인간 슬관절 활액막의 신경 섬유들의 면역조직화학적 시범

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Volume 10, Number 1, April, 2007

인간 슬관절 활액막의 신경 섬유들의 면역조직화학적 시범

원광대학교 의과대학 정형외과학교실, 병리학교실*

김영진∙김태균∙양환덕∙김형준∙조향정*∙위대한∙이지완

= Abstract =

Immunohistochemical Demonstration of Nerve Fibers of the Human Knee Synovium

Yeung Jin Kim, M.D., Tae Kyun Kim, M.D., Hwan Deok Yang, M.D., Hyung Joon Kim, M.D., Hyang Jung Cho, M.D.*, Dae Han Wie, M.D., Ji Wan Lee, M.D.

Department of Orthopaedics Surgery, Pathology*, College of Medicine, Wonkwang University Hospital

Purpose: To demonstrate the presence of nerve fibers including nociceptive fibers in synovium of human knee joint using immunohistochemistry.

Materials and Methods: 10 Synovial membrane tissues of knee joint obtained from 5 cadavers were ana- lyzed immunohistochemically using antibodies to protein gene product 9.5, βIII-tubulin, substance P and calcitonin gene-related peptide (CGRP).

Results: Many nerve fibers immunoreactive for protein gene product 9.5 and βIII-tubulin were demonstrat- ed in synovial folds of human knee joints. Also, immunostaining showed the presence of free nerve ending fibers immunoreactive for substance P and calcitonin gene-related peptide in synovium.

Conclusion: The presence of putative nerve fibers including nociceptive fibers in synovial folds supports a possible role for theses structures as source of knee joint pain.

Key Words: Knee, Synovium, Immunohistochemistry

※ 통신저자: 양 환 덕

전라북도 익산시 신용동 344-2 원광대학교 의과대학 정형외과학교실

TEL: 063) 472-5100 FAX: 063) 472-5104 E-mail: [email protected]

� 본 논문은 2007년도 원광대학교 연구지원에 의해서 연구되었음.

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서 론

슬관절은 인체에서 가장 중요한 관절의 하나로 서 체중부하가 많고, 외상의 병력 없이 종창과 동 통이 많이 발생하는 관절이다. 또한 골 구조상 불 안정하면서도 외력을 받기 쉬운 위치에 존재하므 로 가장 손상받기 쉬운 관절이다. 따라서 임상적 으로 슬관절의 동통을 호소하는 환자가 매우 많지 만 슬관절의 동통의 기전이나 원인이 확실하지 않 아서 슬관절 주위에 분포하는 감각 신경 섬유, 즉 동통 신경 섬유와 고유 감각 신경 섬유의 분포, 그리고 이들에 대한 이해가 절실하게 요구된다.

슬관절내에 위치하면서 슬관절의 안정성을 유지 하는데 중요한 역할을 하고 있는 구조물인 전방십 자인대와 후방십자인대, 반월상 연골판에 감각 신 경 섬유가 분포되어 있는지에 대해서는 이미 여러 연구에서 기계적 수용기외의 감각 신경이 분포되 어 있다고 보고되고 있다1,2,9,11,14)

. 그러나 슬관절 동통을 호소하는 대부분의 환자들에서 슬관절 종 창이 동반되며, 이것은 비후된 활액막에 의해서 발생된 것이므로 슬관절 동통과 활액막과는 많은 관계가 있으리라 사료되지만 아직 인간의 활액막 에 감각 신경이 있는지의 여부에 대해서는 연구된 바가 없다.

이에 본 저자 등은 인간 슬관절 활액막이 슬관 절 통증의 원인이 되는지가 불분명하여, Horse- radish peroxidase (HRP) polymer 방법을 이 용하여 슬관절 활액막내에 통각 수용기를 포함한 신경 섬유들이 존재하는지에 대해서 연구해 보고 자 하였다. 활액막의 전체 신경 지배에 대해서는 protein gene product (PGP) 9.5와 β III- tubulin의 항체를 이용하였고, 감각 신경에 대해 서는 통증 전달에 관여하는 일차 감각 신경 세포 내에 존재하는 신경펩티드인 substance P와 calcitonin gene-related peptide (CGRP)을 이용하였다.

대상 및 방법

실험 재료는 슬관절의 상태가 양호한 5구의 시 신에서 양측 슬관절의 활액막을 10개 채취하였 고, 평균 나이는 55.7세(49~64세)이었으며, 남

자가 3례, 여자가 2례이었다.

채취한 조직을 18~24시간 Zamboni’s fixa- tive에 담근 후에 0.1 M phosphate buffered saline (PBS)내에 12~24시간 보관하였다. 면역 조직화학 염색은 Horseradish peroxidase (HRP) polymer 방법을 이용하였으며, 일차 항 체로는 protein gene product (PGP) 9.5 (1:50 dilution; Neomarkers, Fremont, CA, USA), βIII-tubulin (1:50 dilution; Chemi- con, Temecula, CA, USA), substance P (1:100 dilution; Zymed, South San Fran- cisco, CA, USA) 그리고 Calcitonin gene- related peptide (CGRP) (1:100 dilution;

Abcam, Cambridge, CB40FW, UK)을 이용 하였다. 염색 방법은 통상적인 포르말린 고정과 탈회 과정을 거쳐 파라핀에 표매하고 조직 절편을 4 μm으로 자른 후 dry oven에 58。C에서 1시간 이상 가열 처리한 후에 실온에서 식힌 다음 탈 파 라핀 및 수세 과정을 거친 후, 항원성 부활을 위 하여 pH 6.0 citrate buffer가 담겨진 압력솥 (cooker)에 받침유리(slide)를 넣은 다음 마이크 로파에서 100。C에서 15분간 끓인 다음 실온에서 5분간 식혔다(이 과정은 PGP 9.5와 βIII-tubu- lin인 경우에 시행하고 다른 일차 항체에 대해서 는 생략하였다). Hydrogen Peroxidase Block 을 45。C에서 15분간 배양 후에 Tris Buffered saline plus Tween 20에 5회 정도 세척을 시행 하였다. 일차 항체 Protein gene product 9.5, βIII-tubulin, S-100 protein, Substance P, Calcitonin gene-related peptide (CGRP)를 4。C에서 하룻밤 동안 놓아 둔 후에 다음 날 실온 에 30분 정도 둔 후, Tris Buffered saline plus Tween 20에 5회 정도 세척을 시행하였다.

Super Picture HRP polymer Conjugated Broad Spectrum으로 25분 정도 배양을 시행 한 후에 Tris Buffered saline plus Tween 20 에 5회 정도 세척을 시행하였다. AEC sing solution으로 45。C에서 20분 정도 배양시킨 후 현미경으로 관찰 후 발색 정도를 결정한 후에 Tris Buffered saline plus Tween 20에 5회 정도 세척한 후 다시 DW에 3회 정도 세척을 시행 하고 핵 염색을 위하여 Gill’s hematoxyline으로

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1분 정도 염색을 시행한 다음 DW에 3회 정도 세 척하였다. Tris Buffered saline plus Tween 20에 1회 정도 세척을 시행 후에 DW에 2회 정 도 세척하고 clear mount로 봉입한 후 70。C에 서 건조를 시행하고 광학 현미경하에 관찰하였 다. 관찰은 40배의 저배율 하에 조직의 균질성의 정도에 따라서 2~3 장소를 선택하고, 200배 시 야에서 신경 조직을 hematoxylin-eosin 염색에 서 관찰하였다.

결 과

슬관절의 활액막은 모든 조직에서 상대적으로

덜 치밀하게 신경이 지배되는 것이 관찰되었다.

신경 섬유 다발들과 각각의 신경 섬유들이 원형 (areolar) 및 지방(adipose) 활액막 모두에서 관 찰되었다. 내층하 활액막에서는 Protein gene product 9.5, β III-tubulin, substance P, calcitonin gene-related peptide (CGRP)에 대한 면역반응을 일으키는 신경 섬유들이 존재하 였고, 세동맥, 세정맥, 모세 혈관 등에 신경 지배 를 하고 있었으며, 이런 신경 섬유들은 활액막 내 층에까지 연결되고 있었다. 활액막 천 층은 substance P, calcitonin gene-related peptide에 대한 면역반응을 일으키는 신경 섬유들이 내막에 존재하는 세포들과 같이 흩뿌려져 있었다.

Fig. 1. PGP 9.5-immunoreactive nerves in the synovial fold of the knee joint. Thin bundles (arrow) and individual fibers are seen. (H-E stain; ×200)

Fig. 2. Perivascular nerve fibers (arrow) stained with βIII-tubulin in the synovial fold of knee joint.

(H-E stain; ×200)

Fig. 3. Substance P immunoreactive nerve fibers (arrow) associated with blood vessel in the synovial fold of knee joint. (H-E stain; ×200)

Fig. 4. Calcitonin gene-related peptide immunoreactive nerves (arrow) in the synovial fold of the knee joint. (H-E stain; ×200)

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Protein gene product 9.5와 βIII-tubulin 에 대한 면역반응하는 많은 신경 섬유들이 활액막 주변에서 관찰되었고(Fig. 1, 2), substance P 와 calcitonin gene-related peptide에 대한 면 역반응을 일으키는 자유신경 섬유들이 또한 관찰 되었다(Fig. 3, 4). 그러나 Protein gene product 9.5는 10개의 블록에서 8개가 면역반응 에 양성 소견을 보였고 βIII-tubulin도 6개에서 양성 소견을 보인 반면, substance P, calcitonin gene-related peptide (CGRP)에 대한 면역반응은 각각 2개로서 적게 발현되었다.

고 찰

슬관절은 인체 내에서 가장 큰 관절이지만, 골 구조와 연부 조직으로 보아서 매우 불안정한 관절 이다. 즉 비교적 편평한 경골 상단 관절 면에 둥 근 모양인 대퇴과의 관절 면이 접촉하여 골 구조 상 매우 불안정하며, 따라서 슬관절 안정성은 주 위 인대나 근육들에 의하여 유지되고 있다.

슬관절의 동통은 연령이나 성별의 차이 없이 나 타나는 흔한 근 골격계 증상으로서, 슬부의 동통 을 야기하는 기전으로 여러 가지 이론이 제시되고 있으나 아직 불명확하다¹⁷⁾. 그러나 슬관절 감각은 신경계의 지배를 받기 때문에 슬관절 주위에 분포 하는 동통 신경 섬유와 고유 감각 신경 섬유의 분 포에 대한 지식은 슬관절 동통의 치료와 관리에 중요한 자료를 제시하여 준다고 생각한다^3,4,7,15).

지금까지 관절 조직의 신경 지배에 대한 연구는 주로 고식적인 도금법, 도은법을 이용하여 수초성 신경 섬유와 신경 종말에 대한 연구가 시행되었으 나¹⁾, 이 방법은 염색이 된 신경 섬유와 신경 종말 의 해부학적 구조를 잘 관찰할 수 있는 장점이 있 지만, 염색이 일치하지 않고 어느 신경 섬유가 염 색될지 모르며, 반복 실험하기가 어렵고, 또한 인 대의 섬유성 조직과 탄력 조직도 염색될 수가 있 는 단점이 있다. 또한 많은 해부학 및 정형외과 학자들에 의해 사람의 슬관절에 대한 골, 인대, 혈관 등의 해부학적 소견은 많이 연구되었지만, 슬관절 주위의 신경 구조물의 해부학적, 기능적 중요성은 무시되어 왔다.

사람의 슬관절 신경 지배는 후방 관절 신경과

폐쇄 신경이 속하는 후방 집단과, 대퇴 신경, 총 비골 신경, 복재 신경이 속하는 전방 집단의 2개 의 집단으로 나누어서 설명하는데⁷⁾, 이 중 가장 큰 신경은 후방 집단인 경골 신경의 후 관절 분지 (posterior articular branch of tibial nerve) 로서, 관절 후면을 관통하여 전방십자인대와 후방 십자인대 등에 많은 신경 요소들을 분지하고 있 다. Schenk 등¹²⁾은 비글 개의 후방 슬관절낭의 감각 신경 섬유의 미세 구조와 분포의 양상에 대 해서 연구하였는데, 관절낭의 섬유 층 내와 주변 에서 자유신경종말(free nerve ending)들과 종 말신경소체(Ruffini 소체, 층판소체)들이 관찰되 었고, 자유신경종말들은 섬유 층과 활액막층 사이 의 혈관 주변에 주로 분포하였고, 종말 신경 소체 들도 섬유 층과 후방 인대성 구조물들에서 주로 관찰되었으며, Pacini 소체는 관찰되지 않았다고 보고하였고 또한 특히 근위-내측 부위에 많이 관 찰되었다고 보고하였다.

Marshall 등¹⁰⁾은 고양이(feline)의 슬관절내에 신경펩티드 substance P, calcitonin gene- related peptide (CGRP)에 대해 면역학적 반응 이 일어나는 조직의 분포에 대해서 보고하면서 통 증 신호의 이동 역할로 추정되는 통각 수용 신경 섬유들이 활액막에 존재하여 활액막의 비후가 슬 관절 통증의 하나의 원인으로 볼 수 있다고 보고 하였다. Witonski와 Wagrowska-Danilewicz¹⁶⁾ 는 substance P 항체를 이용한 면역조직화학적 방법으로 정상 전방십자인대와 파열된 전방십자인 대에 대한 통각 수용기 신경 섬유 검사에서 정상 측에서는 근위부와 중간부, 원위부가 동일하게 존 재하였으나, 파열된 전방십자인대에서는 손상 이 후 4개월까지는 근위부에 월등히 많이 존재하다가 5개월 이후 12개월까지 현저히 감소되는 것을 확 인하고, 손상 이후 1개월에서 4개월째에 신경학 적 염증 반응이 일어나고 있다는 것을 면역조직화 학적 방법으로 증명하였다. Gronbald 등⁶⁾은 토 끼의 내측 측부인대를 파열시키고 봉합을 시행한 군과 봉합을 시행하지 않은 군에 대해서 신경펩티 드 substance P, calcitonin gene-related peptide (CGRP)와 galanin을 이용하여 면역조 직화학적 검사를 시행한 결과 봉합을 시행한 군에 서 훨씬 월등하게 신경펩티드 신경들이 많이 관찰

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되었고, 이는 파열된 인대의 봉합이 국소 신경 재 생에 이점이 있다는 것을 증명하였다. 또한 Gronbald 등⁵⁾은 류마티스 관절염과 퇴행성 골관 절염의 환자에서 채취한 활액막내의 신경펩티드의 검사에서 류마티스 관절염의 환자에서 신경 미세 섬유 항혈청으로 염색되는 신경종말들이 골관절염 환자에 비해서 부족하였고, 또한 신경펩티드의 염 색도 약하다고 보고하면서, 이런 신경학적 염증 반응이 류마티스 관절염에 어느 정도 역할을 하 고, 또한 매개체를 분비하는 역할이 있을 것이라 고 보고하였다. 또한 Mapp 등⁸⁾도 5개의 정상 활 액막 조직과 5개의 류마티스 환자의 활액막 조직 에 대해서 지각신경에는 substance P와 calcitonin gene-related peptide (CGRP)의 항혈청 을 이용하였고, 자율신경의 분포를 위한 검사에는 C-flanking peptide의 항혈청을 이용한 신경펩 티드-면역반응 섬유질 검사에서 정상 조직에서는 전 층에서 풍부한 신경종말들이 관찰되었으나, 류 마티스 관절염 환자에서는 천 층과 내막 세포층에 서는 관찰할 수 없었고 심층에는 비교적 부족한 신경섬유들이 관찰되었고 보고하였고, Pereira da Silva와 Carmo-Fonseca¹³⁾도 유사한 내용을 보고하였다.

결 론

슬관절의 활액막에 Protein gene product 9.5, βIII-tubulin, substance P, calcitonin gene-related peptide (CGRP) 항체를 이용한 면역조직화학적 검사에서 활액막은 상기 항체에 면역반응을 일으키는 작은 직경의 신경에 의해 지 배되는 것을 알았고, 또한 substance P, CGRP 항체에 면역반응이 일어나는 신경이 존재하는 점 을 고려 시에 활액막 비후가 슬관절 통증의 원인 으로서 가능성이 있음을 알 수 있다.

REFERENCES

01) Boyd IA: The histological structure of the recep- tors in the knee-joint of the cat correlated with their physiological response. J Physiol, 124: 476- 488, 1954.

02) Del Valle ME, Harwin SF, Maestro A, Murcia A and Vega JA: Immunohistochemical analysis of mechanoreceptors in the human posterior cruciate ligament: a demonstration of its propriocep- tive role and clinical relevance. J Arthroplasty, 13: 916-922, 1998.

03) Elfvin LG, Holmberg K, Johansson J and Aldskogius H: The innervation of the synovium of the knee joint in the guinea pig: an immuno- histochemical and ultrastructural study. Anat Embryol (Berl), 197: 293-303, 1998.

04) Fairbank JC, Pynsent PB, van Poortvliet JA and Phillips H: Mechanical factors in the inci- dence of knee pain in adolescents and young adults. J Bone Joint Surg, 66(B): 685-693, 1984.

05) Gronbald M, Konttinen YT, Korkala O, Liesi P, Hukkanen M and Polak JM: Neuropeptides in synovium of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. J Rheumatol, 15: 1807-1810, 1988.

06) Gronbald M, Korkala O, Konttinen YT, Kuokkanen H and Liesi P: Immunoreactive neuropeptides in nerves in ligamentous tissue.

An experimental neuroimmunohistochemical study. Clin Orthop Relat Res, 265: 291-296, 1991.

07) Kennedy JC, Alexander IJ and Hayes KC:

Nerve supply of the human knee and its function- al importance. Am J Sports Med, 10: 329-335, 1982.

08) Mapp PI, Kidd BL, Gibson SJ, et al.: Sub- stance P-, calcitonin gene-related peptide- and C- flanking peptide of neuropeptide Y-immunoreactive fibers are present in normal synovium but depleted in patients with rheumatoid arthritis.

Neuroscience, 37: 143-153, 1990.

09) Marinozzi G, Ferrante F, Gaudio E, Ricci A and Amenta F: Intrinsic innervation of the rat knee joint articular capsule and ligaments. Acta Anat, 141: 8-14, 1991.

10) Marshall KW, Theriault E and Homonko DA:

Distribution of Substance-P and calcitonin gene

(6)

related peptide immunoreactivity in the normal feline knee. J Rheumatol, 21: 883-889, 1994.

11) Mine T, Kimura M, Sakka A and Kawai S:

Innervation of nociceptors in the menisci of the knee joint: an immunohistochemical study. Arch Orthop Trauma Surg, 120: 201-204, 2000.

12) Pereira da Silva JA and Carmo-Fonseca M:

Peptide containing nerves in human synovium:

immunohistochemical evidence for decreased innervation in rheumatoid arthritis. J Rheumatol, 17: 1592-1599, 1990.

13) Schenk I, Spaethe A and Halata Z: The struc- ture of sensory nerve endings in the knee joint capsule of the dog. Ann Anat, 178: 515-521, 1996.

14) Schultz RA, Miller DC, Kerr CS and Micheli L: Mechanoreceptors in human cruciate liga- ments. A histological study. J Bone Joint Surg,

66(B): 1072-1076, 1984.

15) Villar MJ, Wiesenfeld-Hallin Z, Xu XJ, Theodorsson E, Emson PC and Hokfelt T:

Further studies on galanin-, substance P-, and CGRP-like immunoreactivities in primary sensory neurons and spinal cord: effects of dorsal rhi- zotomies and sciatic nerve lesions. Exp Neurol, 112: 29-39, 1991.

16) Witonski D and Wagrowska-Danilewicz M:

Distribution of substance-P nerve fibers in intact and ruptured human anterior cruciate ligament: a semi-quantitative immunohistochemical assess- ment. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc, 12:

497-502, 2004.

17) Wojtys EM, Beaman DN, Glover RA and Janda D: Innervation of the human knee joint by substance-P fibers. Arthroscopy, 6: 254-263, 1990.