알쯔하이머병 동물모델에서 인간 신경줄기세포의 뇌 이식

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알쯔하이머병 동물모델에서 인간

신경줄기세포의 뇌 이식

연세대학교 대학원

의과학과

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알쯔하이머병 동물모델에서 인간

신경줄기세포의 뇌 이식

연세대학교 대학원

의과학과

(3)

알쯔하이머병 동물모델에서 인간

신경줄기세포의 뇌 이식

지도교수 박 국 인

이 논문을 석사 학위논문으로 제출함

2006년 7월

일

연세대학교 대학원

의과학과

이 일 신

(4)

이일신의 석사 학위논문을 인준함

심사위원

인

심사위원

인

심사위원

인

연세대학교 대학원

2006년 7월

일

(5)

감

감사

사

사의

의

의 글

글

어느덧 2년여의 시간이 흘러 석사를 마치게 되었습니다.

실험모델의 성격상 많은 시간이 걸려서 생각보다 많은 실

험을 수행하지 못한 것이 못내 아쉽게 느껴집니다.하지만

이러한 아쉬움이 더욱 정진할 수 있는 새로운 토대를 만들

었음을 믿어 의심치 않습니다.

항상 부족한 학생이었던 저에게 끊임없는 관심과 지도로

여기까지 이끌어 주신 은사 박국인 교수님께 깊은 감사를

드립니다.마지막까지 걱정과 배려로 무사히 석사를 마치

게 도와주신 이준수 교수님과 김경환 교수님께도 감사의

마음을 드립니다.

실험하면서 힘들 때나 즐거울 때나 같이 있어준 실험실

가족들에게 감사하며 이 기쁨을 나누고 싶습니다.

마지막으로 항상 옆에서 저를 믿으며 묵묵히 바라보고

계신 부모님과 가족들에게 감사드립니다.

2006년 6월

(6)

차 례

국문요약 ……… 1 Ⅰ.서 론 ……… 2 Ⅱ.재료 및 방법 ……… 8 1.알쯔하이머병 동물모델 확립 ……… 8 가.APPsw 형질전환 쥐 ․……… 8 나.유전자형 확인 ……… 8

다.APPsw 형질전환 쥐에서 APP와 Aβ 분포 양상 확인 ……… 10

(1)실험동물의 분석 ……… 10 (2)APP발현과 Aβ분포 ……… 10 2.신경줄기세포 배양 ……… 11 가.인간 신경줄기세포 배양 ……… 11 나.인간 신경줄기세포의 생체 외에서 특성 확립 ……… 12 3.APPsw 모델 및 대조군 동물에 인간 신경줄기세포의 뇌 이식 … 12 가.이식세포 준비 ……… 12 나.동물수술 ……… 13 4.생체 내 이식된 인간 신경줄기세포의 생착,분포,이주 및 분화형태 분석 ……… 14 가.실험동물의 분석 ……… 14 나.생체 내 이식된 줄기세포의 생착,분포 및 이주형태 관찰 … 14 다.생체 내 이식된 신경줄기세포의 분화형태 관찰 ……… 14 5.행동검사 ……… 15 가.Morriswatermazetest……… 15 나.통계처리……… 16

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Ⅲ.결 과 ……… 17 1.알쯔하이머병 동물모델 확립 ……… 17 2.세포배양 및 특성확립……… 21 3.APPsw 형질전환 모델 및 대조군 동물에 인간 신경줄기세포 이식 후 생체 내에서 공여세포의 생착,분포,이주 및 분화형태 ……… 25 가.실험군과 대조군에 이식된 인간 신경줄기세포의 생착,분포 및 이주형태 ……… 25 나.실험군과 대조군에 이식된 인간 신경줄기세포의 분화형태 ……… 29 다.실험군 및 대조군 동물 뇌에서 신경교세포 증식증 (astrogliosis) ……… 32 4.행동검사 ……… 34 Ⅳ.고 찰 ……… 37 Ⅴ.결 론 ……… 41 참고문헌 ……… 42 Abstract……… 48

(8)

그림 차례

그림 1.APPsw 형질전환 쥐의 확립 및 유전자형 ……… 9

그림 2.APPsw 형질전환 쥐의 뇌에서 APP 발현 및 분포

……… 18

그림 3.APPsw 형질전환 쥐의 뇌에서 A

β

와 A

β

1-40/42발

현분포 및 축적 ……… 20

그림 4.인간 신경줄기세포 배양 및 특성 확립 ………… 23

그림 5.APPsw 형질전환 쥐의 뇌에서 이식된 인간 신경줄

기세포의 생착,분포 및 이주 ……… 26

그림 6.APPsw 형질전환 쥐의 뇌 백질을 통한 이식된 인간

신경줄기세포의 이주 ……… 27

그림 7.APPsw 형질전환 쥐의 뇌로 이식된 인간 신경줄기

세포의 분화형태……… 30

그림 8.APPsw 형질전환 동물 및 대조군 동물 뇌에서 신경

교세포 증식증 ……… 33

그림 9.APPsw 형질전환 동물 및 대조군 동물에서 학습 및

기억능력 평가 행동검사 ……… 35

(9)

국문요약 알쯔하이머병 동물모델에서 인간 신경줄기세포의 뇌 이식 알쯔하이머병(Alzheimer'sdisease)은 만성적인 진행성 신경질환으로 기억력,사 고력,지남력,이해력,계산능력,학습능력,언어 및 판단력 등의 다발성 뇌 기능 장 애를 초래하며 병리조직학적으로 뇌의 전반적인 위축,뇌실의 확장,뇌신경세포 내 신경섬유의 다발성 병변(neurofibrillarytangle)형성과 세포외 공간에 초로성 반점 (senileplaque)이 형성된다.

신경줄기세포는 신경계 이식이 가능하고,전체 신경축에 걸쳐 광범위하게 이주하 며,생착 통합되어 치료적으로 유용한 물질을 직접적,지속적,그리고 조절되는 양상 으로 분비할 수 있고,기능부전을 보이는 신경계에 본 세포를 이식 시 급․만성 퇴 행성 신경병소에서 발생하는 미세환경신호에 반응하여 신경병소 부위로 특이적으로 이주하고,세포구조학적 및 기능적으로 적절하게 다양한 신경세포로 분화한다.

본 연구에서는 알쯔하이머병 동물모델 중 human APP 유전자의 670번 amino acid가 Lysine에서 Asparagine으로, 671번 Methionine이 Leucine으로 변이된 APPswe형질전환 쥐를 사용하였다.그리고 인간 신경줄기세포는 임신 13주에 자연 유산된 태아의 종뇌에서 분리,배양하여 확립하였고,생후 13개월 된 APPswe동물 모델의 해마와 측 내실에 세포를 이식하였다.이식된 인간 신경줄기세포는 모델동 물의 해마,대뇌피질 및 백질,시상,뇌량 및 뇌궁 등에 걸쳐 광범위하게 이주 및 생 착함이 관찰되었고,공여세포는 주로 신경교세포로 분화하였고,소수에서는 미성숙 한 신경원세포로 분화함을 보였고,일부 세포는 미분화된 상태로 존재하였다.모델 동물의 뇌에 식염수만 주사한 대조군과 인간 신경줄기세포를 이식한 실험군에서 신 경행동검사를 실시한 결과,양군 간에 학습능력에는 차이가 없었으나 신경줄기세포 를 이식한 실험군에서 오히려 기억능력이 다소 감소함을 보였다. 본 예비연구에서 알쯔하이머병 모델동물의 뇌에 인간 신경줄기세포를 이식한 결 과,공여세포는 숙주 뇌의 광범위한 지역에 이주 및 생착하고 신경세포로 분화함을 보였으나 신경행동검사 상 학습 및 기억능력의 향상을 보여주지 못했다.따라서 향 후 숙주 뇌에서 이식된 신경줄기세포의 적절한 신경세포로의 분화유도 촉진,공여 세포를 통한 신경영양인자의 공급,숙주 뇌의 염증성 반응감소유도,줄기세포 이식 술의 개선 등을 통하여 보다 다방면의 효율적 세포치료 적용 가능성을 실험해 볼 수 있을 것이다. ---핵심 되는 말 :Alzheimer'sdisease(AD),β amyloid precursorprotein (APP), humanneuralstem cells(hNSCs),transplantation,celltherapy

(10)

알쯔하이머병 동물모델에서 인간 신경줄기세포의 뇌 이식 <지도교수 박박박국국국인인인> 연세대학교 대학원 의과학과 이 이 이일일일신신신

I.

I. I. 서

서

서 론

론

알쯔하이머병은 대표적인 진행성,퇴행성 신경질환으로 85세 이상 노인 의 50%정도가 고통받고 있는 노인성 치매의 일종이다1_{.증상으로는 기억} 력,사고력,지남력,이해력,계산능력,학습능력,언어 및 판단력 등이 저하 된다.현재까지 병인에 대해서는 아직 명확하게 밝혀진 것은 없으나 몇 가 지 특징을 보인다. 첫째,해마와 연합피질에 있는 뉴런과 시냅스의 손실이 관찰된다.중추 신경계에서 전뇌,소뇌,편도,해마 및 대뇌피질 등은 감정조절과 관련된 부위로서 해마와 대뇌피질의 신경파괴는 알쯔하이머병의 기억력 장애와 사 고능력 저하와 관계가 깊은 것으로 생각된다2,3_{.둘째,아세틸콜린 등의 신} 경전달물질이 감소하는데 이는 신경세포간의 정보교환 과정이 파괴됨에 따 라 신경세포의 기능이 정지되고 신경세포간 연결이 끊어짐으로서 신경세포 가 결국에는 사멸하게 된다.특히 알쯔하이머병 환자의 마이네르트 기저핵

(basalnucleus ofMeynert)에서 콜린성 신경 원세포의 퇴화와 관련해서

콜린에스테라제 저해제 (cholinesteraseinhibitor)를 통한 약물개발이 진행

되어 왔고 현재는 임상에서 Donepezil,Rivastigmine,Galantamine의 약물

(11)

하는 효과는 있지만 근본적인 치료라 할 수 없으며,알쯔하이머병 초기에 만 적용되는 한계점을 드러내고 있다.셋째,알쯔하이머병 환자의 뇌에서는

신경조직학적으로 신경원섬유농축(neurofibrillary tangle)과 축색반(Aβ

plaque)이 특징적으로 많이 관찰된다3_{.이러한 두 가지 특징은 알쯔하이머}

병의 지표로 쓰이고 있다. 베타 아밀로이드 전구 단백질 (β-amyloid

precursor protein; APP)로부터 단계적으로 일어나는 proteolytic

processing에 의해서 Aβ가 생성되고,이렇게 생성된 Aβ는 서로 응집하여

β-sheet구조를 형성하고 이러한 응집된 형태가 Aβ plaque라 불리며 결국

이로 인해서 신경세포 사멸을 유도한다고 생각되고 있다6,7_{.APP는 정상에}

서는 주로 α-secretase와 ｒ-secretase에 의해서 절단되나 알쯔하이머병의

원인으로 생각되는 amyloid plaque는 β-secretase와 ｒ-secretase에 의한

특이적 절단에 의해서 Aβ1-40/42가 생성되어 Aβ plaque를 구성하고,이는

신경세포의 축색돌기 및 수상돌기들과 얽히고 다시 신경세포와 얽힘으로서 염증 매개물질의 분비작용과 식세포 작용을 일으키게 되는 것이다2,3,6,7_.그 러나 이러한 Aβ plaque침착이 알쯔하이머병의 주요 특징임은 확실하지만 현재까지 질병의 유발원인인지 결과적 부산물인지에 관해서는 명확히 밝혀 지지 않았다.또 신경원섬유농축은 tau 단백질의 비정상적 인산화에 의해 서 형성되어 뇌신경섬유의 엉킴 현상을 일으키게 되고 이로 인해서 신경원 세포는 정상적인 기능을 하지 못하고 결국 죽게 된다3,8,9_{.넷째,최근의 연}

구에 따르면 apolipoprotein E (ApoE)가 알쯔하이머병에 영향을 미친다고

한다.현재까지 알려진 바에 의하면 Apo E4가 많을수록 알쯔하이머병의

발병 확률이 높아지며 Aβ plaque의 형성도 촉진한다고 한다.반면에 Apo

E2는 알쯔하이머 병의 발병을 억제할 수도 있다고 생각되고 있다10.

현재까지 알쯔하이머병에 대한 원인과 결과에 대한 명확한 규명은 요원 해 보이지만 병을 모방하고 표현하는 많은 동물모델을 통해서 연구가 활발

히 진행 중이다.특히 APP,Presenilin-1,Presenilin-2등의 유전자 돌연변

(12)

APP 유전자의 특정부위를 변이시킴으로서 시간의 경과에 따라 쥐의 뇌에 서 Aβ plaque와 neurofibirllarytangle이 관찰되는 APP swedish형질전환 쥐는 670번 aminoacid가 Lysine에서 Asparagine으로,671번 Methionine이

Leucine으로 변이된 것이다12_{.이 형질전환 쥐 모델의 경우는 APP 유전자}

의 변이를 통해서 APP 유전자에 대한 β-secretase의 활성이 증가되어 결

과적으로 Aβ의 형성을 촉진시켜 Aβ plaque가 증가되며 이로 인해서 또한

neurofibrillarytangle도 형성도 촉진된다13,14_.

신경줄기세포란 미성숙, 미분화된 상태로 계속 증식하는 자가갱신

(self-renew)을 보이고,적어도 신경원세포 (neuron)및 신경교세포 (glia)

로 분화하는 분화의 다능성 (multipotency)을 보이는 세포로 정의되는데, 이러한 신경줄기세포는 태아 신경계 전반에 걸쳐 다양한 해부학적 부위에 서 존재하며,최근에는 태아뿐만 아니라 성체의 신경계에서도 줄기세포가 존재하고,일생을 통하여 특정 부위에서 새로운 신경원세포를 생성한다는 사실이 밝혀졌다.신경줄기세포의 증식,성장 및 분화에 대한 기초연구와 줄기세포의 가소성 (plasticity)을 이용하여 한번 손상되면 특별한 치료 방 법이 없는 난치성 신경계질환에 대한 세포 및 유전자치료를 시도할 수 있 어 신경계에 대한 재생 의학적 접근 가능성을 제시한다15-19_. 신경줄기세포의 세포생물학적 특성과 신경계질환에 대한 세포 치료에 있어서 유용성을 요약하면,첫째 간편하고 안전한 방법으로 뇌 혹은 척수 이식이 가능하고,전체 중추신경계에 생착 (engraftment)하여 통합된다20-27. 둘째 기능부전을 보이는 신경계에 본 세포를 이식 시 전체 숙주 신경축 (neuralaxis)에 통합되어 숙주 신경줄기세포와 똑같이 시간 및 공간적 신

경발달 미세환경신호 (microenvironmentalsignals)를 받아 세포구조학적

및 기능적으로 적절하게 각각의 신경세포로 분화하는 다능성을 보이므로, 기능부전을 보이는 신경세포를 대체하고,손상된 신경망을 재건하여 중추

신경계를 재생케 하는 가능성을 보인다25-27_{.셋째 중추신경계 이식 시 신경}

(13)

(multifocal)및 전신성 (global)신경계질환에 있어서도 부전증을 보이는

세포, 효소, 신경영양인자, 수초 (myelin), 세포외기질 (extracellular

matrix)등의 미만성 (diffusible)혹은 비미만성 (non-diffusible)물질을 제

공할 수 있다28_{.넷째 본 세포의 가소성으로 인하여 신경계 이식 시 생착된} 부위에 통합되어 그 부위에 적절한 신경세포로 분화되므로,숙주 신경계의 특정 부위에 이식 시 그 부위에 맞는 공여 신경세포를 구하지 않아도 되 고,이식 시 숙주 신경계의 특정 부위에 정확히 표적화 (‘targeting’)할 필 요도 없다18,26_{. 다섯째, 본 세포는 신경계에서 유래되었으므로 본태성} (intrinsic)으로 저 농도의 정상 신경세포 고유의 미만성 및 비미만성 인자 (lysosomalenzyme,신경영양인자,세포외기저물질,세포유착인자,수초, homeoproteins등)를 분비하므로,많은 치료적 및 신경발달학적으로 유용 한 물질을 계속 제공할 수 있고,그 외에 아직 알려지지 않은 신경세포 특 이 생리활성인자의 공급도 가능하다22,24,28.여섯째,한 종류 및 한 개체 설 치류에서 신경줄기세포를 개발하여 같은 종 혹은 다른 종의 설치류에 뇌 이식 시,면역억제제를 사용하지 않아도 특별한 거부반응이 없는 면역내성 을 보이므로,한 종류의 신경줄기세포는 같은 종의 여러 개체에 효율적으 로 사용될 수 있다29-31_{.일곱째 본 세포를 바이러스성 vectors를 만드는 세} 포로 사용할 경우 생체 내에서 광범위하게 vectors를 분포시킬 수 있어,광 범위한 신경조직 부위에 바이러스성 vecoctor-매개성 유전자 치료를 할 수

있다18,22.여덞째 생분해성 합성 고분자화합물 (biodegradable synthetic

polymermatrix)과 공동배양 시 세포의 성장,증식 및 분화가 촉진되므로 본 세포를 조직공학적 방법으로 이용하여 신경조직의 재생을 유도할 수 있 다19.아홉째 본 세포는 급 만성으로 진행하는 신경퇴행변성 (neurodegeneration) 시 발생하는 신호에 반응하여 향성 (tropism)과 영양성 (trophism)을 보이 는데,신경계에 이식 후 손상된 부위에 확고한 생착 및 외부 유전자 발현 을 보이고,신경손상 부위로 특이적으로 이주하는 현상을 보이며,태아기 신경계뿐만 아니라 출생 후 신경손상 시에도 발현되는 “신경세포생성신호

(14)

"(neurogenicsignals)에 반응하여 적절한 신경세포로 분화하여 손상된 신 경세포를 대체 및 재생함을 보인다26,28_. 1990년대 초 미국 및 캐나다에서 주로 설치류의 신경줄기세포를 생체 외에서 유전적 혹은 비유전적 방법으로 배양하는 기술이 개발된 이래,체 외에서 계속 배양한 신경줄기세포를 중추신경계에 이식하면 줄기세포의 가 소성으로 인하여 적절히 통합되어 신경세포로 분화하고 외부유전자를 지속 적으로 표현함이 밝혀져,신경줄기세포를 이용한 신경계 발달 연구와 중추 신경계질환에 대한 세포 및 유전자치료의 유용성에 주목하게 되었는데,최 근에는 설치류의 신경줄기세포와 유사한 생물학적 특성을 가지는 인간 신 경줄기세포가 존재함을 확인하고,배양 및 확립하여 생물학적 특성을 연구 한 결과,설치류의 줄기세포와 유사하게 생체내외에서 분화의 다능성을 보 이고,생체 내에서 숙주 신경계의 공간적 및 시간적 신경발달 신호에 반응 하며,여러 질병모델 동물에 뇌 이식한 결과 손상 혹은 부전증을 보이는 신경세포를 대체하고 줄기세포 매개성 유전자 치료가 가능함이 제시되었다 32,33_{.따라서 현재 다양한 신경발달 시기 및 해부학적 부위에서 추출된 인} 간 신경줄기세포를 배양하여 생체내외에서의 특성 분석과 신경계 손상 동 물 모형에서의 치료적 적용 가능성에 대한 연구들이 활발히 발표되고 있으 며,대학,연구소뿐만 아니라 많은 생명공학회사들도 인간 신경줄기세포의 임상적 적용 가능성 연구에 활발히 투자하고 있다. 상기에서 언급한 바와 같이 알쯔하이머병에 대한 다양한 병태생리 기전 연구와 치료법 등이 연구되고 있지만,진정한 의미의 치료란 해마와 연합 피질에서 신경원세포의 퇴화 방지,질병 진행의 중단 혹은 원 상태로 복구 일 것이다.그렇게 하기 위해서는 이미 사멸한 혹은 소실되고 있는 신경세 포를 건강한 신경세포로 교체 혹은 대체하여 신경을 재생시키는 치료가 요 구된다.따라서 최근 다양한 종류의 줄기세포의 생물학적 다능성 및 가소 성을 이용하여 알쯔하이머병에 대한 세포치료의 가능성에 관하여 많은 관 심이 고조되고 있는데,줄기세포가 숙주 뇌에 통합되어 선택적으로 소실되 고 있는 해마와 대뇌피질 부위에 적절히 생착 및 이주하여 소실된 신경원 세포를 대체 및 재생하는 세포치료를 시도할 수 있기 때문이다. 따라서 본 연구에서는 인간 신경줄기세포를 분리 및 배양하여 생체 외 에서 증식,성장 및 분화 특성을 확립하고,이렇게 확립된 인간 신경줄기세

(15)

포를 알쯔하이머병 동물모델의 뇌에 이식하여 공여세포가 숙주동물의 해마 와 대뇌피질에 걸쳐 이주하여 공여세포의 생착 및 신경병소와의 특이적 관 계를 관찰하고,공여세포의 신경세포 및 신경교세포로의 분화형태를 확인 하며,모델동물에 있어서 신경학적 증상 호전 여부 및 학습과 기억능력에 미치는 영향 등을 연구하고자 한다.

(16)

II.

II. 재료

재료

재료 및

및

및 방법

방법

1.알쯔하이머병 동물모델 확립 가.APPsw 형질전환 쥐 실험에 사용된 알쯔하이머병 동물모델은 인간 아밀로이드 전구단백질 (amyloid precursorprotein,APP)695 isoform 유전자의 swedish 돌연변

이(KM670/671NL)를 가진 쥐로서 neuron specific enloase (NSE)

promoter에 의해서 APP가 발현되는 형질전환 쥐이다14_{.쥐 수정란의 생식}

핵에 벡터 pNSE-APPsw (그림 1A)를 현미주사 (microinjection)를 이용해

주입한 후 대리모에 착상시켜 출생시킨다.이렇게 출생된 쥐들의 genomic

DNA로부터 유전자형 확정 (genotyping)을 실시하고 APPsw 유전자형을

가진 쥐들에서 NSE promoter에 의해서 뇌 조직 특이적 발현을 확인하기 위해서 각 조직으로부터 RNA를 추출하여 APP의 발현을 검사하였다 (그 림 1B). 이와 같은 APPsw 형질전환 쥐를 Korea Food & Drug

Administration,Nat'IInst.Toxicol.Res(KFDA)로부터 확보하여 오리엔

트 바이오에서 구입한 B57BL/6계통 쥐와 교배시켜 출생한 한배의 새끼에 서 유전자형 확정을 실시하였다 (그림 1C).한 배에서 나온 새끼들 중에서 인간 APPsw를 가지고 있는 heterozygote 유전자형 쥐를 실험군,가지고 있지 않은 정상 쥐를 대조군으로 사용하였다.모든 동물은 AAALAC 국제

동물 보호 규정 (International AnimalCarepolicies)에 의해 관리되었다.

나.유전자형 확정 (Genotyping)

인간 APPsw 유전자의 유무를 알기 위해서 태어난 모든 쥐에서

(17)

A

B

C

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 APP(509bp) IL-2(324bp) 그림 1.AAAPPPPPPssswww 형형형질질질전전전환환환 쥐쥐의쥐의의 확확확립립립 및및및 유유전유전전자자자형형형 확확확정정정. 신경원세포 특이적으로 활성화되는 NSE promoter에 인간 APPsw 유전자를 발현하도록 벡터를 제작하여 형질전환 쥐를 확립하였음.A,APPsw 형질전환 쥐를 생산하기 위해 서 수정란에 미세주입된 벡터.B,유전자형 확정을 통해서 확인된 APPsw 형질전환 쥐로부터 각 조직부위별로 RNA 를 추출하여 RT-PCR을 실시하였음.일률적 β-actin 발현 은 조직으로부터 RNA가 성공적으로 추출되었음을 보여주 며,뇌 조직에서 인간 APP가 특이적으로 발현되었음.C, heterozygote 유전자형을 가진 APPsw 형질전환 쥐를 확 립하기 위해 출생 3주 후에 꼬리로부터 얻은 genomic

DNA로부터 PCR을 실시하였음.(M;sizemarker,1,3,4,

11번 쥐:APPsw 형질전환 쥐,2,5,6,7,8,9,10번 쥐 : 정상 쥐)

(18)

자른 후 G-spinTM _Genomi_{cDNA Extracti}_onKi_{t(INTRON,성남시,대한}

민국)을 이용하여 쥐의 genomic DNA를 추출하였다.Polymerase Chain

Reaction(PCR)반응은 Genomic DNA 추출의 성공 여부를 알기 위해서

IL-2의 특정 부분을 증폭하는 sensepri

merCTAGGCCACAGAATTGA-AAGATCT,anti-sense primerGTAGGTGGAAATTCTACATCATCC를

사용하였고,인간 APPsw 유전자의 유무를 알기 위해서 sense primer

CTGAGTCTGCAGTCCTCGA,anti-sensepri

merCTCTTCTCACTGCA-TGTCTC를 사용하였다.PCR반응시간은 95℃ 5분,[94℃ 45초,62℃1분, 72℃ 30초]×35회 반복,72℃ 7분 동안 실시되었다.모든 쥐에서 IL-2가

1.5% agarosegel상의 324bp에서 확인되고 APPswe형질전환 쥐의 여부는

1.5% agarosegel상의 509bp에서 확인하였다 (그림 1C).

다.APPsw 형질전환 쥐에서 APP 와 Aβ 분포 양상 확인 (1)실험 동물의 분석

생후 13개월 된 APPsw 실험동물을 4% paraformaldehyde in 0.1M

1,4-piperazinediethanesulfonicacid (Pipes)buffer로 고정 후 뇌를 적출하

여,30% sucroseinPhosphateBufferedSaline(PBS)로 4℃에서 동결보호

하고,Optimalcuttingtemperaturecompound(O.C.T compound)배지에 담

가 뇌를 동결 후 16㎛로 cryosection했다.슬라이드는 염색할 때까지 -20℃

에 보관하였다.

(2)APP 발현과 Aβ 분포

APPsw 형질전화 쥐의 뇌에서 APP 와 Aβ의 발현 및 분포를 관찰하기

(19)

(3% BovineSerum Albumin,10% NormalDonkey Serum (NDS),0.2%

Triton×100inPBS)에 실온에서 1시간 동안 반응 후,carriersolution(3%

NDS, 0.2% Triton×100 in PBS)에 mouse anti-Alzheimer Precursor ProteinA4(APP;Chemicon;1:200),mouseanti-amyloidbetaprotein(A

β;Chemicon;1:100),rabbitanti-human betaamyloid1-40/42(Aβ40/42;

Chemicon;100)항체를 희석하여 4℃에서 하루동안 반응하였다.1X PBS

로 3회 세척하고 Fluorescein(FITC)-conjugated anti-mouse IgG(Jackson ImmunoResearch laboratories Inc, West Grove, PA, USA; 1:100)와 Fluorescein(FITC)-conjugated anti-rabbit IgG (Vector Laboratories, INC.,Burlingame,CA,USA;1:180)를 carriersolution에 희석하여 37℃에

서 1시간 10분 반응하였다.다시 1X PBS로 3회 세척 후 mounting하여 면 역현광현미경으로 분석하였다. 2.신경줄기세포 배양 가.인간 신경줄기세포 배양 과학기술부 및 보건복지부의 생명윤리법안 연구지침을 따르고,세브란 스명원 IRB의 승낙을 받은 후,임신 13주에 자연 유산되어 사망한 태아

의 종뇌 (telencephalon)부위에서 사전에 보호자의 동의서를 획득한 후,

일부 신경조직을 채취하여 신경줄기세포를 배양하였다. Dulbecco's

ModifiedEagleMedium (DMEM)/Ham'sF-12(1:1)(GIBCO,Invitrogen,

Carlsbad,CA,USA;이하 세포배양에 사용한 모든 재료는 특이 기재 사

항이 없는 한 GIBCO 社 제품임)에 1%의 N2supplement,100units/ml

penicillin G sodium과 100㎍/mlstreptomycin sulfate(1X P/S)의 항생

제를 첨가한 배지 (N2배지)를 기본으로 배양하였고,mitogeniccytokines

(20)

Minneapolis,MN,USA),8 ㎍/ml의 heparin (Sigma,St.Louis,MO, USA),10ng/ml의 leukemiainhibitory factor(LIF;Sigma)를 첨가하였

다. 3-4일마다 배지를 교환하고 7-9일 마다 0.05% Trypsin/0.53mM

EDTA (T/E)를 2분 30초간 처리하여 계대 배양하였다. 나.인간 신경줄기세포의 생체 외에서 특성 확립

N2배지에 mitogenic cytokines을 첨가한다.여기에 배양된 부유 cell

cluster를 cornicaltube로 이동,원심분리 후 차가운 PBS로 세척한다.다시

원심분리 후 4% paraformaldehydein 0.1M Pipesbuffer로 고정하고 30%

sucrose in PBS로 동결 보호한다.O.C.T compound 배지에 담가 cell

cluster를 동결,cryosection하였다.일차항체 anti-human Nestin (hNestin; Chemicon; 1:200), anti-vimentin (Sigma; 1:80), anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP; Dako, Carpinteria, CA, USA; 1:1000), anti-NeuronalclassⅢ β-Tubulin (Tuj1;Covance,Berkeley,CA,USA; 1:1000),anti-NF (pan-neurofilament;Sternberger,Lutherville,MD,USA; 1:500) anti-NF M (neurofilament M; Chemicon; 1:1000),anti-NF H (neurofilament H; Chemicon; 1:1000), Pax6 (Developmental Studies Hybridoma Bank,Iowa City,IA,USA;1:40),excitatory amino acid transporter 1 (EAAT1;Santa Cruz Biotechnology,INC.,Santa Cruz,

CA;1:100)항체를 사용하여 면역세포화학 방법으로 염색하였다.

3.APPsw 모델 및 대조군 동물에 인간 신경줄기세포의 뇌 이식 가.이식세포 준비

(21)

가된 배지에서 5일 간 배양하고,이식을 위하여 T/E 처리하여 단일세포로 만들고, 남아있는 BrdU를 제거하기 위해 H-H buffer (1X Hanks' balanced saltsolution,10mM HEPES,pH 7.4)로 3회 세척하고,0.05%

trypan blue를 염색하여 8×104_cel_l_{s/㎕을 준비하였다.이와 같이 준비된 인}

간 신경줄기세포는 이식할 때까지 얼음에 보관하였다. 나.동물 수술 실험동물은 APPsw 형질전환 쥐에 인간 신경줄기세포를 이식하는군, H-H buffer를 이식하는 군과 한배에서 출생한 정상 대조군 쥐에 인간 신 경줄기세포를 이식하는군,H-H buffer를 이식하는 군으로 나누어 실험이 진행되었다.생후 13개월 된 APPsw 형질전환 쥐와 정상 대조군 쥐를 Xylazine (0.1mg/10g ofmouse)과 Ketamine (0.5mg/10g ofmouse)으로 마취시키고,소독된 수술도구로 수술하였다.머리의 피부를 70% 알코올로

소독하고 절개한 후,stereotaxicapparatus에 고정된 상태에서 양쪽 대뇌

반구의 해마 분자층 (hippocampus molecular layer)과 측뇌실 (lateral

ventricle)부위의 위치를 표시하고　(Bregma로부터 뒤로 2.54mm,옆으로

2.5mm,뇌경막(duramater)로부터 각각 깊이 2.25mm,1.45mm)1mm drill

bar로 skullbone에 구멍을 뚫었다.10㎕ Hemilton syringe에 준비된 세포

또는 H-H buffer를 담아 stereotaxic apparatus에 고정시키고, micro

injection pump (Stoelting,Wood Dale,IL,USA)로 1㎕/분의 속도로 천 천히 해마 분자층에 4㎕씩 이식하고 2분간 안정화 한 후,다시 측내실에 2 ㎕씩 이식하였다.이식이 끝난 후 1분간 안정화 한 후 다시 1분 30초에 걸

쳐 천천히 syringe바늘을 꺼냈다.수술부위는 요오드 연고로 소독하고 봉

합하였으며,마취가 깰 때까지 37℃ warm pad에서 안정화시키고,이식된 인간 신경줄기세포의 면역거부반응을 막기 위해서 이식 하루 전부터 실험

(22)

서울,대한민국)을 증류수에 희석하여 피하 주사하였다. 4.생체 내 이식된 인간 신경줄기세포의 생착,분포,이주 및 분화형태 분석 가.실험동물의 분석 인간 신경줄기세포 이식 6주 후,상기 동물들을 4% paraformaldehyde in 0.1M Pipesbuffer로 고정 후 뇌를 적출하여,30% sucrosein PBS로 4℃에서 동결 보호하고,OCT compound 배지에 담가 동결 후 16㎛로 cryosection했다.슬라이드는 염색할 때까지 -20℃에 보관하였다. 나.생체 내 이식된 신경줄기세포의 생착,분포 및 이주형태 관찰

anti-BrdU antibody로 면역조직화학염색법을 실시하여 이식된 인간 신

경줄기세포를 추적하였다.슬라이드를 37℃에서 2N HCl로 35분간 처리후,

0.1M Borate buffer (pH8.3)로 중화하고 1X PBS로 3회 세척,blocking

solution (1% BSA,10% NDS,0.3% Triton X-100 in PBS)에 실온에서

한 시간 반응시켰다. anti-BrdU-Fluorescein (Roche, Mannheim,

Germany)를 carriersolution (3% NDS,0.3% Triton X-100 in PBS)에

1:20으로 희석하여,37℃에서 1시간 45분 동안 반응하고,3회 세척 후

mounting하여 현광현미경으로 관찰하였다.

다.생체 내 이식된 신경줄기세포의 분화형태 관찰

BrdU 양성인 인간 신경줄기세포의 분화상태를 알아보기 위한 일차 항

체 염색은 슬라이드를 37℃에서 2N HCl로 35분간 처리 후,0.1M Borate

(23)

서 한 시간 반응 후,carriersolution에 각각의 일차항체를 희석하여 4℃에

서 2일 동안 반응하였다. 1X PBS로 3회 세척하고, biotinylated

anti-mouse (Jackson ImmunoResearch laboratories Inc), biotinylated anti-rabbit,biotinylated anti-goatIgG (VectorLab)를 carriersolution에

각각 1:200,1:180,1:180으로 희석하여 37℃에서 1시간 45분 반응하고,다

시 3회 1X PBS로 세척 하였다. Streptoavidin-Texas Red (Jackson

ImmunoResearch laboratories Inc)를 carriersolution에 1:250으로 희석하 여,37℃에서 1시간 45분 반응하고 3회 1X PBS로 세척하였다.마지막으로

anti-BrdU-Fluorescein(Roche)을 1:20으로 희석하여,37℃에서 1시간 45분

반응하고,3회 1X PBS로 세척 후 mounting하여 면역현광현미경으로 관찰

하였다. 위 실험에서 쓰인 일차항체는 mouse anti-human Nestin

(hNestin; Chemicon; 1:200), mouse anti-Neuronal Nuclei (NeuN; Chemicon;1:40),goatanti-doublecortin (Dcx;Santacruz Biotechnology; 1:400)mouse anti-Neuronalclass Ⅲ β-Tubulin (Tuj1;Sigma;1:150), mose anti-2',3'-cyclic nucleotide 3'-phospho diesterase (CNPase; Sternberger;1:500),rabbitanti-GlialFibrillary Acidic Protein (GFAP;

Dako;1:1200)항체를 사용하였다.

5.행동검사

가.Morriswatermazetest

해마를 이용하는 공간지각 학습능력검사를 인간 신경줄기세포 이식 후 5주에 시행하였다.지름 90 cm 높이 30cm 흰색 수조에 22℃물을 넣고 Skim Milk(Becton,DickinsonandCompany,Sparks,MD,USA)를 혼합

하여 불투명하게 하고 물 표면에서 1.5cm 아래에 투명한 Plexiglas플랫

폼을 북서쪽 사분면에 설치한다.실험동물마다 하루에 수조의 네 방위에서 실험동물의 수영을 시작하여 한번 씩 실험을 시행하며 6일간 계속하였다.

(24)

한 시행마다 쥐가 헤엄쳐서 플랫폼에 위치하여 15초 동안 머무르게 하고 4 분 동안 쥐의 젖은 털을 말려주었다.이때 쥐가 60초 동안 플랫폼을 찾지 못하면 플랫폼으로 긴 막대를 이용하여 안내하여 주고 역시 15초 동안 머 무르게 한다.6일간의 학습과정 후 7일차에 probetest를 실시하는데 이때 는 플랫폼을 제거하고 남동쪽 사분면에서 실험동물의 수영을 시작하여 60 초 동안 어느 지역에 쥐가 머무르는가를 측정하였다.이러한 전 과정은 video-tracking system으로 관찰되며 수영거리,플랫폼에 도달까지 시간, 수영 속도,수영 지역을 수집,분석하였다. 나.통계처리

각 대상군들의 morriswatermaze에 대한 수치 결과는 SPSS 12.0for

windows를 이용하여 통계 분석하였다.4개의 집단 간 비교는 비모수 통계

방법 중 Kruskal-Wallis검정을 이용하였다.2개의 대상군들간 비교는 비

모수 통계분석 중 독립 2-표본검정을 위해서 Mann-Whitney 검정을 이용

하였는데 첫째,APPsw 쥐에 인간 신경줄기세포를 이식한 경우

(APP-hNSC;n=5)와 H-H buffer를 이식한 경우 (APP-vehicle;n=6),둘째,정상

쥐에 인간 신경줄기세포를 이식한 경우 (Wild-hNSC;n=7)와 H-H buffer

를 이식한 경우 (Wild-vehicle;n=9),셋째,인간 신경줄기세포를 APPsw

쥐 (APP-hNSC)와 정상쥐 (Wild-hNSC)에 이식한 경우,넷째,H-H buffer

를 APPsw 쥐 (APP-vehicle)와 정상쥐 (Wild-vehicle)에 이식한 경우로 나

누어서 비교 분석하였다.집단 간 통계적 차이는 유의수준 p값 0.05수준에

(25)

Ⅱ

Ⅱ.

.

결

결 과

과

1.알쯔하이머병 동물모델 확립 알쯔하이머병 동물모델인 APPsw 형질전환 쥐를 확립하고자 APPsw 형질전환 쥐와 B57BL/6계통 쥐를 교배하여 출생한 한배의 새끼를 생후 3주에 유전자형을 확정하였다.DNA 겔 전기영동을 실시하여 PCR에 의해 증폭된 IL-2 유전자의 일부를 324bp의 band에서 확인함으로서 쥐의

genomicDNA가 성공적으로 추출되었음을 알 수 있었다.그리고 APPsw

형질전환 쥐의 여부를 알기 위해서 신경원세포에서만 특이적으로 활성화

되는 NSE promoter와 인간 APP swedish 돌연변이 유전자의 일부분을

PCR에 의해 증폭 후 겔 상의 509bpband를 통해서 APPsw 형질전환 쥐 를 확인하였다 (그림 1C). 위의 과정을 통해 얻은 인간 APPsw heterozygote 유전자형을 가진 APPsw 형질전환 쥐를 생후 13개월에 APP발현과 Aβ분포 양상을 알아보기 위해 면역조직 화학방법을 실시하였 다.APPsw 형질전환 쥐의 뇌에서 APP는 대뇌피질의 신경원세포 특이적 으로 발현되었으며 (그림 2A,B)해마의 신경원세포들에서 뿐만 아니라

편도체 (amygdala)에서도 발현되었다 (그림 2C,D).특히 CA1과 치아이

랑 (dentate gyrus)에서의 발현이 두드러지게 관찰되었다 (그림 2E,F). APP의 특이적 절단에 의해 형성되는 Aβ를 관찰하기 위해서 인간 APP에 서 유래한 Aβ에만 특이적으로 반응하는 항체와 알쯔하이머병인의 핵심이 라 생각되는 Aβ1-40/42에만 특이적으로 반응하는 항체를 사용하였다.대 뇌피질과 편도체,해마의 CA1,CA3,치아이랑 세포에서 인간 특이적 Aβ 와 Aβ1-40/42가 비슷한 경향으로 분포하고 있음을 관찰하였다 (그림 3A, B,C,D).이를 통해서 인간 APPsw로부터 특이적 절단에 의해서 형성된 Aβ는 주로 Aβ1-40/42임을 알 수 있었고 이러한 Aβ들은 주로 신경원세 포 내부에 축적되어 있음을 관찰하였다.반면에 세포외 공간에서 Aβ

(26)

A

B

C

D

E

F

APP

(27)

그림2.AAAPPPPPPsssww 형w 형형질질질전전전환환환 쥐쥐쥐의의 뇌의 뇌뇌에에에서서서 AAAPPPPPP 발발발현현현 및및및 분분분포포포.생후 13개월

된 APPsw 형질전환 쥐의 뇌를 적출하여 16㎛로 coronalsection 후 면역

조직화학염색법을 실시하였음.일차항체는 mouseanti-APP를 이용하였고

이차항체로 FITC-conjugated anti-mouseIgG를 사용하여 면역현광 현미

경으로 관찰하였음.인간 APPsw는 대뇌피질,해마,편도체 등에서 발현되 었는데,현광현미경 하에서 녹색으로 염색된 APP는 다양한 뇌 지역의 신 경원세포들에서 특이적으로 발현되었음.(A,대뇌피질,저배율;B,대뇌피 질,고배율;C,치아이랑,저배율;D,편도체,저배율;E,치아이랑,고배율; F,해마의 CA1,고배율).

(28)

A

B

C

D

Aβ

β

β40/42

β

h Aβ

β

Aβ

β

β40/42

Aβ

β

β40/42

그림 3. AAAPPPPPPsswsww 형형형질질질전전전환환환 쥐쥐쥐의의의 뇌뇌뇌에에서에서서 AAAββββ와와와 AAAββββ 1 1 1---444000///444222발발발현현현분분분포포포 및및및 축축축적적적.생후 13개월 된 APPsw 형질 전환 쥐의 뇌를 적출하여 16㎛로 coronalsection 후 면역 조직화학염색법을 실시하였음.일차항체로 인간 Aβ에 특

이적으로 반응하는 mouseanti-Aβ Ab 및 Aβ40/42에 반

응하는 rabbitanti-Aβ1-40/42Ab를 사용하였고,이차항체

로 FITC- conjugated anti-mouse및 rabbitIgG를 사용

하여 면역현광현미경으로 관찰하였음.A,Aβ40/42는 해마 의 CA1,2,3및 치아이랑 부위의 신경원세포 내에 발현됨 을 보임.B,Aβ는 Aβ40/42와 같은 부위에 발현됨을 보였 는데,CA3 부위의 신경원세포 내에서 Aβ가 발현됨을 보 임.C,대뇌피질의 신경원세포 내에 Aβ40/42가 축적되어 발현됨을 보이고,D,편도체 세포내부에도 Aβ40/42가 축적 되어 발현됨을 보임.

(29)

2.세포배양 및 특성 확립 임신 13주에 자연 유산된 태아의 종뇌에서 획득한 신경조직으로부터 채 취된 인간 신경줄기세포는 매 7-9일 마다 T/E 처리하여 계대 배양하였 다.계대배양 3일 정도 후에 세포들은 일종의 군락을 이루면서 배지에 떠 다니는 둥근 구 모양의 neuroshpreres를 형성하면서 자랐다 (그림 4A). 실험을 진행하는 동안 그림과 같은 형태로 계속해서 자가 증식하는 것을 trypanblueexclusion방법에 의한 세포 수 측정으로 확인하였다.이러한 neurosphere의 특성을 분석하기 위해서 면역세포화학방법으로 염색을 실

시하였다.신경줄기세포 또는 방사성 신경교세포(radialglialcell)와 같은

미성숙 줄기세포를 확인하기 위해서 인간 특이적 nestin항체를,방사성

신경교세포의 확인을 위해서 vimentin,glial fibrillary acidic protein (GFAP),pairedbox protein(Pax6),excitatory aminoacidtransporter1 (EAAT1)항체를 사용하였다.또 신경교세포와 신경원세포를 확인하기 위 해서 각각 GFAP 항체와 neuronal class Ⅲ β-Tubulin (Tuj1),

neurofilament(NF)항체를 사용하였다.Neurospheres를 이루는 전체 세

포의 95-99%가 vimentin,nestin,GFAP,Tuj1,Pax6(그림 4B,D,E,H,

J)를 발현하였고 neurosphere의 일부 바깥구성 세포는 glutamate

astrocytespecifictransporter(GLAST)를 발현하였다 (그림 4M,N,O).

그리고 GFAP를 발현하는 90% 이상의 세포에서 nestin,vimentin,Pax6

각각을 동시에 발현하였다 (그림 4D,E,F,J,K,L).또 GFAP를 발현하 는 90% 이상의 세포에서 초기 미성숙 신경원세포의 표지인자인 Tuj1을 동시에 발현하였고,neurosphere중앙의 일부 세포에서는 Tuj1만 발현하 였다.(그림 4G,H,I).반면에 Tuj1에 비해 좀 더 성숙한 신경원세포의 표지인자인 NF는 별로 발현되지 않았다 (그림 4C).따라서 태아의 신경 조직으로부터 추출하여 계속 증식시켜 계대 배양한 인간 neurospheres는

(30)

신경줄기세포의 일종인 방사성 신경교세포, 신경원세포 전구세포 (restricted neuronal progenitors) 및 신경교세포 전구세포 (restricted

(31)

(32)

그림4.인인인간간간 신신신경경경줄줄줄기기기세세세포포포 배배배양양양 및및및 특특특성성성 확확확립립립.A,인간 신경줄기세포는

N2배지에 bFGF와 LIF를 첨가하여 배양하였고 미성숙 세포가 뭉쳐져

neurosphere를 형성하여 부유하면서 자란다.인간 신경줄기세포의 특성분

석을 위해 cryosection된 neurosphere를 면역세포화학염색법을 실시하여

현광현미경으로 관찰하였음.Neurospheres를 구성하는 대부분의 세포는

vimentin,nestin,GFAP,Tuj-1,Pax6를 발현하였고 (B,D,E,H,J,K,L)

GLAST는 neurosphere의 바깥쪽 세포에서 주로 발현되었다 (M,N,O;화

살표).GFAP (red)를 발현하는 세포의 90% 이상이 nestin(green)을 동시

에 발현하였고 (D,E,F),GFAP (red)를 발현하는 세포의 역시 90%이상이 Tuj1 (green)을 동시에 발현함을 보였다.(G,H,I).일부 neurospheres의 중앙에 위치하는 세포는 GFAP를 발현하지 않고 Tuj1만을 강하게 발현하 여 미분화된 줄기세포가 아니고 분화된 초기 미성숙 신경원세포임을 보였 음 (H,I;화살표).C,성숙한 신경원세포의 표지인자인 NF를 발현하는 세

(33)

3.APPsw 형질전환 모델 및 대조군 동물에 인간 신경줄기세포 이식 후 생체 내에서 공여세포의 생착,분포,이주 및 분화형태 가.실험군과 대조군에 이식된 인간 신경줄기세포의 생착,분포 및 이주형태 실험군으로 APPsw 형질전환 쥐와 대조군으로 동일 배에서 출산된 정 상 쥐를 대상으로 생후 13개월에 각각 BrdU로 표지된 인간 신경줄기세포 를 해마 분자층과 측뇌실에 이식하고 6주 후에 동물을 분석하였다.이식 된 인간 신경줄기세포는 면역조직화학 방법으로 BrdU에 대한 항체를 이 용해서 숙주동물의 뇌에서 생착,분포 및 이주형태를 평가하였다.BrdU 양성인 공여세포들은 세포이식 부위였던 해마의 분자층 뿐만 아니라 해마 의 CA1,CA2,CA3,CA4 및 치아이랑 부위에 걸쳐 골고루 분포하였고 (그림 5A,B,C),측뇌실에 이식된 인간 신경줄기세포들은 측뇌실 인접부

인 뇌실하층 (subventricular zone) 부위에 생착하여 뇌량 (corpus

callosum),뇌궁 (fornix),시상 (thalamus)및 대뇌피질에 걸쳐 광범위하

게 이주하여 생착,분포함을 보였다 (그림 5A,그림 6A,B,C).공여세포 의 분포밀도를 보면 대뇌피질의 바깥부위로 갈수록 즉,뇌실로부터 멀어 질수록 BrdU 양성인 공여세포의 숫자가 줄어드는데 이를 통해서 공여세 포가 이식 부위로부터 방사상으로 이주하였음을 알 수 있었다.또한 대뇌 피질 하 뇌 백질을 따라서 많은 공여세포들이 이주하고 있음이 관찰되었 다 (그림 6A,B,C).이러한 공여세포의 생착,분포 및 이주현상은 실험군 과 대조군 동물 모두에서 같은 형태로 관찰되었다.따라서 노인연령에 해 당하는 실험동물의 뇌에 이식된 인간 신경줄기세포는 숙주동물의 전체 신 경축에 걸쳐 광범위하게 이주하여 생착,분포함을 알 수 있었다.

(34)

A

× × × ×××_×_×_× × × ×

B

C

*

**

*

**

BrdU

그림 5.AAAPPPPPPssswww 형형형질질질전전전환환환 쥐쥐쥐의의의 뇌뇌뇌에에에서서서 이이이식식식된된된 인인인간간 신간 신신경경경줄줄줄기기기세세세포포포 의 의 의 생생생착착착,,,분분분포포포 및및및 이이이주주주...생후 13개월된 APPsw 형질전환 쥐의 해마 분자층과 측내실에 BrdU로 표지된 인간 신경줄기세포를 이식하고 6 주 후에 anti-BrdU-FITC 항체를 이용한 면역조직염색법을 통해서 공여세포의 생착,분포 및 이주를 관찰하였는데,BrdU 양성 (green) 인 세포는 이식부위로부터 광범위하게 이주하여 생착,분포함을 보 였다.A,실험동물 뇌에서 BrdU 양성 (green)인 인간 신경줄기세포

의 분포 모식도 (×××:세포이식 부위).B,CA1(*)과 CA3(**)에 BrdU

양성(green)세포 이주.C,CA4 (*)와 치아이랑 (**)에 BrdU 양성 (green)세포 생착.

(35)

A

B

C

b

BrdU

a

(36)

그림 6.AAAPPPPPPssswww 형형질형질질전전전환환환 쥐쥐쥐의의의 뇌뇌뇌 백백백질질질을을을 통통통한한한 이이이식식된식된된 인인인간간간 신신신경경경줄줄줄 기기기세세세포포포의의의 이이이주주주...생후 13개월된 APPsw 형질전환 쥐의 해마 분자층과 측 내실에 BrdU로 표지된 인간 신경줄기세포를 이식하고 6주 후에 anti -BrdU-FITC 항체를 이용한 면역조직염색법을 통해서 공여세포의 뇌 백질 을 이용한 이주현상을 관찰하였다.C,BrdU 양성 (green)인 많은 공여세포 가 대뇌피질 하 백질을 따라서 이주하는 것이 관찰되었고,뿐만 아니라 뇌 백질에서 방사상으로 퍼져나가 대뇌피질 부위로도 이주하였으며,대뇌피질 의 바깥 부위로 갈수록 BrdU 양성(green)인 공여세포의 숫자가 줄어들었 다.A,그림 C에서 대뇌피질 부분인 a로 표시된 지역을 확대한 사진인데, BrdU 양성 (green)인 이식된 인간 신경줄기세포가 대뇌피질 부위로 이주 함을 보임.B,그림 C에서 뇌 백질 부분인 b로 표시된 지역을 확대한 사진 인데, BrdU 양성(green)인 이식된 인간 신경줄기세포가 뇌 백질을 통하여 광범위하게 이주함을 보임.

(37)

나.실험군과 대조군에 이식된 인간 신경줄기세포의 분화형태 실험군과 대조군 동물의 뇌에 BrdU로 표지된 인간 신경줄기세포를 이 식하였을 때 대상동물 뇌의 광범위한 지역에서 BrdU 항체로 염색되는 공 여세포가 관찰되었다.이러한 BrdU 양성인 공여세포들이 미분화 상태로 존재하는지 또는 어떤 특정 신경세포로 분화하였는지 알아보기 위해서 각 각의 분화된 신경세포에 특이적으로 발현되는 단백질에 대한 항체를 이용 해 면역조직화학 염색법을 실시하였는데,실험군과 대조군 동물 뇌 모두 에서 이식된 BrdU 양성인 인간 신경줄기세포의 분화형태는 비슷하였다. 이식된 신경줄기세포의 약 1% 미만에서는 미분화된 신경줄기세포의 표지 인자인 nestin을 발현하였고,주로 뇌 백질 부위에서 관찰되었으며 (그림 7A,B,C),일부는 해마와 뇌 피질 부위에서도 관찰되었다.BrdU 양성 공 여세포의 약 30% 이상에서는 신경교세포의 일종인 성상교세포의 표지인 자인 GFAP를 발현하였으며,주로 해마,뇌 백질 및 피질 부위에서 전체 적으로 관찰되었다 (그림 7D,E,F).그리고 BrdU 양성 공여세포의 약 20-30%는 신경교세포의 일종인 희소돌기아교세포의 표지인자인 CNPase 를 발현하였으며,역시 숙주동물 뇌의 해마,백질 및 피질에서 골고루 관 찰되었다 (그림 7G,H,I).그러나 공여세포의 극히 일부분에서만 신경원 세포의 표지인자인 Tuj1혹은 NeuN을 발현하여 (그림 7J,K,L),실험군 및 대조군 동물 뇌에 이식된 인간 신경줄기세포는 주로 신경교세포로 분 화함을 보였고 극히 소수에서 신경원세포로 분화하였으며,일부는 미분화 상태로 존재하였다.

(38)

A

B

C

D

E

F

G

H

I

BrdU BrdU BrdU hNestin GFAP CNP BrdU/hNestin BrdU/GFAP BrdU/CNP

J

K

L

(39)

그림 7.AAAPPPPPPssswww 형형형질질질전전전환환환 쥐쥐쥐의의의 뇌뇌뇌로로로 이이이식식식된된된 인인인간간간 신신신경경경줄줄줄기기기세세세포포포의의의 분분분화화화 형형형태태태...실험군과 대조군 동물 뇌에서 BrdU로 표지된 이식된 인간 신경줄기 세포는 광범위한 지역에 이주하여 분포 및 생착하였는데,공여세포들의 분 화형태를 분석하기 위하여 분화세포 특이적 표지인자 항체들을 이용하여 면역조직화학 염색법을 실시하고 면역현광현미경으로 관찰하였다.BrdU 양성 (green)공여세포가 뇌 백질에서 미분화된 신경줄기세포의 표지인자인

nestin (red)을 발현함을 보이고 dualfilter하에서 동일세포로 관찰됨 (A,

B,C;화살표).BrdU 양성 (green)공여세포가 해마 부위에서 성상교세포

의 표지인자인 GFAP (red)를 발현함을 보이고 dualfilter하에서 동일세포

로 관찰됨 (D,E,F;화살표).BrdU 양성 (green)공여세포가 뇌 피질 부 위에서 희소돌기아교세포의 표지인자인 CNPase(red)를 발현함을 보이고

dualfilter 하에서 동일세포로 관찰됨 (G,H,I; 화살표).BrdU 양성

(green) 공여세포가 뇌 피질 부위에서 신경원세포의 표지인자인 NeuN

(red)을 발현함을 보이고 dualfilter하에서 동일세포로 관찰됨 (J,K,L).

C,F,I및 L의 작은 네모안의 그림은 화살표 부위를 확대한 것으로 BrdU

양성인 세포가 dualfilter하에서 미분화 혹은 분화 신경세포의 표지인자들

(40)

다.실험군 및 대조군 동물 뇌에서 신경교세포 증식증 (astrogliosis) 생후 13개월 된 APPsw 형질전환 쥐와 동일 배에서 출산된 정상 대조 군 쥐에서 인간 신경줄기세포 (hNSCs)혹은 H-H buffer(vehicle)를 각 각 뇌 이식하고 6주 후에 병적 미세환경과 염증반응에 대해 활성화된 성 상교세포의 분포를 GFAP 항체를 이용하여 분석하였다.인간 신경줄기세 포를 이식한 군 (APP-hNSCs, Wild-hNSCs) 모두에서 이식을 위해 hamilton주사기 바늘이 들어간 부위에 성상교세포가 매우 활성화된 형태 로 많이 존재하였으며,해마와 뇌 피질,편도체 등 전체부위에 걸쳐서 성 상교세포의 증식증이 관찰되었다 (그림 8A,C).뿐만 아니라 H-H buffer 를 이식한 군에서도 주사기 바늘이 들어간 부위에 많은 성상교세포가 활 성화된 형태로 존재하였는데 (그림 8B,D),정상 대조군 동물보다 APPsw 동물 뇌의 해마,피질 및 편도체 부위 등에서 활성화된 성상교세포가 보 다 많이 관찰되었다.그러나 소수의 실험군 및 대조군 실험동물을 대상으 로 분석한 본 예비실험에서 일반적으로 인간 신경줄기세포를 이식한 군이 H-H buffer를 이식한 군에 비해서 보다 성상교세포가 증식하여 염증반응 이 활성화 되어있어 보였다.

(41)

A

B

C

D

APP-hNSC

APP-vehicle

Wild-hNSC

Wild-vehicle

GFAP

_GFAP

그림 8.AAAPPPPPPssswww 형형질형질질전전전환환환 동동동물물물 및및및 대대대조조조군군군 동동동물물물 뇌뇌뇌에에서에서서 신신신경경경교교교세세세포포포 증증증식식식증증증...생후 13개월 된 APPsw 형질전환 쥐와 동일 배에서 출산된 정 상 대조군 쥐에서 인간 신경줄기세포 (hNSCs) 혹은 H-H buffer

(vehicle)를 각각 뇌 이식하고 6주 후에 GFAP 항체를 이용하여 면역조

직화학 염색법을 실시하였다.APPsw 형질전환 쥐에 인간 신경줄기세 포를 이식한 경우 (A; APP-hNSC), APPsw 형질전환 쥐에 H-H

buffer를 이식한 경우 (B;APP-vehicle),정상 대조군 쥐에 인간 신경줄

기세포를 이식한 경우 (C;Wild-hNSC)에 이식용 주사바늘이 들어간

뇌 피질과 해마 부위에 성상교세포가 많이 증식되어 GFAP의 발현이 크게 증가되었음이 관찰됨.정상 대조군 쥐에 H-H buffer를 이식한 경

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4.행동검사 APPsw 형질전환 쥐와 정상 대조군 쥐에서 인간 신경줄기세포 혹은 H-H buffer를 이식한 경우 숙주 실험동물의 학습과 기억능력에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 Morriswatermaze행동검사를 실시하 였다. APPsw 형질전환 쥐에 인간 신경줄기세포를 이식한 군 (APP-hNSCs)5마리,APPsw 형질전환 쥐에 H-H buffer를 이식한 군 (APP-vehicle) 6마리, 정상 쥐에 인간 신경줄기세포를 이식한 군

(Wild-hNSCs)7마리,정상 쥐에 H-H buffer를 이식한 군 (Wild-vehicle) 9마리로 나누어 실험을 진행하였다.각 군간 학습능력의 변화를 보기위해 서 6일 동안 probe의 위치를 학습시켰는데,4개 군 모두 probe를 찾아가 는 시간이 점차 줄어드는 것으로 보아 실험군과 대조군 모두 학습이 되고 있음을 알 수 있었으나,각 군 사이에 큰 차이를 보이지 않았고,통계적으 로도 유의한 차이를 보이지 않았다 (그림 9A).기억능력의 향상정도를 평 가하기 위해서 실험 7일째에 probe를 치우고 probe위치의 정반대방향으 로부터 수영을 시작하여 쥐가 probe가 위치한 지역에 머무르는 시간을 통 해서 기억능력을 측정하였는데,각 군들 사이에 기억능력에 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았으나 실험군 및 대조군 모두에서 인간 신경줄 기세포를 이식한 경우가 H-H buffer를 이식한 경우보다 기억능력이 평균 적으로 낮은 경향을 보였으며,특히 APPsw 형질전환 쥐의 경우에서 상 대적으로 기억능력이 가장 낮게 나왔다.또 APPsw 형질전환 쥐에 인간 신경줄기세포 혹은 H-H buffer를 이식한 경우 정상 대조군 쥐에 인간 신 경줄기세포 혹은 H-H buffer를 이식한 경우에 비하여 각각 상대적으로 기억능력이 다소 낮은 경향을 보였다 (그림 9B).

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A

B

APP-hNSC APP-vehicle Wild-hNSC Wild-vehicle Group

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그림 9.AAAPPPPPPssswww 형형형질질질전전전환환환 동동동물물물 및및및 대대대조조조군군군 동동동물물물에에에서서서 학학습학습습 및및및 기기기억억억능능능력력력 평평평가가가 행행행동동동검검검사사사...생후 13개월된 APPsw 형질전환 쥐와 같은 배에서 출생한 정상 대조군 쥐에서 인간 신경줄기세포 혹은 H-H buffer를 각각 뇌 이식

하고 5주 후에 각 실험군 사이에 학습 및 기억능력을 Morriswatermaze

방법을 통하여 분석하였다.A,APP-hNSC (n=5),APP-vehicle (n=6),

Wild-hNSC (n=7),Wild-vehicle(n=9)의 각 군 사이에 probe를 찾아가는 시간을 비교하였을 때 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았으나 모든 군 에서 6일 째 probe를 찾아가는 시간이 15초 미만으로 감소하는 것으로 보 아 학습은 이루어지고 있음을 보임.B,실험 7일 째 probetest상 각 군 에서 probe가 있던 위치에 수영하면서 머무는 평균 시간을 비교한 결과 통 계적으로 유의한 차이는 보이지 않음.그러나 대조군 및 실험군 모두에서 H-H buffer를 이식한 경우보다 인간 신경줄기세포를 이식한 경우에 상대 적으로 다소 기억능력이 감소하였으며,정상 대조군보다 APPsw 형질전환 쥐에서 신경줄기세포 혹은 H-H buffer를 이식한 각각의 경우에서 가 다 소 기억능력이 감소함을 보였다.(그래프 상의 수치는 평균±표준오차로 표 시되었음.)

(45)

Ⅳ

Ⅳ.

.

고

고 찰

찰

알쯔하이머병은 치매의 일종으로 뇌기능의 다발성 장애를 초래하는 신 경계질환으로서 일단 발병이 되면 점차 증상이 심해져 정신적 장애가 결국 에는 신체적 장애까지 초래하여 사망에 이르게 된다.현재까지 밝혀진 바 에 의하면 그 인과관계가 명확하지 않으나 축색반에 의한 신경세포사멸 유 도,신경원섬유농축,염증반응 등이 병의 원인일 것이라 생각되고 있다 2,3,6-8,11_{.현재 알쯔하이머병 환자치료와 관련해서는 마이네르트 기저핵의 콜} 린성 신경원세포의 퇴화와 관련해 콜린에스테라제 저해제를 사용하고 있다 4,5_{.그리고 예상되는 병의 기전들과 관련해서 여러 약물들이 임상실험 단} 계에 있는데5,7_{최근에는 phase1임상실험에서 NerveGrowthFactor(NGF)} 를 분비하는 섬유아세포의 뇌 이식을 통해 병의 호전을 보여주는 결과도 있었으나,병을 근본적으로 치료하는 데에는 한계점을 보이고 있는 실정이 다35_{.결국 알쯔하이머병의 치료를 위해서는 병의 악화를 예방하면서 손실} 된 신경세포의 보충 및 시냅스 연결 등을 통한 치료법의 적용 등이 요구되 고 있다. 신경줄기세포는 자가증식 혹은 갱신을 보이며 신경원세포와 신경교세포 로 분화하는 분화의 다능성을 가진 세포로서 비교적 간단하고 안전한 방법 으로 신경계에 이식이 가능하고,이식된 숙주의 신경계에 광범위하게 이주 및 생착함으로서 병적 미세환경을 개선시킬 수 있고,기능부전을 보이거나 사망한 신경세포를 대체하여 신경망을 재생하는 가능성을 가졌다.그리고 줄기세포에 외부유전자를 발현시켜 질병치료에 유용한 단백질의 생체 내 발현과 분비가 가능하고,뇌 발생에 관련된 전사조절 유전자의 도입을 통 하여 기능부전 혹은 사망한 신경세포로의 분화유도를 통한 세포 및 유전자 치료의 적용이 가능하다15-28_. 본 예비연구에서는 생체 외에서 증식,성장,분화 및 특성이 확립된 인 간 신경줄기세포를 알쯔하이머병 동물모델에 뇌 이식하여 공여세포의 이

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주,생착 및 분화 양상을 확인하였고,신경행동학적인 증상의 호전여부를 분석하였다.실험에 사용한 알쯔하이머병 동물모델로는 동물의 신경계에

특이적 활성을 유도하기 위하여 NSE promoter에 인간 APP의 swedish변

이를 가진 유전자를 형질전환한 쥐를 확립하여 사용하였다14_{.인간 변이} APP는 쥐 뇌의 신경원세포에서 특이적으로 발현되었으며,알쯔하이머병의 원인 중 하나로 생각되는 APP 단백질의 특이적 절단에 의하여 형성된 Aβ 1-40/42는 주로 모델동물 뇌의 대뇌피질,해마,편도체에 있는 신경원세포 내에 분포하였다.이는 초기 알쯔하이머병 환자의 뇌에서 보이는 Aβ의 신 경원세포 내에 축적 및 응집된 경우와 비슷하다고 생각된다36,37_. 임신 13주의 인간 태아의 종뇌로부터 추출된 인간 신경줄기세포는 자가 증식이 가능하며 신경원세포 및 신경교세포로의 분화능을 가지고 있었고, 최근 신경줄기세포의 일종으로 알려진 방사성 교세포의 특성도 보였다16,38_. 이러한 특성을 지닌 인간 신경줄기세포를 같은 배에서 출산된 알쯔하이머 동물모델인 APPsw 형질전환 쥐와 정상 대조군 쥐의 뇌에 이식했을 때 공 여세포는 늙은 연령의 성체 쥐임에도 불구하고 해마,뇌 백질 및 피질,편 도체 등에 걸쳐 광범위하게 이주 및 생착함을 보였다.따라서 고령의 성체 쥐에서 특정 뇌 부위에 국소적으로 인간 신경줄기세포를 이식하여도 줄기 세포의 이주적 특성으로 인하여 숙주동물 뇌의 넓은 부위에 다초점성

(multofocal)혹은 전신적 (global)으로 공여세포가 퍼져나가 생착함으로서

광범위한 뇌 지역에 치료적으로 유용한 세포 및 유전자를 전달 할 수 있음 을 보였다.또 이식된 인간 신경줄기세포는 APPsw 형질전환 쥐와 정상 대조군 쥐 모두에서 유사한 분화형태를 보였는데,주로 신경교세포로 분화 하였고 소수에서는 미성숙 신경원세포로 분화하고 일부는 미분화된 상태로 존재하였다.이와 같은 결과는 인간 신경줄기세포는 분화의 다능성이 있음 에도 불구하고 고령의 숙주동물 뇌의 미세환경신호가 주로 신경교세포로 분화하도록 작동할 뿐만 아니라 숙주동물 뇌의 병리적 환경신호가 신경원 세포보다는 신경교세포로의 분화를 촉진하는 것으로 생각되며,기술적으로

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세포 이식술 시 기계적 뇌 손상을 유발하여 뇌에 염증반응을 더욱 촉진시 켰고 이로 인하여 신경줄기세포의 신경교세포로의 분화가 더욱 가속화된 것으로 생각된다30,39,40.실제 실험결과에서도 대조군 및 실험군 모두에서 인 간 신경줄기세포를 이식한 경우 숙주동물의 뇌에서 성상신경교세포의 증식 증이 유발되어 염증반응이 활성화 된 것처럼 보였으며,특히 vehicle을 주 사한 경우에도 정상 대조군의 뇌보다는 형질전환 쥐의 뇌에서 염증반응이 더욱 활성화 된 것처럼 보여 알쯔하이머병 요인을 가진 쥐에서 뇌의 염증 반응성이 더욱 증가함을 간접적으로 제시하였다41_{.학습과 기억능력을 평가} 하는 신경행동검사는 APPsw 형질전환 쥐의 뇌에 인간 신경줄기세포와 H-H buffer를 이식한 경우,한배에서 출생한 정상 대조군 쥐의 뇌에 인간 신경줄기세포와 H-H buffer를 이식한 경우로 나누어 총 4개의 군에서 실 시하였다.모든 군에서 학습과 기억능력에 통계적 차이를 보이지 않았으나 대조군 및 실험군 모두에서 H-H buffer를 이식한 경우보다 인간 신경줄기 세포를 이식한 경우에 다소 기억능력이 떨어지는 경향을 보였다.이것은 아마도 세포이식시에 숙주동물의 뇌에 기계적 손상을 주고 이로 인하여 해 마를 포함한 뇌 전반부에서 성상신경교세포의 증식증이 유발되고,또한 공 여세포가 주로 신경교세포로 분화함으로서 동물모델의 소실된 신경세포를 대체하지 못했으며 병적 미세환경신호도 더욱 악화시켜 결과적으로 인간 신경줄기세포의 이식이 숙주 동물의 기억 및 학습능력에 부정적 영향을 주 게 된 것이라 생각된다40-42. 본 연구에서는 알쯔하이머병 동물모델 확보와 고령의 노화된 쥐를 사용 함에 있어서 장기간의 연구기간이 소요되고 따라서 적은 개체수의 동물을 실험에 사용할 수밖에 없었으며,해마와 대뇌피질 등 극히 뇌기능에 민감 한 부위에 세포이식술을 시행함에 있어서 많은 기계적 뇌손상을 유발하여 신경행동검사에 영향을 주는 다양한 요인들이 함께 관련되어 실험결과의 해석에 어려운 점이 많았으며 신경행동 검사 상 학습 및 기억능력의 향상 을 보여주지는 못했다.이것은 결국 인간 신경줄기세포이식이 알쯔하이머

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병 모델동물의 뇌에서 병적 미세환경을 개선시키지 못했으며,사멸하였거 나 기능부전을 보이는 신경세포의 대체 및 신경회로의 재생을 유도하지 못 하였고,오히려 공여세포가 주로 성상교세포로 분화하여 염증반응을 더욱 가속화시켜 학습 및 기억능력에 나쁜 영향을 미친 것으로 사료된다.그러 나 이식된 인간 신경줄기세포는 고령의 노화된 실험군 및 대조군 성체동물 에서도 숙주동물 뇌의 광범위한 지역에 이주하여 생착이 가능함을 보였고, 적절히 숙주동물의 뇌 조직으로 통합되어 미세 환경신호에 반응하여 일부 공여세포는 희소돌기아교세포 및 신경원세포로도 분화함을 보였다.따라서 이러한 예비연구 결과를 이용하여 향후 연구에서는 실험동물 뇌 손상을 최 소화 하면서 줄기세포를 적절히 이식하는 방법을 개발하고,바이러스성 또 는 비바이러스성 벡터를 이용하여 이식된 줄기세포로 하여금 치료적 유용 성이 높은 신경영양인자들을 분비케 하며,숙주동물 뇌의 염증반응을 감소 시키고 신경변성을 유발하는 원인 단백질을 표적화하여 제거할 수 있는 물 질을 분비토록 인간 신경줄기세포를 조절하여 실험을 진행할 예정이다.그 리고 생체 외에서 뇌신경 발생에 관여하는 다양한 전사조절 단백질을 이용 하여 적절히 인간 신경줄기세포를 특이 신경원세포로 분화 유도한 후 실험 동물의 뇌에 이식하여 알쯔하이머병 동물모델에서 병리적 미세 환경신호를 개선시키고,손상된 신경세포의 대체 및 재생 그리고 신경회로의 복구를 유도하며,결과적으로 학습 및 기억능력의 향상을 유발하는 기능적이며 효 율적인 세포치료 가능성을 실험할 것이다.

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Ⅴ

Ⅴ.

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결

결 론

론

알쯔하이머병은 현재까지 명확한 원인이 아직 규명되지 않았고 따라서 근본적인 치료약물이나 치료방법의 개발이 미약한 만성 퇴행성 신경계질 환으로 뇌에서 주로 신경원세포의 사멸 및 시냅스의 손실 등이 관찰된다. 신경줄기세포는 퇴행성 신경변성을 보이거나 손상된 신경계에 이식 시 국 소병소 부위뿐만 아니라 다병소성 혹은 전신성 신경병소 부위에 특이적으 로 이주 및 생착하여,치료적으로 유용한 미만성 혹은 비미만성 물질을 제공하고,숙주신경계에 세포구조적 그리고 기능적으로 통합되어 손상된 신경세포를 대체 및 재생한다.본 연구에서는 인간 태아 중추신경계로부 터 신경줄기세포를 배양하여 줄기세포의 자가증식과 다분화능을 확인하였 으며,알쯔하이머병 모델동물의 뇌에 인간 신경줄기세포 이식하였을 때 숙주동물의 뇌에서 공여세포의 광범위한 이주 및 생착이 관찰되었고 공여 세포는 주로 신경교세포로 분화하였으며 일부 소수에서 신경원세포로 분 화함을 보였다.그리고 실험동물의 뇌에 인간 신경줄기세포 이식 시 성상 신경교세포의 증식증이 동반된 염증반응의 발생이 관찰되었으며,소수의 동물을 대상으로 인간 신경줄기세포를 뇌 이식한 후 숙주동물의 신경행동 검사를 실시한 결과 학습과 기억능력에 의의있는 변화는 관찰되지 않았 다.본 예비연구를 통하여 만성 진행성 노인성 치매인 알쯔하이머병 동물 모델의 뇌에 인간 신경줄기세포를 이식하여 생체 내에서 이식된 인간 신 경줄기세포의 특성을 파악하였고,이러한 실험은 향후 인간 신경줄기세포 의 적절한 신경세포로의 분화유도,신경줄기세포를 통한 신경영양인자의 공급 및 염증반응의 감소 유도 등을 통하여 다방면에서 효율적인 세포 및 유전자치료 적용 가능성을 평가하는데 유용될 수 있을 것이다.

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