The cyanobacterium Aphanizomenon gracile was sampled from the brackish water at Gangsuji Seosan-si, Chungcheongnam-do, Republic of Korea. The trichomes of A. gracile were free-floating and solitary. The akinetes were cylindrical with rounded ends, existed alone or rarely in pairs, and were distributed 1~7 cells away from heterocyte. The most distinguishing feature of A.
gracile was the cup-shaped sheath at both ends of the akinete, which was open towards adjacent vegetative cells. Using unialgal cultured 4 strains, the cup-shaped sheaths at both ends of the akinete were induced under shaking culture with BG-11 medium diluted 1 × 10
-1. In the phylogenetic analyses using 16S rRNA and rpoB genes, the Korean A. gracile strains formed the same clade with the previously reported A. gracile. Their genetic similarities were high as 98.5~99.9%. Therefore, the Aphanizomenon strains were identified and reported as A. gracile, which was an unrecorded species from Korea.
Keywords: Aphanizomenon gracile, brackish water, cyanobacteria, newly recorded species
담수 생태계의 심각한 부영양화는 녹조현상을 오랫동안 지 속시킬 수 있으며(Ma et al., 2015), 전 세계는 남세균의 대발생 으로 인해 온대호수의 관리에서 많은 어려움을 겪고 있다 (Pitois et al., 2000). 남세균의 2차 대사산물인 간독소 및 신경 독소 물질의 생산으로 인해 담수 생태계뿐만 아니라 야생동물 과 인간의 건강에도 심각한 영향을 줄 수 있고, 일부 경우에는 사망에 이르게 할 수 있다(Carmichael and Falconer, 1993; Cox et al., 2003; Huisman et al., 2005).
남세균의 대발생 중 Aphanizomenon은 휴면포자(akinete) 와 이형세포(heterocyte)를 형성하기 때문에 불리한 생태적 환 경에서 다른 남세균에 비해 높은 생존 경쟁력을 가지고 있다 (Komárek, 2013). 세계적인 연구에서 Aphanizomenon에 속하 는 분류군은 마비성 패류독, 아나톡신-a, 실린드로스퍼몹신, 삭시톡신 등을 생산하는 것으로 알려져 있다(Pereira et al., 2000; Paerl and Huisman, 2009; Ballot et al., 2010). 특히 일부 A. gracile Lemmermann은 강력한 신경 독소인 삭시톡신, 실 린드로스퍼몹신을 생성한다(Paerl and Huisman, 2009; Casero et al., 2014). 따라서 독소생성의 여부 및 Aphanizomenon 분 류군의 정확한 동정은 향후 녹조현상의 출현시기 및 빈도를 파악하는데 중요하다(Yamamoto and Nakahara, 2009).
이형세포를 가지는 남세균의 분류는 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초하여, 다른 남세균들 사이에서 단계통군
기수역 출현 Aphanizomenon gracile (Nostocales, Cyanobacteria)의 국내 미기록종에 대한 연구
이남주1 ･ 윤성로1 ･ 최혜정2 ･ 기장서2* ･ 이옥민1*
1경기대학교 생명과학과, 2상명대학교 생명공학과
Aphanizomenon gracile (Nostocales, Cyanobacteria), a Korean newly recorded species from brackish water
Nam-Ju Lee1 , Sung-Ro Yoon1 , Hye Jeong Choi2 , Jang-Seu Ki2* , and Ok-Min Lee1*
1Department of Life Science, College of Natural Science, Kyonggi University, Suwon 16227, Republic of Korea
2Department of Biotechnology, Sangmyung University, Seoul 03016, Republic of Korea
(Received July 3, 2020; Revised July 29, 2020; Accepted July 30, 2020)
*For correspondence. (J.S. Ki) E-mail: [email protected];
Tel.: +82-2-2287-5449; Fax: +82-2-2287-0070 / (O.M. Lee) E-mail: [email protected];
Tel.: +82-31-249-9643; Fax: +82-31-241-0860
(monophyletic)으로 지속적인 분류가 되었다(Wilmotte, 1994;
Lyra et al., 2001). 그러나 구슬말목(Nostocales)에 속하는 Aphanizomenon과 Anabaena가 계통발생학적 및 형태학적 연 구에서 혼합되어 나타났다(Rajaniemi et al., 2005). 또한 최근 Aphanizomenon은 생태, 형태, 계통발생 등 다상학적 접근법 (polyphasic approach) 연구에 의해 Anabaena, Cuspidothrix, Sphaerospermopsis, Chrysosporum 등 다양한 분류군과 관련되 어 있으며, 분류법이 계속 개정되고 있다(Cirés and Ballot, 2016;
Komárek, 2016). 이러한 연구를 바탕으로 현재 Aphanizomenon 은 전 세계적으로 22개 분류군이 보고되었고(Guiry and Guiry, 2020), 국내에는 3종이 보고되어 있으며(Ryu et al., 2017), 세 계적인 종수와 분포에 비해 국내 Aphanizomenon에 대한 연구 는 매우 미흡한 상황이다.
최근 국내 연구에서는 낙동강에서 채집된 시료로부터 세 포사, 이형세포, 휴면포자 등 형태학적 특징을 기반으로 A.
klebahnii Elenkin ex Pechar, A. skujae Komárková-Legnerová and Cronberg, Cuspidothrix issatschenkoi (Usachev) Rajaniemi, Komárek, Willame, Hrouzek, Kastovská, Hoffmann and Sivonen 가 국내 미기록속 및 종으로 최초로 보고되었다(Ryu et al., 2017).
또한 녹조현상이 빈번한 대청호에서 채집한 시료로부터 cpcB 와 cpcA 유전자 사이의 공간인 cpcBA IGS영역을 분석하여, 남 세균(Microcystis, Aphanizomenon, Anabaena, Pseudanabaena, Planktothrix)의 다양성을 분석한 바 있다(Kim et al., 2006).
국외 연구에서는 Aphanizomenon aphanizomenodes (Forti) Hortobágyi and Komárek을 대상으로 형태적 동정과 16S rRNA 유전자 염기서열 및 HPLC (high-performance liquid chromatography)를 이용하여 생산되는 유기화합물을 비교 하였으며, 새로운 속인 Sphaerospermum으로 이명 되었다 (Zapomělová et al., 2009). 또한 Otaño (2012)은 아르헨티나의 저수지에서 휴면포자의 형태와 말단세포의 크기 및 모양을 비 교하여 형태학적 특성에 기초한 A. favaloroi Otaño를 신종으 로 명명한 바 있다.
본 연구에서 Aphanizomenon에 속하는 분류군을 국내 충청 남도 서산에 위치한 강수지의 기수역으로부터 채집하였고, 단 일배양을 실시하였다. 종 동정을 위하여 휴면포자 및 컵 모양 의 점액질 막을 유도하여 세포의 형태적 형질을 관찰하였다.
또한 16S rRNA 및 RNA polymerase β-subunit (rpoB) 유전자 를 사용하여 Aphanizomenon의 다른 종과의 분자계통분석을 실시하였다. 이를 통하여 A. gracile을 국내 미기록종을 밝히 는 연구를 수행하였다.
재료 및 방법
채집지 및 채집방법
본 연구의 시료는 2019년 4월에 충청남도 서산에 위치한 강 수지의 기수역에서 채집되었다(36°44'25.0"N, 126°22'13.4"E).
부유성 남세균의 채집은 망목의 직경이 25 µm인 플랑크톤네 트를 사용하였다(Sournia, 1978). 채집된 시료들은 현장에서 밀봉 후, 4°C의 아이스박스에 보관하여 실험실로 운반되었다.
실내배양
단일배양을 위해 광학현미경 하에서 파스퇴르 피펫을 이용 하여 1개의 사상체(trichome)를 분리하여 24-well plate (SPL) 에 넣어 분리하였다. 24-well plate에서 1~2주간 배양 후, 오염 여부를 확인하고, 단일배양된 사상체를 50 ml cell culture flask (SPL)에 옮겨 대량배양을 실시하였다. 단일배양 및 대량배양 을 위해 BG-11 배지(Stanier et al., 1971)를 사용하였다. 실내 배양은 20~25°C, 명암 주기 16 h: 8 h, 조도는 25 µmol/m
2s의 조건 하에서 실시되었다. 또한 휴면포자와 컵 모양의 점액질 막을 유도하기 위해 대량배양 과정에서 BG-11의 1 × 10
-1로 희 석된 빈영양배지를 사용하였고, 진탕 배양을 진행하였다. 단 일배양된 배양주 4주는 경기대학교 소재 조류배양실(Algal Culture of Kyonggi University, ACKU)에서 배양하고, 국립낙 동강생물자원관에 기탁하였다(FBCC-A231, FBCC-A232, FBCC- A233, FBCC-A274).
형태관찰
본 연구에서는 채집된 분류군의 생체시료를 3일 이내에 광 학현미경(Axio Imager A2; Olympus BX53)을 이용하여 100~
1,000 배율로 관찰하였고, 1,000배 하에서 사진을 촬영하였다 (AxioCam HRC camera; an Olympus UC-90).
남세균의 분류체계는 Komárek 등(2014)에 따랐고, AlgaeBase 를 참조하였다(Guiry and Guiry, 2020). 또한 남세균의 동정에 는 Lemmermann (1907), Komárek과 Komárková (2006) 그리 고 Komárek (2013)의 기재문을 참조하였다.
DNA 추출
Aphanizomenon gracile의 세포를 3,000 rpm 속도로 10분 동안 원심 분리하여 회수하였다. 농축된 세포를 100 μl 1 × TE buffer (10 mM Tris-HCl; pH 8.0, 1 mM EDTA)에 희석한 후, DNA를 추출하기 전까지 -20°C의 조건에서 냉동 보관하였다.
이후 genomic DNA (gDNA)는 Richards 등(2003)에 제시되어
있는 cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 방법으로 추 출하였다.
효소중합연쇄반응(PCR) 및 DNA 시퀀싱
국내 A. gracile의 유전자 염기서열을 확보하기 위해 남세균 특이적 프라이머를 이용하여, 16S rRNA와 rpoB 유전자를 대 상으로 PCR을 수행하였다. 16S rRNA 구간의 프라이머는 CYA106F (5'-CGGACGGGTGAGTAACGCGTGA-3') (Nübel et al., 1997)와 16S CYR (5'-CTTCAYGYAGGCGAGTTGC AGC-3') (Urbach et al., 1992)이며, rpoB 프라이머는 CY-rpoB 550Fa (5'-CGAGGAGCTTGGTTAAAATTTGAAAC-3')와 CY-rpoB R2013 (5'-GCGTCTTCGTAGTTATAGCCTTCC CA-3')이다. PCR 반응은 gDNA 2 μl, 2 μl의 10 × PCR Buffer (TaKaRa), 2 μl의 dNTP mix (각 4 mM), 0.1 μl의 EX Taq (2.5 U), 10 pmole 프라이머 각 1 μl를 사용하여 i-Cycler (Bio-Rad) 에서 실시하였다. 두 유전자의 PCR 반응조건은 초기 변성과 정으로 94°C, 5분간 DNA를 변성시키고, 94°C 20초, 55°C 30 초, 72°C 90초의 연속 과정을 35회 반복한 후, 마지막 단계로 72°C에서 10분 동안 최종 연장 과정을 거쳐 PCR 반응을 종결 하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 겔에서 전기영동하 여 관찰하였다.
DNA 시퀀싱은 PCR 산물을 QIAquick PCR purification kit (Qiagen GmbH)로 정제하여, PCR 프라이머(CYA106F, 16S CYR, CY-rpoB 550Fa, CY-rpoB R2013, 시퀀스-walking 프라이 머)와 ABI PRISM® BigDye
TMTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (PE Biosystems)를 이용하여 실시하였다.
DNA 시퀀싱 단편은 자동 DNA 분석기(Model 3700, Applied Biosystems)로 분석하였다. 각각의 배양주로부터 얻은 염기서 열은 Sequencher 4.1.4 (Gene Codes)를 이용하여 염기서열을 정 렬하였으며, 정렬된 염기서열은 NCBI GenBank에 등록하였다.
염기서열 유사도, 유전학적 거리, 계통분석
국내 A. gracile 배양주의 16S rRNA 및 rpoB 유전자의 염기 서열 유사도(DNA similarity)와 유전학적 거리(genetic distance) 를 분석하였다. 본 연구에서 규명한 염기서열과 GenBank로부 터 얻은 근연종들의 염기서열로 데이터 세트를 만든 후, BioEdit v.7.1.3 (Hall, 1999)을 통해 염기서열을 정렬(alignment)하여, 같은 길이가 되도록 양 끝을 제거하였다. 이후 BioEdit을 이용 하여 염기서열 유사도를 계산하고, MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016)에서 Kimura 2-parameter 모델을 이용하여 유전학적 거 리를 계산하였다.
국내 A. gracile 배양주 4주와 근연종의 16S rRNA 및 rpoB
유전자 염기서열을 이용하여, Maximum-Likelihood (ML)와 Neighbor-Joining (NJ) 계통분석을 실시하였다. ML 계통도는 General Time Reversible (GTR) 모델로 MEGA 7.O에서 추정 하였으며, 1,000회 반복 분석을 통해 bootstrap 값을 산정하였 다. 같은 데이터로 NJ 계통도를 추정하였다.
결 과
본 연구에서는 2019년 4월에 충청남도 서산에 위치한 강수 지의 기수역에서 Aphanizomenon gracile을 채집하였다. 종 동 정은 군체 및 세포의 형태적 특징을 사용하였으며, 이를 통하 여 A. gracile로 동정 되었다. 이들 A. gracile 배양주의 16S rRNA와 rpoB 유전자 분석을 통해 기존에 보고된 A. gracile과 유전학적으로 일치하는 것을 확인하였다. 본 연구의 A. gracile 은 국내 미기록종으로 추가되었으며, 따라서 현재까지 보고된 국내 Aphanizomenon은 총 4종이다.
형태적 특징
Family Aphanizomenonaceae Elenkin
Genus Aphanizomenon Morren ex Bornet & Flahault 1888 Aphanizomenon gracile Lemmermann 1907 (Fig. 1)
Synonyms: Anabaena flosaquae var. gracilis Lemmermann 1898 Aphanizomenon flosaquae var. gracile Lemmermann 1898 Aphanizomenon flosaquae f. gracile (Lemmermann) Elenkin 1938
사상체는 단독으로 부유하고, 직선형, 아치형, 나선형으로 나타나며, 세포 간 격벽은 뚜렷하게 함입되어 있고, 말단으로 갈수록 약간 좁아진다. 세포는 원통형에서 통 모양으로 길이 가 폭과 같거나 크다. 세포의 내부에는 가스 소포(aerotopes) 가 불규칙하게 나타난다. 말단세포는 둥근 모양으로, 약간 신 장되어 있고 좁아진다. 이형세포는 영양세포(vegetative cell) 의 사이에서 단독으로 나타난다. 휴면포자는 끝이 둥근 원통 형으로, 단독으로 존재하거나 드물게 쌍으로 나타나며, 이형 세포로부터 1~7개의 세포간격으로 떨어져서 분포하고, 양 끝 에 인접한 영양세포를 향해 열린 컵 모양 점액질 막(sheaths) 을 형성한다. 세포의 길이는 3.82~5.91 μm이고, 폭은 3.13~4.27 μm, 이형세포의 길이는 3.71~7.54 μm이고, 폭은 3.23~5.14 μm, 휴면포자의 길이는 7.51~25.15 μm이고, 폭은 4.31~7.51 μm 이다.
Ecology: 담수뿐만 아니라 염분이 있는 수역에서도 분포하는 종이다(Lemmermann, 1907).
Distribution: 독일(Täuscher, 2016), 벨기에(Willame et al.,
2006), 체코(Hašler et al., 2007)
Site of collection: 충청남도 서산시 부석면 강수리 563-1 (36°
44'25.0"N,126°22'13.4"E) Date of collection: 2019년 4월 5일
Specimen deposit no.: FBCC-A231, FBCC-A232, FBCC-A233,
FBCC-A274
염기서열 특성 및 분자계통
본 연구에서 분리한 남세균 Aphanizomenon gracile 배양주 4주의 16S rRNA (1,468 bp)와 rpoB (1,181 bp) 유전자 염기서
(A) (B) (C) (D) (E)
(F) (G) (H) (I) (J)
Fig. 1. Microscopic photographs of Aphanizomenon gracile (FBCC-A231) collected from Gangsu-ri in Korea. (A and B) Solitary trichome and akinete (ak)
separated by vegetative cells and heterocyte (hc), (C) Intercalary heterocyte, (D and F) Gradually narrows towards the end cell, (E) Rounded apical cell, (G~J)
Akinetes with the cup-shaped sheath (arrow) at the poles. Scale bars represent 10 μm.
Fig. 2. A Neighbor-Joining (NJ) tree constructed with 16S rRNA gene sequences (1,255 bp) of Korean Aphanizomenon gracile and other relatives
Aphanizomenon and Dolichospermum, Cuspidothrix, Chrysosporum, and Sphaerospermopsis. Gloeobacter violaceus was used as the outgroup. Additional
Maximum-Likelihood (ML) tree generated similar topology of the NJ, and thus its bootstrap values were incorporated into the NJ tree. Branch lengths are
proportional to the scale given. Box in gray represents the Korean A. gracile.
열을 각각 규명하여, NCBI 유전자은행에 등록하였다(GenBank accession numbers MT443967-70; MT447737-40). 이들 배양 주 4주는 모두 같은 염기서열을 갖는 것으로 파악되었다.
Aphanizomenon과 근연 분류군의 16S rRNA 분자계통분 석에서, 국내 A. gracile 배양주는 A. gracile SAG 31.79 (KM 019948)와 같은 분계를 형성하였으며, 이들은 기존에 보고된 A. gracile 배양주(HEANEY Camb 1986 140 1/1 외 10개)와 유사한 계통관계를 보였다(Fig. 2). 전체적으로 모든 A. gracile
는 동일한 분계를 형성하여 A. flosaquae Ralfs ex Bornet and Flahault와 명확하게 다른 분계로 분리되었다.
Aphanizomenon의 16S rRNA 염기서열 유사도와 유전학적 거리 분석에서, 국내 A. gracile 배양주는 국외 A. gracile과 98.4~99.9% 유사도(또는 0.000~0.007유전거리) 차이를 보였 다. A. flosaquae 배양주와는 98.7~98.8% 유사도(0.008~0.010 유전거리) 차이를 보였다.
추가적인 rpoB 유전자 계통분석에서 국내 A. gracile 배양주
Fig. 3. A Neighbor-Joining (NJ) tree constructed with rpoB gene sequences (335 bp) of Korean Aphanizomenon gracile and other relative Nostocales.
Microcystis sp. was used as the outgroup. Additional Maximum-Likelihood (ML) tree generated similar topology of the NJ, and thus its bootstrap values were
incorporated into the NJ tree. The first and second numbers at the nodes display bootstrap proportions (BP) (> 50%) in ML and NJ, respectively. Branch
lengths are proportional to the scale given. Box in gray represents the Korean A. gracile. Abbreviations: A., Aphanizomenon; C., Cuspidothrix; D.,
Dolichospermum; T., Trichormus; N., Nostoc.
는 A. gracile 1tu26s16과 A. gracile HEANEY Camb 1986 140 1/1과 유사한 계통관계를 보였다(Fig. 3). 이들은 A. flosaquae 및 구슬말목에 속하는 근연 분류군과 명확하게 구분되었다.
고 찰
Aphanizomenon gracile은 Komárek (2013)에 의해 Anabaena /Aphanizomenon-like cluster A로 분류되었다. Type 종인 A.
flosaquae는 사상체 다발을 형성하지만, cluster A의 경우 단일 개체로 존재하는 것이 특징이며, 그 중 A. skujae와 유사하다. 그 러나 A. skujae는 휴면포자 양 끝에 컵 모양의 점액질 막이 없으 며, 사상체의 길이 또한 A. gracile에 비해 매우 길다. 본 연구에 서 채집된 국내 A. gracile은 기존에 보고되어있던 A. gracile의 형태와 일치했으며, 또한 다른 종들과 뚜렷한 차이점인 영양세 포와 휴면포자 사이에 존재하는 컵 모양의 점액질 막이 확인되 었다. Aphanizomenon에 속하는 종 중에서 휴면포자 양 끝에 컵 모양의 점액질 막의 형태를 가지는 종은 A. gracile이 유일하다.
남세균을 동정할 때 16S rRNA 유전자는 종을 분류하는 마 커로 널리 사용되고 있다. 그러나 근연관계가 유사한 일부 분 류군에서는 남세균의 분류 기준인 97.5% 이상의 유사도를 보 여 종을 구분하기 어렵다(Ki, 2010; Choi et al., 2018). 본 연구 의 국내 Aphanizomenon gracile의 16S rRNA 유전자 염기서 열은 기존에 보고된 종과 일치하여 형태적인 분류를 뒷받침 하였으나, 근연 분류군인 A. flosaquae와 Dolichospermum lemmermannii (Richter) Wacklin, Hoffmann and Komárek간 유사도가 98% 이상으로 높아서 16S rRNA 유전자만으로는 불명확할 수도 있다.
반면 Aphanizomenon의 rpoB 유전자 분자계통분석에서 국내 A. gracile 배양주는 다른 종들과 높은 해상도로 분리되 는 것을 확인하였고, 따라서 rpoB 유전자 마커는 16S rRNA 유전자에 비해 종을 더 뚜렷하게 구분하는 것으로 사료된다 (Cheon et al., 2011; Lee et al., 2020). 현재 GenBank에 등록된 Aphanizomenon의 rpoB 유전자 염기서열은 매우 제한적이다.
향후 Aphanizomenon에 속하는 종을 분자적으로 명확히 구분 하기 위해서는 추가 종의 rpoB 염기서열 발굴이 필요하다. 또 한 Aphanizomenon의 정확한 동정과 배양체 확보는 추후 Aphanizomenon의 대발생으로 인한 녹조현상을 해결하기 위 한 연구에 사용될 수 있을 것이다.
적 요
충청남도 서산에 위치한 기수역인 강수지로부터 Aphani- zomenon gracile이 채집되었다. A. gracile은 사상체 다발을 형 성하지 않고, 단독으로 부유하며, 휴면포자는 끝이 둥근 원통 형으로 단독 존재하거나 간혹 쌍으로 나타났고, 이형세포로부 터 1~7개의 세포간격으로 떨어져 분포하였다. 또한 A. gracile 을 구분하는 가장 뚜렷한 특징은 휴면포자 양 끝에 위치한 컵 모양의 점액질 막이 인접한 영양세포를 향해 열려 있는 것으 로, 이와 같은 특징이 관찰되었다. 단일배양된 배양주 4주를 대상으로 휴면포자와 영양세포 사이의 컵 모양의 점액질 막 의 유무를 확인하기 위해 BG-11 배지를 1 × 10
-1로 희석한 빈 영양배지에서 진탕 배양함으로써 이와 같은 특징이 유도되는 것을 관찰하였다. A. gracile 배양주를 이용한 16S rRNA 및 rpoB 유전자 분자계통분석에서 국내 배양주가 기존에 보고 된 A. gracile과 가장 가까운 계통유연관계를 나타냈다. 이상 의 결과를 통하여 A. gracile을 국내 미기록종으로 보고하는 바이다.
감사의 말
본 논문은 정부(환경부)의 재원으로 국립생물자원관(NIBR 2019021140), 국립낙동강생물자원관(NNIBR201902110)과 정부(미래창조과학부)의 재원으로 한국연구재단(No. 2020R 1A2C2013373)과 2020년 경기대학교 대학원 연구원장학생 장학금 지원을 받아 수행되었습니다.
References
