TEM 투과전자현비경

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Tools of Cell biology

Cell – the minimal unit of life

Robert Hooke first coined the term ‘cell” following the observation of a piece of cork with a simple light microscope in 1665

of cork with a simple light microscope in 1665

The proposal of the cell theory as the birth of contemporary cell biology Microscopic studies of plant tissues by Schleiden and of animal tissues by Microscopic studies of plant tissues by Schleiden and of animal tissues by Schwann led to the same conclusion: All organism are composed of cells.

Shortly thereafter, it was recognized that cells are not formed de novo but arise only from division of preexisting cells

arise only from division of preexisting cells

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Light microscopy Light microscopy

Contemporary light microscopes are able to magnify objects upt to a p y g p g y j p thousand times. Since most cells are between 1 and 100 µm in diameter, they can be ovserved by light microscopy, as can some of the larger

subcellular organelles, such as nuclei, chloroplasts and mitochonria.g p Magnification

Resolution, The limit of resolution of the light microscope is approximately 0.2 µm

Bright-field microscopy Phase-contrast microscopy

Fl i

Fluorescence microscopy Confocal microscopy Electron microscopy

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Bright light microscope Phase-contrast microscope

Light passes directly through the cell and the ability to distinguish different parts of the cell depends on contrast resulting from the

빛이 표본을 통과할 때 생기는 구성물 질에 따른 빛의 굴절률의 차이를 상으 로 전환시킴 염색이 없어도 관찰

p g

absorption of visible light by cell components

Contrast is the difference in light intensity between the image and the adjacent background relative to the overall background intensity.

로 전환시킴. 염색이 없어도 관찰.

In many cases, cells are stained with dyes that react with proteins or nucleic acids in order to enhance the contrast between different parts of the cell

Without staining, the direct passage of light does not provide sufficient contrast

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현미경 관찰을 위한 조직표본 제작법

(광학현미경 관찰을 위한 파라핀 포매를 중심으로)

* 절편제작 (Section)

: 조직이 들어있는 파라핀 블럭을 마이크로톰으로 1~20㎛

두께로 절단하여 염료의 침투와 빛의 투과를 용이하게 하는 과정

조직절취(Sampling) → 고정(Fixation) → 탈수(Dehydration) → 투명(Clearing) → 포매(Embedding) → 절편제작(Section) →

→ 염색(Staining) → → 봉입(Mounting)

* 고정 (Fixation)

* 염색 (Staining)

: 조직의 구성성분을 선택적으로 염색해 주는 염료의 혼합액을 사용하여 여러 조직의 구성성분을 뚜렷하게 하고 이들을 쉽게 구분할 수 있도록 염색하는 과정

고정 (Fixation)

: 조직의 형태적, 분자적 특징을 보존하기 위해 구성물질을 안정화(Stabilizing)하거나, 교차연결(Cross-linking)할 수 있는 시약 사용

예 : 단백질의 침전과 응집 → Mercuric chloride, Picric acid 교차연결 촉진 → Formalin Glutaraldehyde

교차연결 촉진 → Formalin, Glutaraldehyde

* 탈수 (Dehydration)와 투명(Clearing)

: 조직 속에 포함된 수분을 제거하고 포매물질(파라핀 등)이 용해될 수 있는 유기용매제를 침투시키는 과정

- 탈수제 : 물과 섞일 수 있고 유기용매와도 섞일 수 있어야 됨.

예: 알콜, 아세톤

- 투명화제 : 탈수제와 섞일 수 있고 포매물질(파라핀)을투명화제 : 탈수제와 섞일 수 있고 포매물질(파라핀)을 용해시킬 수 있는 유기용매 예 : 자일렌(Xylene)

* 포매 (Embedding)

: Microtome 으 로 얇 은 조 직 절 편 (LM: 1 ~ 20㎛, EM:

0 02 0 1㎛)을 만들기 위하여 고정된 조직내부로 단단한 0.02~0.1㎛)을 만들기 위하여 고정된 조직내부로 단단한 포매물질을 침투시켜 굳히는 과정

# 58~60℃의 파라핀용액에 투명화된 조직을 넣으면 xylene 등의 투명화제는 빠져 나오고 그 자리에 파라핀 용액이 침투해 들어감

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TEM 투과전자현비경

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TEM

투과전자현비경 transmission electron microscope은 광학현미경과 그 원리가 비슷하다.

투과전자현비경 t a s ss o e ect o c oscope은 광학현미경과 원리가 비슷하다.

전자현미경에서의 광원은 높은 진공 상태(1x10-4 이상)에서 고속으로 가속되는 전자선이 다. 전자선이 표본을 투과하여 일련의 전기자기장 electromagnetic field 또는 정전기장 electrostatic field을 거쳐 형광판이나 사진필름에 초점을 맞추어 투사된다. 이 전자의 파 장은 가속전압에 따라 다르며 흔히 사용되는 전압(100 KV)에서의 전자파장은 0.004nm이 다 전자현미경의 이론적 분해능(해상력)은 약 0 001 이나 생물학적 표본에서 사용되는 다. 전자현미경의 이론적 분해능(해상력)은 약 0.001nm이나 생물학적 표본에서 사용되는 분해능은 약 0.2nm(side entry), 0.14nm(top entry)이다.

전자현미경은 확대율과 해상력이 뛰어나 광학현미경으로 관찰할 수 없는 세포 및 조직의 전자현미경은 확대율과 해상력이 뛰어나 광학현미경 관찰할 수 없는 세 및 직의 미세한 구조를 관찰할 수 있으며, 단백질과 같은 거대분자보다 더 작은 구조도 볼 수 있다.

한편 이러한 특수구조를 설명하는 새로운 용어가 출현되기도 했다.

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SEM 주사전자현미경

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SEM

주사전자현미경 [scanning electron microscope (SEM)]은 보다 최근에 개발되었으며 투과전 주사전자현미경 [ g p ( )]은 다 최근에 개발되었 며 투과전 자현미경과는 다소 다르다. 주사전자현미경은 전자가 표본을 통과하는 것이 아니라 초점이 잘 맞추어진 전자선 (electron beam)을 표본의 표면에 주사한다 주사된 전자선이 표본의 한 점에 집중되면 일차전자만 굴절되고 표면에서 발생된 이차전자는 검파기 (detector)에 의해 수집된다. 그 결과 생긴 신호들이 여러 점으로부터 모여들어 음극선관 (cathod ray tube)에 상을 형성하게 한다 주사전자현미경의 특징은 초점이 높은 심도를 이용해서 비교적 큰 표본 상을 형성하게 한다. 주사전자현미경의 특징은 초점이 높은 심도를 이용해서 비교적 큰 표본 을 입체적으로 관찰할 수 있다는 것이다.

전자beam을 시료 위에 주사시켜서 시료로부터 튀어나온 2차 전자를 모아서 검출한 후 여러 전자 을 시 위에 주사시켜서 시 부터 튀어나온 차 전자를 아서 검출한 후 여러 가지 복잡한 기계장치를 거친 후 CRT에 영상화시키는 전자 현미경이다.

TEM은 얇은 시편(60nm정도)을 beam이 투과하여 관찰하므로 2차적인 또는 단면적인 구조

를 나타내지만 SEM은 시료 위를 주사된 상을 관찰하므로 3차원적인 입체 상을 관찰할 수 있

다. TEM이나 SEM은 각각의 camera system을 통하여 관찰 즉시 촬영을 할 수 있게 되었다.

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Fluorescence microscope 형광현미경 Fluorescence microscope 형광현미경

Goal is to illuminate specimen with an excitation wavelength, to capture emitted light. Fluorochromes have a peak excitation and a peak emission.g p p Fluorochromes include either chemically synthesized low molecular weight molecule, e.g. Texas Red, or proteins (green fluorescent protein)

Excitation filters

– Permit only selected wavelengths of light

through to the specimen through to the specimen Barrier Filters (emission) – Block/absorb excitation wavelengths and permit only selected emission wavelengths to pass toward

toward

the detector.

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C f l i

Confocal microscopy

Low resolution of conventional fluorescence microscopy as a result of out-of-focus fluorescence.

Confocal microscopy allow images of increased contrast

d d t il t b bt i d b l i fl f

and detail to be obtained by analyzing fluorescence from only a single point in the specimen.

A small point of light, usually supplied by a laser, is focused on the specimen at a particular depth. The

itt d li ht th h i h l t l d t

emitted light pass through a pinhole aperture placed at precisely the point where light emitted from the chosen depth of the specimen comes to a focus.

Consequently, only light emitted from the plane of focus is bl t h th d t t

able to reach the detector.

Scanning across the specimen generates a two-

dimensional image of the plane of focus, a much sharper that that obtained with standard fluorescence microscopy.

Mo eo e a se ies of images obtained at diffe ent depths Moreover, a series of images obtained at different depths can be used reconstruct a three-dimensional image.

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GFP-fusion proteins

/ immunostaining

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GFP- Green Fluorescent Protein

• The green fluorescent protein (GFP) is a protein, com prised of 238 amino acids (26.9 kDa), originally isolate d from the jellyfish Aequorea victoria/Aequorea aequo rea/Aequorea forskalea that fluoresces green when ex posed to blue light.

• Fluorophore made by 3 aminoacids (65-67) ”protected”

in a cylinder the tripeptide Ser65 Tyr66 Gly67 in a cylinder the tripeptide Ser65–Tyr66–Gly67

Fluorescent green pigs were first bred by a group of researchers led by Wu Shinn-Chih at the Department of Animal Science and Technology at National Taiwan University, announcing the results of the experiment in January 2006.

The transgenic pigs were created by adding DNA encoding for the green fluorescent protein from fluorescent jellyfish to pig embryos which were

th i l t d i th t f f l i Th i l i th

then implanted in the utereus of female pigs. The pigs glow green in the dark, and have clearly green-tinged skin and eyes in daylight.

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– Blue BFP – Cyan CFP Cyan CFP – Green GFP – Yellow YFP – Yellow YFP – Red DsRed

HcRed

HcRed

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Tissue & subcellular localization of a protein

Protein X GFP Introduction into cells

Scarecrow protein in Arabidopsis

Yeast (mitochondria) C. elegans nervous system

CFP YFP CFP GFP

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400 500 600 700

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Colocalization

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Immunostaining / Immunofluorescenceg 특정 단백질이 세포 내 어떤 위치에 어떤 양 상으로 존재하는지 확인하는 면역염색방법

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General procedure of immunodetection Primary antibody

Detection하고자 하는 단백질 (X) 에 특이적으

결합하 항체

로 결합하는 항체

단백질X를 rabbit, mouse, goat, donkey와 같 은 h t에 주사하면 단백질X에 대한 항체가

light

은 host에 주사하면 단백질X에 대한 항체가 생성

Secondary antibody Secondary antibody

Primary antibody를 인식하여 결합하는 또 다 른 항체

른 항체

예를들어 rabbit antibody를 goat에 주사하면 rabbit antibody에 반응하는 항체생성

rabbit antibody에 반응하는 항체생성 Secondary antibody에는 horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, peroxidase, alkaline phosphatase,

galactosidase와 같은 효소나 fluoresence dye 가 conjugation되어있음

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Western blotting

Western blotting

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Immunofluorescence

Animal cells are grown on slide

slide

ÆFixation with Foraldehyde (formalin)

(formalin)

Æ Cell permeabilization with detergent

Æ Primary Antibody

Æ Secondary antibody y y (secondary antibody

conjugated with Cy3, Cy5)

Æ Fl i

Æ Fluorescent microscopy

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Immunofluorescent detection of actin and tubulin: Human cells in culture were stained with immunofluorescent antibodies against actin (blue) and tubulin (yellow). Nuclei are stained with a red fluorescent dye

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In situ hybridization

특정 DNA sequence나 RNA가 세포 내 어떤 위치에 어떤 양상

특정 q 가 세 내 어 위치에 어 양상

으로 존재하는지 확인

Localization of Xlerk mRNA in Xenopus oocytey

X chromosome

inactivation. A candidate for this inactivation, Xist RNA, is visualized by in situ hybridizationy

Localization of a DNA clone to a polytene chromosome by in situ chromosome by in situ hybridization

Localization of the gene encoding lamin B receptor

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Nucleic Acid Hybridization

S th Bl tti Southern Blotting

Identifying Specific DNA Fragments (Edward Southern--the pioneer)

stack of paper towels

nitrocellulose filter

gel

nitrocellulose with bound nucleic aci

Genomic DNA에 존재하는 특정 유전자의 위치는 S th (1975)이 고안한 t f

labeled DNA or RNA markers 위치는 Southern(1975)이 고안한 transfer

방법을 통하여 결정할 수 있다. 이 방법은 genomic DNA를 하나 혹은 여러가지 제한 효소로 자른 다음 생성된 각 DNA 조각을 agarose gel 전기영동하여 크기별로 분리

as size markers agarose

gel sponge

buffer seale

plasti b

NUCLEIC ACIDS SEPARATED ACCORDING TO SIZE BY

SEPARATED NUCLEIC ACIDS BLOTTED ONTO NITROCELLULOSE FILTER BY

PAPER WITH

SEPARATED NUCLEIC ACIDS HYBRIDIZED WITH LABELED PROBE

한 후, gel 상에서 DNA를 변성시키고 gel 로부터 solid support(흔히 nitrocellulose 혹은 nylon membrane)으로 이동시킨다.

이렇게 gel로부터 membrane으로 이동될 때 DNA조각들의 상대적인 위치는 유지되

ACCORDING TO SIZE BY bag

ELECTROPHORESIS IN AN AGAROS GEL

ONTO NITROCELLULOSE FILTER BY SUCTION OF BUFFER THROUGH BOTH GEL AND PAPER

때 DNA조각들의 상대적인 위치는 유지되 게 된다. Membrane에 부착된 DNA는 방사 선 동위원소 혹은 비방사선 물질로 표지된 DNA 혹은 RNA(probe이라 부름)와

hybridization되고 자가방사법등을 통해 그 위치를 가시화하게 된다 이러한 기술은

labele probe

AFTER REMOVAL OF UNBOUND PROBE, BANDS COMPLEMENTARY TO LABELED PROBE ARE REVEALED BY SPECIFIC DETECTION OF LABEL

위치를 가시화하게 된다. 이러한 기술은 genomic DNA 뿐만 아니라 plasmid의 분 석, cosmid, bacteriophage 등의 분석에도

적합한 방법이 될 수 있다. positions

of detec

of labeled markers

band

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Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is a distance-dependent interaction between the electronic excited states of two dye molecules in which excitation is transferred from a donor molecule to an acceptor molecule without emission of a photon.

•Donor and acceptor molecules must be in close proximity (typically 10–100 Å).

•The absorption spectrum of the acceptor must overlap the fluorescence emission

•The absorption spectrum of the acceptor must overlap the fluorescence emission spectrum of the donor (see Figure).

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Growth of Animal Cells in Culture (In vitro animal cell culture)

( t o a a ce cu tu e)

Animal cell culture are initiated by the dispersion of a piece of tissue into a suspension of its

into a suspension of its

component cells, which is then added to a culture dish containing nutrient media

nutrient media.

Most animal cell types attach and grow on the plastic surface of

grow on the plastic surface of dishes used for cell culture.

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Culture media

A major advance made by Harry Eagle in 1955 A major advance made by Harry Eagle in 1955

The media contains salts, glucose, amino acids, vitamins

The growth media also contains 5~10% serum which serves as a source of polypeptide growth factors for cell growth and differentiation

polypeptide growth factors for cell growth and differentiation

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Cell lines

Cells derived from a single parental transformed cell Cells derived from a single parental transformed cell

Normal cell line: most cell lines cannot be grown in culture indefinitely (usually 50-100 doublings)

(usually 50 100 doublings)

Transformed cell line: These types of cells do not age in culture, ‘immortal’

Virus infection or the expression of ‘large T-antigen’

(a p53 inhibitor) leads to immortalization

( p )

Common cell lines Common cell lines

BHK Fibroblast Baby hamster kidney CHO Epithelial Chinese Hamster Ovary Vero Fibroblast Monkey Kidney

Vero Fibroblast Monkey Kidney L Fibroblast Mouse fibroblast

3T3 Fibroblast Mouse tumor fibroblast HeLa Epithelial Human cervical cancerp WI38 Fibroblast Human embryonic lung 293 Fibroblast Human embryonic kidney C6 Glial Rat gliomag

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Figure

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References

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