백서 경동맥 내피세포 제거 후 Nitric Oxide Synthase 아형들의 발현 양상
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(2) 서. 론. 혈관내피세포 제거 후 eNOS와 iNOS의 발현 양상을 각 각 관찰한 보고들4)12)15)은 있으나, 혈관 손상 후 중요한. Nitric oxide(NO)의 역할은 비단 혈관확장 뿐 아니라,. 역할을 할 NOS 아형의 발현 양상을 동일한 실험 조건. 혈관 손상후 재협착 생성과정에도 매우 중요한 위치를. 에서 동시에 관찰한 경우는 없다. nNOS에 관한 실험은. 차지하고 있음은 이미 많은 연구들에 의해 증명되어진. 거의 전무한 실정이다. 실험 조건이 다름에 따라 NOS. 바 있으며 현재에도 많은 연구가 전세계적으로 활발히. 의 발현 양상이 약간씩 다를 수 있을 것이라고 예측할. 이루어지고 있다.1-4) 즉, 정상 내피세포를 갖는 혈관은. 수 있고, 실제로 이미 보고된 발현 양상도 차이가 있다.. 소량의 endothelial-derived relaxing factor(EDRF,. 혈관내피세포의 기능과 eNOS 발현은 신생 내막에서 발. NO)를 지속적으로 분비하여 혈관의 확장을 유지시키고,. 현되는 iNOS 발현과 밀접한 상관 관계가 있을 가능성. 혈관내벽에 백혈구가 달라붙는 것을 방지하며, 혈관에. 이 있고,16) 동일한 조건에서 동시에 관찰하여야만 이 두. adhesion molecule인 VCAM-1의 발현을 억제한다.5). NOS의 발현 양상의 상호관계를 가장 잘 예측할 수 있. NO는 NO를 생성하는 효소인 nitric oxide synthase. 을 것이다. 본 연구는 혈관에서 NOS 아형들이 혈관의. 6). (NOS)에 의해 L-arginine로부터 생성된다. 지금까지. 내피세포를 제거한 후 동일 실험 환경에서 어떻게 변화. 혈관에는 NOS 아형들 중 혈관내피세포에 국소적으로. 하는지를 규명하여, 혈관내피세포 제거 후 혈관 재형성. 존재하며 혈관에서의 지속적인 NO 분비를 담당하는 NOS. 과정에서의 NOS 아형들의 상호 관계를 이해함으로써. 2+. 인 constitutive Ca -dependent NOS인 endothelial. 혈관손상후 재협착 기전의 이해 및 치료에 도움을 주고. NO synthase(eNOS)가 혈관평활근세포에 발현되어 있. 자 하였다.. 으며 interleukin-1, interferon-g, tumor necrosis fa-. 재료 및 방법. ctor-a, bacterial endotoxin 등의 proinfl-ammatory cytokine에 의해 지속적이고 다량의 NO 분비를 조장하 는 inducible NO synthase(iNOS)가 있다고 알려졌으 나 최근에 세 번째 NOS 아형인 neuronal NOS도 백서 의 혈관평활근세포에 존재한다고 밝혀져 있다.4)6-10) 혈관내피세포는 혈전 형성 방지, 혈관 확장능 유지 등. 실험 동물 연령 10~12주 사이의 체중 250~270 g의 수컷 Sprague-Dawley rat(n＝40)를 실험 전 2주간 안정 기 간을 거쳐 실험에 사용했다.. 에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.5) 혈관내피세포 제거는 혈전 생성, 백혈구의 활성화 및 혈관내 침윤, 혈. 백서 경동맥 풍선 손상 모델. 관평활근세포의 증식 및 이동, 세포외 기질 단백질 형. 실험 백서에 ketamine(50 mg/kg)과 xylazine(6.7. 성 등을 촉진한다고 보고되고 있다.11)12) 혈관내피세포. mg/kg)을 근주하여 마취시킨 후, 우측 경부를 절개하여. 를 제거하면 eNOS의 발현이 사라질 것이라고 예측할. 총경동맥(common carotid artery), 외경동맥및 내경동. 수 있고, 이것이 시간이 지남에 따라 혈관내피세포의 재. 맥을 분리하였다. Microvascular clamp(Acland, S &. 생에 따라 그 기능이 돌아올 것이라고 기대할 수 있다.. T, Switzerland)를 총경동맥의 대동맥 기시부와 내경동. 혈관내피세포 제거 후에 형성되는 신생 내막은 혈관내. 맥 원위부에 착용시켜 혈류를 일시적으로 중단시킨 상. 피가 온전한 정상 혈관의 특성(혈전 형성이 방지되는. 태에서 외경동맥을 절개하였다. 절개부위를 통해 2F Fo-. 혈관 내면과 혈관 확장능)을 빠르게 획득한다고 알려져. garty 풍선도자(Forgaty catheter, Baxter Healthcare. 4)13-14). 있다.. Corporation 사)를 우측 총경동맥으로 삽입하고 총경동. 혈관내피세포 제거 후에 이러한 기능을 빠르게 회복. 맥의 직경보다 크게 풍선을 부풀린 상태에서 3회를 왕. 하는 것은 신생 내막 형성 과정에서 NO 생성이 유발되. 복시켜 내피세포를 제거하였다. 이 후 microvascular cl-. 리라 생각할 수 있다. 실지로 혈관내피세포 손상 후 신. amp를 제거하여 혈류를 재관류시키고 절개부위를 봉합. 생 내막 형성시 iNOS의 발현이 빠르게 유도된다는 보. 하였다.. 4)14). 고들이 있어 이런 가정을 뒷받침하고 있다.. 그러나,. 885.
(3) 조직 준비 및 슬라이드 제작. 20분 후 생리적 식염수로 생체 관류한 후 관찰하였다.. 경동맥 풍선 손상 후 1일(n＝6), 3일(n＝5), 5일(n＝ 7), 7일(n＝6), 14일(n＝6), 21일(n＝5), 28(n＝5)일. RNA 분리 및 RT-PCR. 후에 다시 전신마취를 시키고 양쪽 경동맥을 적출하였다.. 급속 냉동시킨 경동맥 샘플에서 TRIZOL(Gibco BRL). 실험군은 내피세포 제거군으로 2F Fogarty 풍선도자를. 을 사용해 총 RNA를 분리하였다. RNA는 260 nm와. 이용하여 손상을 준 우측 경동맥이며, 대조군은 손상을. 280 nm에서 흡광도를 측정한 후 agarose gel에서 전. 주지 않은 좌측경동맥을 사용했다. 분리한 경동맥은 생리. 기영동시켜 18S와 28S의 밴드를 확인한 후 사용했다.. 식염수를 혈관내로 흘려보내 혈액을 제거하고, 주위 근육. RNA 4 μg(total volume 8 μL)를 65℃에서 10분간. 및 신경 조직 등을 제거한 후 즉시 액화 질소에 급속 냉. denaturation시킨 후 얼음에 5분간 방치하였다. Ran-. 동시켜 샘플 절편의 두께가 4 μm이하가 되도록 frozen. dom hexamer primer 1 μL, DTT solution 1 μL,. section하였다. 슬라이드는 Acetone에 30분이상 고정. Bulk 1st mix 4 μL를 첨가해 37℃에서 한 시간 반응. 시키고 실온에서 한시간 건조시킨 후 -70℃에 보관하. 시킨 후 72℃에서 10분, 얼음에 다시 5분간 방치한 후. 여 염색에 사용하였다.. 증류수 5 μL를 첨가하여 총 volume은 20 μL로 cDNA 를 합성(First-Strand cDNA Synthesis Kit, Amers-. 면역조직화학적염색 -70℃에서 보관한 조직 슬라이드는 실온에 30분간 방치시켜 슬라이드를 녹인 후 phosphate-buffered saline(PBS)에 5분간 침강 처리한 후 염색에 사용했다. 조 직 슬라이드는 10% normal goat serum(iNOS), 10% normal horse serum(eNOS, nNOS)을 전처리(실온, 1 시간)한 후, PBS로 세척했다. Primary antibody는 iNOS (polyclonal Ab, Transduction Laboratories, USA), eNOS(monoclonal Ab, Transduction Laboratories, USA), nNOS(monoclonal Ab, Transduction Laboratories, USA)를 사용하였다. 1：500으로 희석한 primary. ham Pharmacia Biotech, USA)하였다. 합성한 cDNA는 RT-PCR에 사용했다. PCR primer 는 iNOS와 GAPDH의 primer는 다음과 같다. iNOS sense primer：5’ -ATGGCTTGCCCTTGGAAGTTTCTC-3’ , iNOS antisense primer：5’ -TCCAGGCCATCTTGGTGGCAAGA-3’ , GAPDH sense primer：5’ -TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGGC-3’ , GAPDH antisense primer：5’ -CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3’. antibody를 37℃에서 90분 동안 반응시켰다. Second-. iNOS를 증폭시키기 위해 95℃에서 4분간의 initial de-. ary antibody는 biotinylated anti-rabbit IgG (Vector. naturation을 실시한 후 총 40 cycle의 증폭을 실시하. Laboratories, USA)를 1：200으로 희석해 처리한 후. 였다. 각 cycle은 95℃에서 1분간 denaturation, 56℃. chamber에 넣고 실온에서 60분간 반응시켰다. Solution. 에서 2분간의 annealing과 72℃에서 1분간의 extens-. of peroxidase linked ABC(ABC kit, Vector Laborat-. ion을 포함하였다. 이후 72℃에서 7분간의 최종적인 ch-. ories, USA)에서 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 모. ain extension을 실시하였다. 대조군으로 사용한 GA-. 든 과정의 슬라이드는 건조되지 않도록 wet chamber. PDH는 95℃에서 4분간의 initial denaturation을 실시. 에 넣고 반응시켰다. DAB(Vector Laboratories, USA). 한 후 총 30cycle의 증폭을 실시하였다. 각 cycle은 95℃. 로 8분간 발색시킨 후 hematoxylin (Vector Laborat-. 에서 1분간 denaturation, 56℃에서 2분간의 annea-. ories, USA)으로 대조 염색한 후 광학 현미경에서 관. ling과 72℃에서 1분간의 extension을 포함하였다. 이. 찰하였다.. 후 72℃에서 7분간의 최종적인 chain extension을 실 시하였다. iNOS PCR product의 size는 547 bp, GA-. Evans blue 생체 염색 수술 2주(n＝4)와 4주(n＝2) 후에 백서를 전신 마 취 시킨 후 생리적 식염수에 희석된 Evans blue 용액. PDH PCR product의 size는 974 bp로 1% agrose gel 에 전기 영동시켜 ethidium bromide로 5분간 염색한 후 확인했다.. (20 mg/mL) 1 mL를 정맥으로 투여하였다. 투여 후 886. Korean Circulation J 2002; 32(10):884-893.
(4) 결. 과. 면역화학적 염색. 렸하게 발현되었다(Fig. 2). nNOS nNOS는 정상 혈관에서는 관찰할 수 없었고, 혈관 손 상 후 1일에서 7일까지 중막 부위에서 약하게 발현되. iNOS iNOS는 수술 후 1일째부터 중막에서 발현되기 시작. 다가 14일부터는 점차적으로 감소하여 28일에는 관찰. 해 3일째까지 발현되었으며(이 시기에는 신생 내막의 생. 할 수 없었다. iNOS와는 nNOS는 달리 신생 내막 부위. 성이 거의 없음), 5일 및 7일 이후에는 신생내막 쪽에. 에서의 강한 발현은 관찰할 수 없었다(Fig. 3).. 서 강하게 발현되었고, 중막에도 조금 약하게 발현 되었 다. 수술 14일 후에는 iNOS 의 발현이 신생 내막 중 혈. Evans blue 생체 염색. 관 내강 부위 쪽에서 강하게 발현되었고, 중막에서의 발. 손상 2주째에는 풍선손상을 가한 우측 경동맥의 거의. 현은 소실되기 시작하였다. 손상 3주부터는 iNOS의 발. 전장에 걸쳐 청색으로 염색되어 혈관내피세포가 재생되. 현은 관찰되지 않았다(Fig. 1).. 지 않은 소견을 보였다(Fig. 4A). 그러나, 손상 4주째 에는 우측 경동맥의 중앙부위의 매우 짧은 구간만 염색 되어, 대부분의 경동맥 부위는 혈관내피세포가 재생되었. eNOS eNOS는 수술 후 3일까지는 발현되지 않다가, 5~7 일 째부터 신생내막의 내강쪽에 의심스러운 정도의 발. 고 경동맥 중간 부위의 짧은 구간만 혈관내피세포가 재 생되지 않은 소견을 보였다(Fig. 4B).. 현이 있었다. 손상 2주 째에는 혈관내피세포층을 관찰 할 수 없었음에도 불구하고 신생내막의 내강쪽에서 eNOS. RT-PCR. 가 발현되었다. 손상 4주째에는 형태학적으로 혈관내피. iNOS의 특이적인 mRNA의 발현정도를 알아보기 위. 세포로 보이는 층이 형성되었고, eNOS가 그 층에서 뚜. 한 반정량적인 RT-PCR에서 수술 후 1일째부터 iNOS. A. B. C. D. Fig. 1. Expression of iNOS in the injured carotid artery. iNOS protein (brown color) was detected by immunohistochemistry. Nuclei were counterstained with hematoxylin. iNOS protein was rapidly induced in the media after injury (A) and then relocalized to the intima in parallel with the development of the neointimal thickening (B). Two weeks after injury (C), iNOS expression had declined and was more localized to the luminal side of neointiam. By 4 weeks after injury (D), iNOS expression had disappeared. Magnification ×400.. 887.
(5) 가 매우 약하게 발현되었고, 손상 3일째의 경동맥에서. 까지 발현이 지속되다가 손상 21일부터는 발현이 되지. iNOS의 mRNA는 확실히 발현되기 시작해 5일과 7일. 않았다(Fig. 5).. 째에서 가장 많은 iNOS mRNA의 발현을 보였으며 2주. A. B. C. D. Fig. 2. Expression of eNOS in the injured carotid artery. eNOS protein (brown color) was detected by immunohistochemistry. Nuclei were counterstained with hematoxylin. eNOS protein was not detected 1 day after injury (A). Five days after injury (B), eNOS protein was detected weakly at the luminal surface. Two weeks after injury (C), eNOS expression was observed at the “pseudoendothelial” surface forming intimal smooth muscle cells. By 4 weeks after injury (D), eNOS expression was detected on the morphological endothelium. Magnification ×400.. A. B. C. D. Fig. 3. Expression of nNOS in the injured carotid artery. nNOS protein (brown color) was detected by immunohistochemistry. Nuclei were counterstained with hematoxylin. nNOS expression was detected at the media 1 day after Injury (A, no neointima present at day 1). Until two weeks after injury (C), nNOS expression was observed at the media, but it was not detected at the neointima. By 4 weeks after injury (D), nNOS expression had disappeared. Magnification ×400.. 888. Korean Circulation J 2002; 32(10):884-893.
(6) 고. 찰. Nitric oxide(NO)는 혈관 내막의 항동맥경화 속성에 중요한 부분을 차지하고 있는 물질로 그 정확한 성질이 규명되기 전에는 endothelial-derived relaxing factor (EDRF)라 불리우기도 하였다. 이 EDRF가 NO임이 밝 혀지고 이 물질의 작용기전들이 여러 연구자들에 의해 연구 보고되어져 왔다. 1992년 de Graaf 등17)은 NO 가 in vitro에서 혈소판과 혈관벽의 상호작용(plateletvessel wall interaction)을 저지하는 작용을 함을 보여. A. B. Fig. 4. Carotid arteries were stained with Evans-blue dye 2 and 4 weeks after balloon injury. A：the right carotid artery was balloon-injured. Two weeks after injury, blue staining was found at the nearly entire length of the injured right common carotid artery (arrows). B：the left carotid artery was not stained. Four weeks after injury, blue staining was found only at the middle part of the injured right common carotid artery (arrow). The left carotid artery was not stained.. 준다고 밝혔으며, De Caterina 등18)도 단핵구(monocyte)와 백혈구의 혈관벽 유착(adhesion)과 같은 동맥경 화의 주요한 기전이 NO에 의하여 저지됨을 보고하였으 며, Draijer 등19)은 NO가 혈관내피세포의 투과성(permeability)과 혈관긴장도(vascular tone)를 낮추어 궁 극적으로 혈관벽으로의 지단백 유출(lipoprotein flux) 을 감소시킨다고 보고하였다. 또 연이어 발표된 여러 연 구에서 NO가 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cells)의 증식과 이동을 억제하는 효과가 있음을 in 20-24) vitro와 in vivo 실험적 연구에서 보여 주었다.. 관동맥 질환의 치료 방법의 하나인 경피적 관동맥 중 재술(percutaneous coronary intervention, PCI)이 임상에 도입된 후, 과거에 비하여 성공률이나 합병증에 있어서 괄목할만한 발전을 보이고 있다. 그러나, PCI 후 의 재협착은 심혈관 질환에서 큰 문제로 남아있다. NO. A. 가 혈관 손상 후 재협착 기전에도 상당한 연관을 가지고 있다고 보고되고 있어, 혈관 손상 후 NO와 이의 생성효 소인 NOS 아형들의 발현 양상, 상호 관계, 역할 등에 대한 보다 체계적인 연구가 필요한 실정이다. 실지로 eNOS의 발현 양상에 관한 연구와 iNOS의 발현 양상 과 역할에 대한 연구들이 수행되었다. 본 연구는 이러한 연구결과들의 바탕위에서 신생내막 형성과 이때의 혈관 평활근세포에서 각 NOS의 아형들의 발현양상을 동시에 비교 분석하려는 연구로, 이는 과거 발표되어 온 연구들. Fig. 5. Representative RT-PCR demonstrating iNOS mRNA expression in balloon-deendothelialized arteries. A：iNOS mRNA (574 bp) was expressed faintly at 1 day after endothelial denudation (Another thick band was not iNOS band. See text). The expression level of iNOS mRNA was the highest at 5 days after endothelial denudation and decrease gradually until 2 weeks after injury. GAPDH mRNA (974bp) expression was used as a control. B：Bar graph showing the densitometric scanning of the RTPCR results.. 이 NOS의 특정 아형의 양상을 보고한 것에 비교하여 보 다 종합적인 연구라 할 수 있겠다. 왜냐하면, 혈관 손상 정도나 그 범위에 따라 혈관내피세포의 회복 등의 차이 가 있을 수 있고, 각 NOS 아형들은 각 아형들의 발현 에 의해 서로 조절될 가능성이 많아, 동일 실험 모델에 서 동시에 아형들의 발현 양상을 관찰하는 것이 꼭 필 요하기 때문이다. 889.
(7) 동맥경화에 따른 혈관의 변화나 관동맥 풍선성형술 후. 반정량적인 RT-PCR 결과에서는 손상 후 1일째에서는. 에 발생하는 재협착을 연구하는 in vivo 동물모델로는 백. 매우 약하게 발현되었고, 손상 3일째 샘플에서부터 확실. 서 혹은 돼지의 경동맥 손상모델, 고콜레스테롤 토끼 장. 히 발현되기 시작해 손상 후 5일과 7일째에서 가장 많. 골 동맥 손상모델, 돼지 관동맥 손상모델 등이 있으며,. 은 발현을 보였으며 2주까지 발현되다가 손상 21일부. 손상을 주는 방법도 풍선도자(Fogarty catheter, PTCA. 터는 발현이 되지 않았다. 수술 1일차에 iNOS 보다 약. balloon catheter 등), air dessication, 전기자극, over-. 간 큰 분자량의 band가 간혹 관찰되었는데, 이것에 대. sized stent 등이 있다. 본 연구에서는 백서의 경동맥에. 해서는 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다. 본 연구. 2F Fogarty catheter를 이용하여 혈관의 직경보다 조. 의 RT-PCR의 결과는 면역 조직학적 결과와도 잘 일. 금 크게 풍선을 부풀려 3차례 이상 경동맥 내를 왕복시. 치되는 결과이다. 그러나, iNOS의 발현 지속 기간은 본. 키면, 혈관내막이 제거되어 이에 대한 반응으로 혈관평. 실험이 기존의 연구 보다 조금 짧은 소견을 보였다. 혈. 활근세포가 증식하고 손상 2~3주 후에 신생내막이 형. 관손상후 iNOS 단백질은 Western blot한 결과 손상 30. 성되는 경동맥 협착모델을 만들 수 있다. 이 모델은 혈. 일까지도 강하게 나오는 것으로 보고한 논문이 있고,12). 관손상이 국소적이며 일정할 뿐만 아니라, 혈관내피세포. Yan 등4)은 면역 조직학적 검사에서 본 연구에서 보이. 를 제거하고 손상을 준 부위의 혈관의 전장에 걸쳐 혈관. 는 손상 2주째의 조직 소견과 유사한 소견을 혈관 손상. 평활근세포의 이동과 증식이 재현성 높게 나타나기 때. 4주째에 관찰할 수 있었다. 이러한 차이는 혈관 손상 정. 문에 재협착 연구에 매우 좋은 in vivo 연구 모델이며, 특. 도의 차이에 따른 혈관내피세포의 회복 속도의 차이 등. 히 혈관평활근세포의 증식에 대한 신호전달, 성장인자의. 에 기인할 것이라고 생각할 수 있다. 본 연구에서는 손상. 역할 등의 분자생물학적 연구가 많이 이루어져 있다.. 4주째에는 경동맥 중앙 부위의 일부분만을 제외하고는. 혈관내피세포를 제거하면 혈관벽에서 iNOS의 발현을. Evans blue 염색 상 혈관내피세포가 재생되어 있었고,. 촉진한다는 기능적 증거가 있고,13) in vitro 연구에선 혈. 조직학적 검사에서도 손상 4주째에 형태학적으로 혈관. 관내피세포에 의해 iNOS의 발현이 억제된다고 보고되. 내피세포로 보이는 단층의 세포를 관찰할 수 있었으나,. 16). 혈관내피세포 제거후 1~3일에 iNOS 의 발. Yan 등4)의 4주째 혈관조직에는 이러한 세포층을 관찰. 현이 약하게 관찰된 본 연구의 소견은 기존의 연구 결. 할 수 없어 혈관내피세포의 재생이 이루어지지 않은 소. 고 있다. 4)12). 과. 와도 비교적 잘 일치되는 소견으로, 기존의 연구. 견을 보였다. 그러나, 기존의 연구들은 혈관내피세포의. 와 본 연구 결과를 종합하여 보면 iNOS는 혈관 손상 후. 재생 여부나, eNOS의 발현 양상 등을 관찰하지 않아 이. 신속히 발현되고 점점 그 발현 정도가 증가한다고 생각. 러한 것과의 상관 관계를 관찰할 수 없다는 점이 있다.. 된다. 본 연구에서 iNOS는 신생 내막의 생성이 거의 없. eNOS는 혈관내피세포가 제거되므로 혈관내피세포가. 는 시기인 1일째부터 발현되기 시작해 3일째까지는 중. 없어지면 그 발현이 소실될 것으로 예상할 수 있는데, 예. 막에서 발현되었으며, 5일 및 7일 이후에는 신생내막 쪽. 상한 대로 혈관손상 후 1일과 3일째에는 발현되지 않았. 에서 강하게 발현되었고, 중막에도 조금 약하게 발현이. 다. 그러나, 손상 5~7일째에는 신생내막의 내강쪽에 의. 남아 있었다. 손상 1주일에 걸쳐 혈관평활근 세포가 중. 심스러운 정도의 발현이 있었고, 손상 2주째에는 Evans. 막에서 신생내막으로 이동할 때, iNOS의 발현 양상도. blue 염색상 혈관내피세포가 재생되지 않은 소견을 보. 비슷한 양상으로 이동하는 소견을 보였다. 수술 14일 후. 이고 조직학적으로도 혈관내피 세포층을 관찰할 수 없었. 에는 iNOS의 발현이 신생 내막 중 혈관 내강 부위쪽에. 음에도 불구하고 신생내막의 내강쪽에서 eNOS가 발현. 서 강하게 발현되었고, 중막에서 발현은 소실되기 시작. 되었다. 즉, 내피세포가 아닌 세포에서 eNOS가 발현될. 하였다. 이러한 iNOS의 발현 양상은 iNOS가 신생 내막. 수 있다는 것을 보이는 소견이다. 이전의 연구에서 eNOS. 을 형성하는 혈관평활근세포에서 더 강하게 발현되는 것. 의 발현이 혈관 손상 후 소멸하였다가 손상 2일째부터. 을 시사하며, iNOS의 발현이 내막을 이루는 혈관평활근. 나타나서 손상 2주 후에는 손상 전의 발현 정도와 비슷. 세포에서 발현이 중막 평활근세포에서 더 강하다는 in. 한 발현을 보인다는 보고15)와 비교적 잘 일치되는 소견. 4) vitro 실험과 잘 일치하는 소견이라고 볼 수 있겠다.. 이다. 그러나, 이 기존의 연구는 단지 mRNA 만을 분석. iNOS의 특이적인 mRNA의 발현정도를 알아보기 위한. 하고 면역 조직학적 검사를 시행하지 않아 그 발현 위. 890. Korean Circulation J 2002; 32(10):884-893.
(8) 치라든지 내피세포의 회복 여부 등을 평가할 수 없었다.. nNOS의 발현이 신속히 유도되었다. 혈관내피세포의 완. 혈관내피세포제거 후 nNOS의 발현 양상에 관한 논문. 전한 재생없이도 eNOS의 발현이 수일 후부터 나타나기. 은 거의 전무한 실정이다. 본 연구에서는 정상 혈관에서. 시작하고, eNOS의 발현이 증가함에 따라 iNOS와 nNOS. 는 nNOS의 발현을 관찰할 수 없으나, 혈관 손상 후 1. 의 발현이 서서히 감소해가는 소견을 보였다. iNOS는 신. 일부터 7일까지 중막 부위에서 약하게 발현되다가 14. 생내막의 생성이 없는 혈관손상 초기에는 중막에서 발. 일부터 점차적으로 감소하여 28일째에는 관찰할 수 없. 현하나 신생내막이 생성됨에 따라 그 분포가 신생내막. 었다. nNOS는 iNOS와 마찬가지로 혈관 손상후 발현이. 쪽으로 옮겨가는 양상을 보여, 신생내막을 형성하는 평. 되나, iNOS 비해 발현 정도가 매우 약하고, iNOS와는. 활근 세포에서 많이 발현될 가능성을 시사하였다. nNOS. 달리 신생 내막 부위에서의 강한 발현은 관찰할 수 없. 는 중막에서 약하게 발현되었고 신생내막이 형성되어도. 고, 중막부위에서만 약하게 관찰되어 이 아형은 중막의. 발현 부위가 이동하지 않고 중막 부위에서 계속 발현되. 혈관평활근세포에서 주로 발현될 가능성을 시사하였다.. 어, iNOS와는 다르게 중막을 이루는 혈관평활근 세포에. 비록 발현이 약하지만 iNOS와는 발현 부위 등이 달라. 서 주로 발현될 가능성을 시사하였다.. 추후 이 아형에 대한 체계적인 연구도 필요할 것 같다.. 혈관내피세포 제거 후 혈관 재형성과정에서의 각 NOS. Evans blue 생체 염색은 혈관내피세포가 손상된 부. 아형들의 발현 양상과 상호 관계의 이해는 향후 동맥경. 위는 청색으로 염색되어 혈관내피세포의 손상 여부를 쉽. 화, 관동맥 성형술 후 재협착, 관상동맥 우회로 형성술. 게 평가할 수 있는 연구방법으로 많이 사용되는 방법이. 후의 문합부 협착, 심장이식후의 동맥경화 등 다양한 질. 다. 혈관 손상 2주와 4주 후에 Evans blue 생체 염색. 병군에서의 NO의 역할 그리고 NOS의 발현과 역할 등. 25). 혈. 의 연구에 기초가 될 수 있으며, 보다 정확한 NOS의 각. 관 손상은 풍선의 부풀림 정도, 손상 회수, 혈관 손상의. 아형들의 기능규명과 이를 통한 각종 폐쇄성 혈관질환. 길이, 사용된 동물의 종, 성, 무게 등에 따라 조금 다를. 의 병태생리 이해에 기여하는 바 클 것으로 생각된다.. 을 하여 혈관내피세포의 회복 정도를 관찰하였다.. 수 있어, 그 실험에 사용된 방법의 혈관 손상의 정도와. 요. 혈관내피세포의 회복 정도를 규명해야할 필요가 있다고. 약. 생각된다. 본 연구에서는 2주째에는 풍선손상을 가한 우 측 경동맥의 거의 전장에 걸쳐 청색으로 염색되어 혈관. 배경 및 목적：. 내피세포가 재생되지 않은 소견을 보였다. 강동맥의 경. Nitric oxide(NO)는 혈관확장성 뿐 아니라, 혈관 손. 우는 다른 문제가 없어 혈관 손상후 혈관내피세포의 재. 상후 재협착 생성과정에도 중요한 위치를 차지하고 있다.. 생이 손상의 양쪽 말단에서부터 이루어져 들어온다는 기. 혈관내피세포 제거 후 eNOS와 iNOS의 발현 양상을 각. 존의 보고와 잘 일치하는 소견이다.25) 염색을 시행한 모. 각 관찰한 보고들은 있으나, 혈관 손상 후 중요한 역할. 든 백서에서 거의 동일한 소견을 보여 손상 정도나 혈관. 을 할 NOS 아형의 발현 양상을 동일한 실험 조건에서. 내피세포의 회복 속도가 일정할 것으로 생각되었다. 최. 동시에 관찰한 경우는 없다.. 근 blood 내의 endothelial progenitor cell도 recruit되. 방 법：. 는 것으로 알려져 있어 이것의 역할에 대해서는 추가 연 구가 필요할 수 있다. 이 연구의 제한점으로는 eNOS와 nNOS mRNA의 발. 웅성 Sprague-Dawley rat(n＝40)의 경동맥 풍선 손상 후 1, 3, 5, 7, 14, 21, 28일 후에 eNOS, iNOS, nNOS에 대한 면역조직화학적 염색과 iNOS의 RT-. 현정도에 대한 반정량적인 RT-PCR을 시행하였지만 좋. PCR를 시행하였다.. 은 결과를 얻지 못하였다는 것이다. 또, 혈관내피세포의. 결 과：. 재생 여부를 Evans blue 생체 염색으로 확인하였지만,. iNOS는 혈관 손상 후 1일째부터 발현되기 시작해 3. 전자현미경 검사나 특이 염색을 시행하여 확인하지 못. 일째까지는 중막에서 발현되었으며, 5~7일 이후에는 신. 하였다는 것이다.. 생내막 쪽에서 강하게 발현되었다. 14일 후에는 신생내. 이상의 결과들을 종합하여 분석하여 보면, 혈관내피세. 막 중 혈관내강 부위쪽에서 발현되다가, 3주부터는 소실. 포를 제거하면 eNOS의 발현이 없어지면서 iNOS와. 되었다. eNOS는 혈관 손상 후 3일까지는 발현되지 않다 891.
(9) 가, 5~7일째에 신생내막의 내강쪽에 의심스러운 정도의 발현이 있었다. 2주째에는 혈관내피세포층을 관찰할 수. 9). 없었음에도 불구하고 신생내막의 내강쪽에서 eNOS가 발 현되었다. 4주째에는 형태학적으로 혈관내피세포로 보이. 10). 는 층이 형성되고, 그 층에서 eNOS가 발현되었다. nNOS 는 혈관 손상 후 1일부터 7일까지 중막 부위에서 약하 게 발현되다가 14일부터는 점차적으로 감소하여 28일. 11). 에는 관찰할 수 없었다. iNOS의 RT-PCR 결과에서는 혈관 손상 후 1일째에서는 매우 약하게 발현되었고, 3. 12). 일째부터 확실히 발현되기 시작해 5일과 7일째에 가장 많은 발현을 보였으며 2주까지 발현되다가 21일부터는 발현이 되지 않았다.. 13). 결 론： 혈관내피세포를 제거하면 eNOS의 발현이 없어지면서. 14). iNOS와 nNOS의 발현이 신속히 유도되었다. 혈관내피 세포의 완전한 재생없이도 eNOS의 발현이 수일 후부터 나타나기 시작하고, eNOS의 발현이 증가함에 따라 iNOS. 15). 와 nNOS의 발현이 서서히 감소해가는 소견을 보였다. 16). 중심 단어：Niric oxide synthase；혈관성형술；재협착. 본 연구는 2000년도 한곡의학장학회 연구비의 지원으로 이 루어졌음. * Kim DW and Kwon JS contributed egually to this work.. 17). REFERENCES. 18). 1) Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Nitric oxide: physiol-. 2) 3). 4). 5). 6) 7). 8). ogy, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev 1991;43:109-42. Nathan C, Xie QW. Regulation of biosynthesis of nitric oxide. J Biol Chem 1994;269:13725-8. Hansson GK, Geng YJ, Holm J, Hardhammar P, Wennmalm A, Jennische E. Arterial smooth muscle cells express nitric oxide synthase in response to endothelial injury. J Exp Med 1994;180:733-8. Yan ZQ, Yokota T, Zhang W, Hansson GK. Expression of inducible nitric oxide synthase inhibits platelet adhesion and restores blood flow in the injured artery. Circ Res 1996;79: 38-44. Ignarro LJ. Nitric oxide: a novel signal transduction mechanism for transcellular communication. Hypertension 1990; 16:477-83. Sessa WC. The nitric oxide synthase family of proteins. J Vasc Res 1994;31:131-43. Palmer RM, Ferrige AG, Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature 1987;327:524-6. Geng Y, Hansson GK, Holme E. Interferon-gamma and tumor necrosis factor synergize to induce nitric oxide prod-. 892. 19). 20). 21). 22). 23). uction and inhibit mitochondrial respiration in vascular smooth muscle cells. Circ Res 1992;71:1268-76. Kanno K, Hirata Y, Imai T, Marumo F. Induction of nitric oxide synthase gene by interleukin in vascular smooth muscle cells. Hypertension 1993;22:34-9. Boulanger CM, Heymes C, Benessiano J, Geske RS, Levy BI, Vanhoutte PM. Neuronal nitric oxide synthase is expressed in rat vascular smooth muscle cells: activation by angiotensin II in hypertension. Circ Res 1998;83:1271-8. Reidy MA, Fingerle J, Lindner V. Factors controlling the development of arterial lesions after injury. Circulation 1992;86:III43-6. Gonzalez-Fernandez F, Lopez-Farre A, Rodriguez-Feo JA, Farre J, Guerra J, Fortes J, Millas I, Garcia-Duran M, Rico L, Mata P, de Miguel LS, Casado S. Expression of inducible nitric oxide synthase after endothelial denudation of the rat carotid artery: role of platelets. Circ Res 1998;83:1080-7. Joly GA, Schini VB, Vanhoutte PM. Balloon injury and interleukin-1 induce nitric oxide synthase activity in rat carotid arteries. Circ Res 1992;71:331-8. Hansson GK, Geng YJ, Holm J, Hardhammar P, Wennmalm A, Jennische E. Arterial smooth muscle cells express nitric oxide synthase in response to endothelial injury. J Exp Med 1994;180:733-8. Picard P, Smith PJ, Monge JC, Stewart DJ. Expression of endothelial factors after arterial injury in the rat. J Cardiovasc Pharmacol 1998;31(Suppl 1):S323-7. Lopez-Farre A, Mosquera JR, de Miguel LS, Millas I, de Frutos T, Monton M, Sierra MP, Riesco A, Casado S. Endothelial cells inhibit NO generation by vascular smooth muscle cells: role of transforming growth factor-β. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1996;16:1263-8. de Graaf JC, Banga JD, Moncada S, Palmer RM, de Groot PG, Sixma JJ. Nitric oxide functions as an inhibitor of platelet adhesion under flow conditions. Circulation 1992;85: 2284-90. de Caterina R, Libby P, Peng HB, Thannickal VJ, Rajavashisth TB, Gimbrone MA Jr, Shin WS, Liao JK. Nitric oxide decreases cytokine-induced endothelial activation: nitric oxide selectively reduces endothelial expression of adhesion molecules and proinflammatory cytokines. J Clin Invest 1995;96:60-8. Draijer R, Atsma DE, van der Laarse A, van Hinsbergh VW. cGMP and nitric oxide modulate thrombin-induced endothelial permeability: regulation via different pathways in human aortic and umbilical vein endothelial cells. Circ Res 1995;76:199-208. Lopez-Farre A, Caramelo C, Esteban A, Alberola ML, Millas I, Monton M, Casado S. Effects of aspirin on plateletneutrophil interactions: role of nitric oxide and endothelin-1. Circulation 1995;91:2080-8. Kubes P, Suzuki M, Granger DN. Nitric oxide: an endogenous modulator of leukocyte adhesion. Proc Natl Acad Sci U S A 1991;88:4651-5. Trachtman H, Futterweit S, Singhal P. Nitric oxide modulates the synthesis of extracellular matrix proteins in cultured rat mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 1995; 207:120-5. Garg UC, Hassid A. Nitric oxide-generating vasodilators and 8-bromo-cyclic guanosine monophosphate inhibit mito-. Korean Circulation J 2002; 32(10):884-893.
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수치
관련 문서
