근적외선 광을 이용한 비선형 현미경 개발
Development of nonlinear microscopy using broadband near-infrared
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최대식*, 이장혁*, 오명규, 엄태중, 김훈섭, 고도경* *광주과학기술원, 고등광기술연구소 [email protected] 광학 현미경은 바이오, 의학, 광학, 최첨단 산업 등등 수많은 영역에서 매우 중요한 역할을 하며 서로의 상호보완 적인 협력으로 빠른 진보를 하고 있다. 광학 현미경들 중에서 레이저를 이용한 현미경은 고감도 높은 공간 분해능을 가진다. 또한 3차원 영상이 가능한 여러 종류의 현미경들이 있다. 레이저를 이용한 현미경은 크게 두 종류로 분리 할 수 있을 것이다. 형광을 이용한 현미경과 그렇지 않은 현미경이다. 공초점 레이저 형광 현미경은 특정 위치에 형 광을 착색한 샘플을 이용하여 현미경 렌즈에 집속된 부분에서 발생된 형광을 핀홀 사용으로 얻고 이를 영상화한다. 오늘날 가장 많이 사용되고 있는 현미경중 하나이다. 하지만, 이 기술은 두 가지 단점을 가진다. 즉, 형광 탐침자의 광표백 그리고 세포 기능에 직접적인 영향을 주어 세포의 본래의 성질을 알 수 없다. 화학적 선택도는 자연적인 표 지 또는 인공적인 형광 탐침자에 의해서 제공된다. 형광을 사용하지 않은 현미경은 2차 조화파 발생, 3차 조화파 발 생, Raman 그리고 CARS(Coherent Anti-stokes Raman scattering) 현미경이 있다. 샘플 내에서 물질의 특정 분자 의 양 및 영상을 얻기 위한 장비는 폭 넓게 사용되고 있는 Raman 분광을 이용하는 Raman 현미경이 있다. 이것은 레이저 광의 광자와 분자 간에 발생된 비탄성 충돌의 결과로 나타나는 자발적 산란으로 광자와 분자간의 진동 에너 지 교환에 따라 스톡스 라만의 신호가 발생되어 이를 영상화한 것이다. 그러나 Raman 신호 단면적의 효율이 낮아 서 강한 여기 레이저 파워가 필요할 뿐만 아니라, 하나의 영상 이미지를 얻는데 수 시간 이상이 소모되는 단점을 가 지고 있다. 1990년대 Xie 그룹은 Raman 현미경의 장점을 사용하고 단점을 보안하기 위하여 기존의 CARS (Coherent Anti -Stokes Raman Scattering) 비선형 광학 현상을 응용하여 이미징 현미경을 개발하고 그 유용성을 실험적으로 증명하였다(1). CARS 신호의 세기는 분자의 진동 레벨 에너지와 일치하는 공명 진동수에 배합하여 증가함으로, 일반적으로 기존의 Raman 신호보다 약 105배 이상 증가한다고 알려져 있다. CARS는 사광파 혼합 비선형 광 공정이므로 본질적으로 3차원 영상이 가능하며, 픽 파워가 높은 펄스폭이 좁은 나노초 이하의 레이저를 사용해야 한다.
multiplex CARS 시스템은 single CARS 시스템에 비해서 어떠한 광학적 정렬 없이 여러 개의 Raman 신호를 동 시에 측정 할 수 있으며 정확한 Raman 신호의 상대적인 세기를 얻을 수 있다. 일반적으로 CARS 현미경은 크게 광 원의 종류에 의하여 2 대의 각기 다른 피코초 레이저를 동기화 하여 사용하는 경우와 1대의 펨토초 레이저와 OPO 를 이용하여 2가지 각기 다른 파장을 발생하여 사용한다. 이 방법들은 다소 복잡하고 광의 정렬이 어렵고 넓은 공간 이 필요할 뿐만 아니라 레이저간의 펄스 대 펄스간의 시간 지터링이 발생하는 단점이 있다.
우리는 실험실에서 직접 제작한 한 대의 펨토초 레이저와 PCF(Photonic Crystal Fiber)를 이용하여 CARS 현미 경 시스템을 만들었다(2). 실험장비는 그림1과 같다. 펨토초 레이저는 중심 파장이 약 783 nm, 펄스폭이 약 50 fs, 반 복률이 80 MHz와 최대파워는 약 600 mW를 발생시킨다. 이 펨토초 레이저에서 발생된 광은 광 분할기(3:7)를 통하 여 두 방향으로 광을 분리한다. 투과한 방향으로는 공간 필터링을 사용하여 가우시안 광을 만들고 광 크기를 약 3배 증가시킨다. 또한 스펙트럼이 넓은 이 광을 좁은 밴드 패스 필터를 사용하여 스펙트럼 폭을 줄이며 이광을 CARS의 펌프 광으로 사용한다. 광 분할기에서 반사된 광의 경로에서는 PCF( NL-PM-780, 33 cm, crystal fiber)에 현미경 렌즈를 통하여 광을 집속 시켜 초연속 광을 발생시키며 롱 패스 필터를 사용하여 근 적외선광 만을 투과 시키며 이 광을 CARS의 스톡스 광을 사용한다. 두광을 시간적 공간적으로 일치하기위해서 시간적으로는 펌프 광 경로에 시간 지연 장치를 공간적으로는 이색 거울을 사용한다. 시간적 공간적으로 일치된 광은 갈바노 스캐너 장비를 통과하고 237
그림 1 The Photograph of nonlinear microscopy. 현미경 렌즈를 통해 샘플에 집속 한다. 샘플에서 발생한 CARS 신호는 또 다른 현미경 렌즈를 통해 신호를 수집하 고 숏패스 필터를 사용하여 펌프광과 스톡스 광을 제거한 후 단색기와 CCD 카메라를 이용하여 신호의 스펙트럼을 측정할 수 있으며 PMT를 사용하여 샘플의 영상을 얻을 수 있다. 넓은 영역에서 발생된 분자의 진동 밴드를 얻을 수 있으며 갈 바노 스캐너를 이용하여 매우 빠른 영상을 구현 할 수 있는 장점을 가진 장비를 개발하였다. 또한 레 이저 스캐닝 이광자 형광 현미경을 CARS 현미경과 같이 영상을 얻을 수 있는 복합 현미경 장비이므로 생물, 화학, 의광학에 크게 기여할 것으로 기대된다. 참고 문헌
(1). Andreas Zumbusch, Gary R. Holtom, and X. Sunney Xie, "Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-stokes Raman scattering", Phys. rev. lett. 82 (1999).
(2). Dae Sik Choi, Sae. C. Jeoung, and Byung H. Chon, " Thickness dependent CARS measurement of polymeric films without depth-profiling." Opt. Exp. 16, (2008).
