을 1 ml의 Ultraspec TM RNA reagent를 섞어 분쇄한다. 여기서 얻은 균질액을 4℃. RNA의 역전사 과정. 에서 5분간 방치한후 0.2 ml의 chloroform을 추가하여. 25 mM MgCl2 4 μl, 10X RT buffer 2 μl, 10 mM. 15초간 세게 흔든후 5분간 얼음속에 둔다. 이를 12,000. dNTP 2 μl, rRNasin ribonuclease inhibitor 0.5 μl,. g 4℃에서 원심분리한다. 상청액을 조심스럽게 분주하. AMV 역전사효소 15 단위, oligo(dT) 15 primer 0.5. 여 0.5부피의 isopropanol을 넣어 섞는다. 여기에 0.05. μg과 RNA 1 μg을 혼합하여 heating block에서 42℃. 부피의 RNATack TM resin을 넣고 30초간 vortex한. 1시간동안 incubation한다.. 다. 그후 1분간 원침하고 상청액을 버린후 2X 75% 에 탄올을 넣어 30초간 vortex후 30초간 가라앉게 한다.. 장바이러스에 대한 역전사 중합효소 연쇄반응. 여기에 0.1부피의 DEPC water를 넣어 30초간 vortex. Coxsackie B3 바이러스의 5’-noncoding region을. 후 1분간 가라앉게 한다. 상청액을 따서 새 관에 넣어. 검출할 수 있는 primer(E3, E4)를 디자인하여 PCR을. Table 1. Demographic data of study subjects [cardiac transplantation recipients] (No：heart number, IgG：IgG antiCMV, IgM：IgM anti-CMV, TGA：transposition of great arteries, PS：pulmonic stenosis, D-CMP：dilated cardiomyopathy, CMP：cardiomyopathy, R-CMP：restrictive cardiomyopathy, Echo：echocardiographic data, LVEDD：left ventricular end-diastolic di mension, ESD：left ventricular end-systolic dimension, EF：ejection fraction, n：no data) No.. Age. Sex. Diagnosis. Echo (LVEDD/ESD/EF). IgG-CMV. IgM-CMV. 8. 11. M. corrected TGA, PS. n. Positive. Negative. 3. 11. F. D-CMP. 48/45/15. Positive. Negative. 4. 28. M. D-CMP. 69/58/35. Positive. Negative. 5. 28. M. D-CMP. 84/72/27. Positive. Negative. 7. 48. M. D-CMP. 72/65/31. Positive. Negative. 10. 39. M. D-CMP. 64/47/32. Positive. Negative. 11. 23. F. D-CMP. 65/59/17. Positive. Negative. 12. 39. M. D-CMP. 78/71/17. Positive. Negative. 13. 54. F. D-CMP. n. Positive. Negative. 16. 46. F. D-CMP. 67/57/28. Positive. Negative. 17. 60. M. D-CMP. 82/74/20. Positive. Negative. 18. 55. M. D-CMP. 98/85/25. Positive. Negative. 19. 36. M. D-CMP. 70/60/37. Positive. Negative. 20. 43. M. D-CMP. 76/61/36. Positive. Negative. 23. 57. F. D-CMP. 75/65/28. Positive. Negative. 24. 38. F. D-CMP. 66/58/23. Positive. Negative. 29. 38. M. D-CMP. 72/67/14. Positive. Negative. 6. 52. M. Ischemic CMP. 68/61/19. Positive. Negative. 9. 41. M. Ischemic CMP. 69/55/37. Positive. Negative. 27. 53. M. Ischemic CMP. 68/65/8. Positive. Negative. 2. 47. F. R-CMP. 57/43/43. Positive. Negative. 14. 17. M. R-CMP. 40/29/47. Positive. Negative. 21. 27. M. Normal. 46/30/61. n. n. 22. 10. M. Normal. n. n. n. 25. 59. F. Normal. n. n. n. 26. 33. F. Normal. n. n. n. 28. 15. M. Normal. 35/22/60. n. n. 1529.

(4) 로 PCR을 시행하였다. Mineral oil을 제거한 후 labelling 을 위하여 nested PCR은 초기 PCR의 반응물에 0.4 μl 의 digoxigenin-labelled dUTP를 0.4 μl, 각각 2 μl의 E1, E2 primer를 섞어 다시 같은 조건으로 PCR을 시 행하고 mineral oil을 제거한다. 검출을 위하여 1：500으로 0.1 M Tris pH 7.5, 0.1 M NaCl로 희석된 anti-digoxigenin antibody를 첨가 한 후 30분간 배양한다. 상온에서 0.1 M Tris pH 9.5, Fig. 1. Schematic drawing of Coxsackie B3 genome and sequence of primers for reverse transcription-polymerase chain reactions.. 0.1 M NaCl, 0.1 M MgCl2에 2분간 soaking후 NBT/BCIP를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 광학현미경하에서 자홍색으로 염색된 핵을 관찰한다.. 시행하였다(Fig. 1). 반응물로 cDNA 4 μl, upstream과 downstream primer 각각 20 pmole(2 μl×2), dNTP. DNA의 분리, 인형 거대세포바이러스에 대한 중합효소. mix 4 μl, 10X PCR 완충액 5 μl에 3차증류수 33 μl. 연쇄반응 및 nested 중합효소 연쇄반응. 를 섞어 반응부피를 50 μl로 하였다. 반응조건은 94도. 기존 본 저자들이 보고10)한 바와 같이 액체질소내에서. 에서 초기 denaturation후 denaturation을 94도에서 1. 심장조직을 절단하여 조직절편을 미리 냉각시킨 유발. 분, annealing을 50도에서 1분 30초, primer extension. (mortar)과 유봉(pestile)을 이용하여 잘게 분쇄한다. 조. 을 72도에서 1분 30초간 시행하고 cycle수를 30회로 하. 직 100 mg당 1.2 ml의 소화완충액을 첨가하여 50℃. 였다. 검사의 민감도를 높이기 위하여 nested primer. 에서 잘 흔들며 12시간에서 18시간동안 배양(incubat-. (E1, E2)를 디자인하여 nested PCR을 상기조건과 동. ion)한다. 혼합액에 동량의 페놀을 첨가하여 실온에서 흔. 일하게 시행하였다(Fig. 1).. 들면서 하룻밤동안 배양한다. 이 용액을 15,000 rpm에 서 10분간 원심분리한후 상청액을 분리하여 새로운 시. 장바이러스에 대한 조직내 역전사 중합효소 연쇄반응. 험관에 넣는다. 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코. 심근조직을 silane이 입혀진 슬라이드에 mounting한. 올(25：24：1)을 첨가하고 잘 흔든 뒤에 15,000 rpm. 후 xylene에 5분, 100% 에탄올에 5분간 파라핀을 제거. 에서 10분간 원심분리후 다시 상청액을 따서 새로운 시. 한다. 이 슬라이드에 proteinase K를 30분간 반응시키고. 험관에 담는 과정을 2회 반복한다. 상층의 액상에 1/10. DEPC water에 1분, 100% 에탄올에 1분간 세척한 후 공. 의 부피가 되도록 2 M의 초산 나트륨과, 시험관내 총 용. 기중에 건조시킨다. 슬라이드에 10 μl의 Rnase-free. 액 부피의 2배가 되는 양의 100% 에탄올을 섞고 잘 흔. DNase를 10 μl의 DEPC water와 섞어서 도포한 후, 폴. 든 뒤 DNA가 침전되면 15,000 rpm에서 10분간 원심. 리프로필렌 주머니에 넣어서 37℃에서 하루밤 배양한다.. 분리한다. DNA 덩어리(pellet)를 70% 에탄올로 세척하. 다음날 슬라이드를 DEPC water에 1분, 100% 에탄. 고, 에탄올을 증발시킨 후 공기 중에서 건조시켜서, TE. 올에 1분간 세척후 2 μl 25 mM MgCl2, 1 μl 역전사효. 완충액 [10 mmol/liter의 Tris, pH 8과 0.1 mmol/liter. 소 완충액, 4 μl dNTP mix, 1.5 μl DEPC water, 0.5. 의 ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)]으로 재. μl E4 pimer, 0.5 μl RNase inhibitor, 15 unit 역전사. 부유하여 65℃에서 가볍게 흔들며 수 시간 배양한 뒤 4℃. 효소를 첨가한 후 in-situ hybridization block에서 42℃. 에서 냉장 보관한다.. 에서 30분간 incubation한다.. PCR의 시발체(primer)로는 Martin등12)이 고안한 C. 초기 PCR은 2.5 μl PCR buffer, 4.5 μl 25 mM. MV의 후기유전자(late sequence)중 pp150 인단백을 코. MgCl2, 4 μl dNTP mix, 1 μl 2% bovine serum albu-. 딩(coding)하는 부위에서 Fig. 2와 같은 두 올리고누클. min, 각각 2 μl의 E3, E4 primer, 8 μl의 삼차증류수,. 레오티드(oligonucleotide, primer1, primer2)를 이용하. 5 단위의 Taq DNA 중합효소를 슬라이드에 놓고 in-. 였다. PCR의 시약으로는 1 μg의 추출된 총 지놈 DNA. situ hybridization block에서 tube PCR과 같은 조건으. (total genomic DNA)；각 40 pmol/liter의 시발체, 5 μl. 1530. Korean Circulation J 1998;28(9):1527-1537.

(5) 의 10X PCR 완충액；4 μl의 1.25 mmol/μl dNTP 혼합용액에 3차증류수를 첨가하여 총 부피를 50 μl가. 존 보고와 동일한 총 네 가지의 시발체를 사용하였다. 첫 번째 중합효소 연쇄반응의 시약은 5.0 μl의 10X 반. 되도록 맞추어 반응을 시켰다. 처음에 90℃에서 5분간 두. 응완충액, 9.0 μl의 25 mmol MgCl2, 4 μl의 dNTP 혼. 었고, 이 용액에 5unit의 Taq DNA 중합효소를 첨가하여. 합액, 각각 4 μl의 시발체 1, 2, 3차 증류수 22 μl를 섞. PCR을 40cycle 실시하였다. PCR의 조건으로는 denat-. 어 총 반응부피를 50 μl로 만든 후 중합효소 연쇄반응을. uration을 95℃에서 1분, annealing을 57℃에서 1분；. 방법3)의 조건과 같이 40회 시행하였다. 다시 xylene에. extension을 72℃에서 1분 30초간 시행하였다. 반응이. 2회, 각각 1분 30초간, 100% 에탄올, 95% 에탄올에. 후 반응용액 20 μl를 각각 취하여 55℃에서 5분간 가. 각각 2분간 처리하여 광유(mineral oil)를 제거하였다.. 열후 0.5 μg/ml의 ethidium bromide를 포함한 1%. 발체(primer3, primer4)를 고안하여 168bp의 증폭된. Table 2. Results of polymerase chain reactions (PCRs) of enterovirus in myocardium of cardiac transplant recipients. The result were from tube PCRs and the results in the parenthesis denotes for the results from nested PCRs. (No：heart number, LV：left ventricle, LA：left atrium, RV：right ventricle, RA：right atrium, TGA：transposition of great arteries, PS：pulmonic stenosis, D-CMP：dilated cardiomyopathy, I-CMP：ischemic cardiomyopathy, RCMP：restrictive cardiomyopathy, P：positive, N：negative, x：no sample). 산물이 나오게 하였다(Fig. 2).. Number. Diagnosis. LV. LA. Nusieve agarose gel에서 전기영동한 후 자외선 조사 에 의해 산물을 확인하였다. 바이러스 DNA의 검출에 대한 민감도와 특이도를 높 이기 위하여 기존 PCR 산물을 다시 nested PCR을 시행 하였는데 기존 PCR에서 증폭된 607bp의 부위내에서 시. RV. RA. 8. corrected TGA, PS. N. N. N. X. 인형 거대세포바이러스에 대한 조직내 중합효소 연쇄반. 3. D-CMP. N. X. N. X. 응(in situ polymerase chain reaction, in situ PCR). 4. D-CMP. N. X. N. X. 5. D-CMP. N. N. N. N. 심장조직 절편을 10% 포르말린으로 고정한 후, 파 라핀 블록을 만들고 silane이 입혀진 유리 슬라이드에 조직을 잘라 붙여 실험에 사용하였다. 조직에서 파라핀을. 7. D-CMP. N. N. N. N. 10. D-CMP. N. N. N. N. 11. D-CMP. N. N. N. X. 제거하기 위하여 xylene에 각각 1분 30초씩 2회 처리. 12. D-CMP. N. N. N. N. 후 100% 에탄올에 2분, 95% 에탄올에 2분 처리하고 공. 13. D-CMP. N. N. N. N. 기 중에서 건조시켰다. 이 슬라이드에 proteinase K를. 16. D-CMP. N. N. N. N. 0.1 M Tris 완충액(pH 8.0)으로 희석하여 20 μg/ml. 17. D-CMP. N. N. N. N. 18. D-CMP. N. N. N. N. 19. D-CMP. N. N. N. N. 20. D-CMP. N. N. N. N. 23. D-CMP. N. N. N. N. 24. D-CMP. N. N. N. N. 27. D-CMP. N. N. N(P). N. 29. D-CMP. N. N. N. N. 6. Ischemic CMP. N. N. N. X. 9. Ischemic CMP. N. N. N. N. 의 농도로 만들어 37℃에서 10분간 처리 후, 0.01 N HCl 용액에 1분간 처리하고, 0.1 M Tris 완충액으로 세척 하였다. 중합효소 연쇄반응의 시발체는 본 저자들의 기. Fig. 2. Schematic drawing of cytomegalovirus (AD169) genome and sequence of primers for polymerase chain reactions.. 2. R-CMP. N. N. N. N. 14. R-CMP. N. N. N. N. 21. Normal. N. N. N. N. 22. Normal. N. X. N. N. 25. Normal. N. N. N. N. 26. Normal. N. N. N. N. 28. Normal. N. N. N. N. 1531.

(6) 다시 표지를 위한 중합효소 연쇄반응을 시행하는데 시약은 5.0 μl의 10X 반응완충액, 9.0 μl의 25 mmole. 반응부피를 50 μl로 하여 중합효소 연쇄반응을 30회 시행하였다.. MgCl2, 4 μl의 dNTP 혼합액, 0.5 μl의 digoxigenin-. 염색 및 검출을 위하여 먼저 2%의 차단용액(blocking. labelled dUTP, 각각 4 μl의 primer 1, 2, 3, 4, 1 μl의. solution)을 0.1 M Tris 완충액, 0.1 M NaCl, pH 7.5. Taq DNA 중합효소, 14.5 μl의 3차 증류수를 섞어서 총. 의 혼합용액으로 희석하여 만들고, 차단용액에 조직이 붙 은 슬라이드에 45℃, 30분간 배양시킨다. 2% 차단용액 1 ml에 항-digoxigenin 항체를 2 μl을 첨가하여 슬라 이드에서 상온을 유지하며 30~60분간 반응시켰다. 이 슬 라이드를 coplin jar에 넣고 0.1 M Tris 완충액, 0.1 M NaCl, pH 7.5의 혼합용액으로 2~3회 세척하고, 0.1 M Tris 완충액, 0.1 M NaCl, 0.05 M MgCl2 pH 9.5의 혼 합용액 내에 2분간 반응시켰다. 다시 0.1 M Tris 완충. Fig. 3. Nested reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) results of enterovirus in 3% agarose gel electrophoresis. Positive bands of enterovirus were 196 base pair-length. Bax-alpha was positive control for the procedure of RT-PCR. (SM：size marker, (-)：negative control, LV：left ventricle, RV：right ventricle, (＋)：positive control, bp：base pair). 액, 0.1 M NaCl, 0.05 M MgCl2 pH 9.5의 혼합용액 1 ml에 NBT 2.3 μl/BCIP 1.8 μl 용액을 섞어 37℃에서 차광 후 15~30분간 반응을 시켰다. 이렇게 염색된 조직 을 50배, 100배, 400배의 광학현미경으로 관찰하여 자 홍색으로 염색된 핵을 양성으로 판정하고, 양성률의 정도. A. B. C. D. Fig. 4. Results of in situ reverse transcription-polymerase chain reactions of enterovirus. A：negative control of enterovirus in myocardium of patient with dilated cardiomyopathy (× 40). B：positive sample of enterovirus in myocardium of patien with dilated cardiomyopathy (× 40). C：positive sample of enterovirus in myocardium of patient with dilated cardiomyopathy (× 100). D：positive sample of enterovirus in myocardium of patient with dilated cardiomyopathy (× 400). In contrast to negative control, positive signal of enteroviral RNA in nuclei were stained in dark-violet color.. 1532. Korean Circulation J 1998;28(9):1527-1537.

(7) 었다. 검출률을 높이기 위한 nested PCR에서는 부전심. 와 양성을 보이는 부위와 세포를 확인하였다.. 장중 1개에서 양성이었으며 양성률은 4.4%였다. 이 때. 결. 과. 정상심장에서는 모두 음성이었다. 양성률에 있어서 부전 심장 및 정상심장사이에 의미있는 차이는 없었다.. 장바이러스에 대한 역전사 중합효소 연쇄반응(Table 2, 장바이러스에 대한 조직내 역전사 중합효소 연쇄반응. Fig. 3) 실험이 가능하였던 부전심장 22개 및 정상심장 5개에 서 장바이러스에 대한 초기 PCR의 결과는 전부 음성이 Table 3. Results of polymerase chain reactions (PCRs) of cytomegalovirus in myocardium of cardiac transplant recipients. The result were from tube PCRs and the results in the parenthesis denotes for the results from nested PCRs. (No：heart number, LV：left ventricle, LA：left atrium, RV：right ventricle, RA：right atrium, TGA：transposition of great arteries, PS：pulmonic stenosis, D-CMP： dilated cardiomyopathy, I-CMP：ischemic cardiomyopathy, R-CMP：restrictive cardiomyopathy, P：positive, N： negative, x：no sample). (Fig. 4) Nested PCR에서 양성을 보였던 부전심장의 심근에 대 하여 시행한 in situ RT-PCR에서는 주로 심근세포의 핵에 자홍색으로 염색되어, 심근세포의 핵에 주로 장바이 러스의 핵산이 존재한다는 것을 알 수 있었다. 대조군으 로 시행한 정상심장의 심근이나 장바이러스 RT-PCR 음 성인 부전심장의 심근에서는 염색이 되지 않았다.. 인형 거대세포바이러스에 대한 중합효소 연쇄반응(Table 3, Figs. 5 and 6). Number. Diagnosis. LV. LA. RV. RA. 8. Corrected TGA, PS. N. N. N. X. 말기 심부전이 있었던 22명의 환자의 좌심실조직 중. 3. D-CMP. N. X. N. X. 3명에서 양성이었고(13.5%), 이중 확장성 심근증이 2례,. 4. D-CMP. N. X. N. X. 허혈성 심근증이 1례였다. 정상심장 5례중 1례에서 양. 5. D-CMP. N. N. N. N. 7. D-CMP. P (P). N. N. N. 10. D-CMP. N. N. P (P). X. 11. D-CMP. N. N. N. N. 12. D-CMP. P (P). N. N. N. 13. D-CMP. N. N. N (P). N. 16. D-CMP. N. N (P). N. N. 17. D-CMP. N. N. N. N. 18. D-CMP. N. N. N (P). N. 19. D-CMP. N. N. N (P). N. 20. D-CMP. N. N. N. N. 23. D-CMP. N. N. N. N. 24. D-CMP. N. N. N. N. 27. D-CMP. N (P). N. N (P). N. 29. D-CMP. N. N. N. N. 6. Ischemic CMP. N. N. N. X. 9. Ischemic CMP. N. N. P (P) N (P). 2. R-CMP. N. N. N. N. 14. R-CMP. N. N (P). N. N. N. N. 21. Normal. N. N. 22. Normal. P (P). X. N. N. 25. Normal. 26. Normal. 28. Normal. N (P) N (P) N. N. N (P) N (P) N. N. N. N (P). N. N. 성이었고(20%) 양군간에 통계적인 유의성은 없었다. 우 심실, 좌심방 및 우심방에서는 인형 거대세포바이러스의. Fig. 5. Initial polymerase chain reaction results of cytomegalovirus in 1% agarose gel eletrophoresis. Positive bands of cytomegalovirus were 607 base pair-length. Unknown band was depicted as asterisk. (bp：base pair, (-)： negative control, (＋)：positive control, SM：size marker).. Fig. 6. Nested polymerase chain reaction results of cytomegalovirus in 2% agarose gel eletrophoresis. Positive bands of cytomegalovirus were 168 base pair-length. (bp：base pair, (-)：negative control, LV：left ventricle, RV：right ventricle, LA：left atrium, (＋)：positive control, SM：size marker).. 1533.

(8) DNA가 발견되지 않았다. Nested 중합효소 연쇄반응에 서 말기심부전 좌심실 22례중 4례에서, 정상심장의 좌심 실 5례중 2례에서 거대세포바이러스 DNA가 양성이었 다. 좌심방에서는 말기심부전 환자 20례중 3례에서, 정 상심장 4례중 1례에서 양성이었고, 우심실에서는 말기심. Table 4. Result of in situ polymerase chain reaction of cytomegalovirus in myocardium in which the result of nested polymerase chain reaction was positive and negative (No.：Heart number, PCR：polymerase chain reaction, CMP：cardiomyopathy, D-CMP：dilated CMP, R-CMP：restrictive CMP, I-CMP：ischemic CMP, TGA：transposition of the great arteries) No.. Diagnosis. Nested PCR. 7. D-CMP. Positive. Negative. 10. D-CMP. Positive. Negative. 에서도 양성이 없었으며, 정상심장 5례중 2례에서 양성. 12. D-CMP. Positive. Positive. 이었다. 종합하면 부전심장의 45%(10/22), 정상심장의. 13. D-CMP. Positive. Negative. 40%(2/5)에서 인형 거대세포바이러스의 DNA가 양성. 16. D-CMP. Positive. Positive. 이었다. 따라서 부전심장 및 정상심장사이에 거대세포바. 18. D-CMP. Positive. Negative. 19. D-CMP. Positive. Negative. 27. D-CMP. Positive. Positive. 9. I-CMP. Positive. Positive. 14. R-CMP. Positive. Negative. 22. Normal. Positive. Negative. 26. Normal. Positive. Negative. Negative. Negative. 부전 환자 22례중 4례에서, 정상심장 5례중 2례에서 양 성이었으며, 우심방에서는 말기심부전 환자 17례중 한 례. 이러스 DNA의 존재여부는 통계적으로 유의한 차이가 없었다.. 인형 거대세포바이러스에 대한 조직 내 중합효소 연쇄반 응(Table 4, Fig. 7). in situ PCR. 인형 거대세포바이러스 양성인 부전심장의 심근에서 시 행한 in situ PCR에서는 양성인 부전심장 12개 중 4개. 8. 에서 양성으로 양성률은 33.3%이었다. PCR에서 음성인. 3. Corrected TGA D-CMP. Negative. Negative. 염색된 부위는 주로 심근세포의 핵이었으며, 대조로 시. 4. D-CMP. Negative. Negative. 행한 정상심장 및 인형 거대세포바이러스 음성인 부전심. 5. D-CMP. Negative. Negative. 11. D-CMP. Negative. Negative. 17. D-CMP. Negative. Negative. 장의 심근에서는 염색이 되지 않았다.. 연령에 따른 심강내 인형 거대세포바이러스의 분포양상 (Fig. 8) 35세를 기준으로 나누었을 때 35세 이하인 심장 3개. 6. I-CMP. Negative. Negative. 22. Normal. Negative. Negative. 25. Normal. Negative. Negative. 28. Normal. Negative. Negative. 에 평균 PCR 양성인 심강수는 2.3이었으며, 35세를 초 과한 심장 9개에 평균 PCR 양성인 심강수는 1.3이었. 다. 이는 아마도 지역적인 차이와 인종적인 차이가 관계. 다. 즉 연령이 증가함에 따라서 인형 거대세포바이러스. 될 것으로 생각되나 이런 차이에 대한 구체적인 연구는. 가 검출되는 심강수가 감소하는 추세를 보였다.. 지금까지 없는 실정이다. 그에 비하여 우리 나라에 아주 흔한 인형 거대세포바이러스의 심근감염은 44.4%로 장. 고. 안. 바이러스 감염의 10배에 달함을 관찰할 수 있었다. 그러 므로 본 저자들의 기존 연구에서 인형 거대세포바이러스. 본 연구의 의미로는 우리 나라에서 아직 보고된 바 없. 감염률이 부전 심장이나 정상 심장에서 통계적인 차이는. 는 장바이러스의 심근내 존재를 확인하였다는 데 있다.. 없으나, 특발성 확장성 심근증을 포함한 특발성 심근증. 구미에서는 결과가 서로 상반되기는 하지만 중합효소 연. 의 원인이 워낙 다양하여 일부의 말기심부전에 인형 거. 쇄반응법으로 장바이러스, 특히 Coxsackie 바이러스를. 대세포바이러스 감염이 어느 정도의 기여를 했을 가능성. 검출한 양성률을 살펴보면 0%에서 66.7%로 매우 다양. 을 배제할 수는 없다. 즉, 구미에서도 심근염의 원인으로. 하지만 평균적으로 약 30%의 양성률을 보이는 것으로. 인형 거대세포바이러스를 확인하기 위하여 중합효소 연. 이에 비하여 본 연구의 양성률은 매. 쇄반응으로 시행한 연구들12-15)에서도 양성률은 3.8%에. 우 낮은 4.4%로 구미와는 많이 다른 결과를 보이고 있. 서 48.4%로 다양하며, 본 연구와 같이 감염률이 높은. 4-9). 생각되고 있다.. 1534. Korean Circulation J 1998;28(9):1527-1537.

(9) A. B. C. C. Fig. 7. Results of polymerase chain reactions of cytomegalovirus. A：negative control of cytomegalovirus in myocardium of patient with dilated cardiomyopathy (× 40). B：positive sample of cytomegalovirus in myocardium of patient with dilated cardiomyopathy (× 40). C：positive sample of cytomegalovirus in myocardium of patient with dilated cardiomyopathy (× 100). D：positive sample of cytomegalovirus in myocardium of patient with dilated cardiomyopathy (× 400). In contrast to negative control, positive signal of cytomegaloviral DNA in nuclei were stained in dark-violet color.. 중합효소 연쇄반응 및 조직내 역전사 중합효소 연쇄반응 으로 핵내 바이러스의 핵산이 존재함을 증명16)하였으므 로, 바이러스의 감염이 심근에 있었다는 직접적인 증거 를 제시한 것이라고 여겨진다. 또 특이할 만한 사항은 한 례의 확장성 심근증 심장에 서 장바이러스 및 인형 거대세포바이러스의 핵산이 동 시에 발견된 것이다. 이는 바이러스간 상호 작용에 의하 여 여러 가지의 면역학적 기제를 통한 확장성 심근증으 로의 진행을 시사할 수 있을 것으로 생각된다. 즉, 여러 Fig. 8. Distribution pattern of cytomegalovirus genome among four chambers according to age in cytomegalovirus-positive cases.. 바이러스가 함께 감염되었을 경우 바이러스간에 어떠한 작용이 있을 것인지, 또한 서로 상승작용이 있어서 면역 학적 기제를 촉진시킬 수 있는지에 대한 연구가 계속되. 연구도 있는 것이 본 연구의 의미를 높여주는 사실이라 하겠다.. 어야 할 것으로 사료된다. 그러나 이런 바이러스의 감염이 직접 심근증의 발생에. 또 바이러스의 핵산이 심근에서 추출한 핵산에 존재. 기여하여, 단 시간에 말기심부전으로의 진행을 의미하는. 한다는 것이 여러 혈액이나 체액에 의한 오염의 가능성. 것은 물론 아니다.17-20) 서론에서 언급했던 것과 같이 자. 을 제시한 경우가 있었으나, 이는 본 연구에서 조직내. 가면역에 의한 기전은 질병 발생에 많은 시간이 소요되 1535.

(10) 며, 특히 바이러스 감염이 치료된 후에도 나타날 수 있으. 조직내 중합효소 연쇄반응법을 시행하여 조직내 분포를. 므로, 바이러스에 의한 모든 감염이 다 말기심부전으로. 관찰하였다.. 17-20). 의 진행에 기여할 것이라고는 생각할 수 없다.. 그. 결 과：. 렇지만 바이러스 감염의 일부가 심근의 파괴 및 기능저. 장바이러스에 대한 초기 중합효소 연쇄반응에서는 모. 하에 역할을 했을 가능성을 생각할 수 있는 것은 연령에. 두 음성이었으며, nested 중합효소 연쇄반응에서 부전심. 따른 심강에 바이러스 양성률의 차이에서도 유추해 볼. 장의 4.4%(1/22)에서 양성이고, 정상심장에서는 모두 음. 수 있다. 즉 어릴수록 많은 심강에 바이러스 핵산이 양성. 성(0/5)이었으나 양군간에 유의한 차이는 없었다. 인형. 을 보이는 것은 바이러스에 의한 심한 급성의 심근손상. 거대세포바이러스에 대한 초기 중합효소 연쇄반응에서 부. 이 생겨서 말기심부전으로 진행되었을 가능성을 시사하. 전심장의 13.5%(1/22)에서 양성이고, 정상심장의 20%. 며, 고 연령층에서는 바이러스 핵산이 부전 심근내 미량. (1/5)에서 양성이었다. 인형 거대세포바이러스에 대한. 으로 존재하지만 말기심부전으로의 진행이 점진적이고 심. nested 중합효소 연쇄반응에서도 부전심장의 45%(10/. 근손상의 기전이 바이러스에 의한 직접적인 심근손상이. 22)에서 양성이고, 정상심장의 40%(2/5)에서 양성이어. 아닌 면역학적 기제가 포함되었을 것으로 추측할 수 있. 서 양군간에 차이는 없었다. 조직내 역전사 중합효소 연. 21-24). 이런 연구들이 전향적으로 시행되기는 어렵기. 쇄반응에서 장바이러스의 핵산은 주로 핵에 존재하였으. 때문에 쉽게 결론을 도출하지는 못하지만, 일부의 실험. 다.. 며, 조직내 중합효소 연쇄반응에서 인형 거대세포바이러. 적 연구 및 종설에서 상기와 같은 가설을 시사하는 결과. 스의 핵산도 주로 핵에 존재함을 관찰할 수 있었다. 인. 를 보고한 바 있다.25-30). 형 거대세포바이러스의 심장내 핵산 검출률은 환자의 연. 그러므로 본 연구에서는 우리 나라의 말기심부전 심장. 령이 증가함에 따라 핵산양성인 심강수가 감소하는 추세. 에서 장바이러스의 감염은 매우 드물며, 말기심부전으로. 를 보였다.. 진행에 기여도는 상당히 낮을 것으로 예상된다. 인형 거. 결 론：. 대세포바이러스의 감염은 흔하고, 전체적으로 부전 심장. 우리 나라에서 말기심부전 심근에서 장바이러스의 감. 과 정상 심장간에 차이가 없지만 일부의 군에서는 말기. 염은 매우 드물고, 인형 거대세포바이러스의 감염은 매. 심부전으로의 진행에 기여했으리라 생각된다.. 우 흔하다. 한편 양 바이러스 감염은 부전심장 및 정상 심장 사이에 의미있는 차이가 없어, 말기심부전의 진행. 요. 약. 에 대한 역할은 작을 것으로 사료된다.. 연구배경：. 중심 단어 ：말기심부전・특발성 확장성 심근증・장바. 우리 나라에서 심장이식이 필요한 가장 많은 원인중. 이러스・거대세포바이러스・중합효소 연쇄반응법.. 의 하나인 특발성 확장성 심근증을 비롯한 여러 심질환. ■ 감사문. 에 의한 말기심부전 심장에 대한 장바이러스 및 인형 거. 본 연구는 1997년도 교육부조성학술연구비(유전공학GE97-) 의 지원으로 이루어졌습니다. 본 연구를 위하여 in situ PCR 및 in situ RT-PCR을 도와주신 서울대학교 의학연구원 심장 연구소 정은주 연구원과 심근조직의 수집 및 보관을 도와주신 최현석, 강현재, 김광일, 유경훈, 박진식 선생님께 감사의 말씀 을 전합니다.. 대세포바이러스의 기여도 및 발견빈도를 검색하기 위하 여 중합효소 연쇄반응법을 이용한 바이러스 핵산의 검 출을 시도하였다.. 방 법： 말기심부전으로 심장이식을 받은 환자 22명 및 뇌사 자 5명에서 적출한 심장의 심근에서 각각 RNA와 DNA 를 분리하고, 각각 장바이러스와 인형 거대세포바이러스. REFERENCES 1) Shabetal R. Cardiomyopathy: How far have we come in 25 years, how far yet to go? J Am Coll Cardiol 1983;1:252-63.. 에 대한 역전사 중합효소 연쇄반응법 및 중합효소 연쇄. 2) Kawai C, Takatsu T. Clinical and experimental studies on. 반응법을 시행하여 전기영동으로 결과를 확인하고, 각각. 3) Gilbert EM, Mason JW. Immunosuppressive therapy of my-. 장바이러스 및 인형 거대세포바이러스 핵산 양성인 심. ocarditis. In: Engelmeier RS, O’Connell JB, editors. Drug Therapy in Dilated Cardiomyopathy and Myocarditis. New. 근조직에 대하여 조직내 역전사 중합효소 연쇄반응법 및 1536. cardiomyopathy N Engl J Med 1975;293:301.. Korean Circulation J 1998;28(9):1527-1537.

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