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(3) 국문초록. 약물수송체 (Drug transporter)가 약물상호작용 (DDI)에 중요한 역할을 한다는 것이 많은 연구를 통해 밝혀지고 있다. 그러나 이를 임상적으로 증명하는 것은 시간과 자본이 많이 소요될 뿐 아니라 임상시험에서 인체에 위해성을 유발할 수 있기 때문에 큰 제약이 따른다.. 따라서. 만약,. 신약개발. 초기단계에서. 약물상호작용을. 예측할 수 있다면 신약개발 효율성을 크게 증대시킬 수 있으며 합리적인 신약 후보군을 선택하는데 표준적인 기준을 제공할 수 있다. 이러한 점에서 human transporter 를 발현시킨 in-vitro cell line system 은 합리적인 실험계로 볼 수 있으며 transporter 의 성질에 따라 uptake 또는 transport 실험계를 선택할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 약물상호작용에 큰 영향을 미치는 것으로 알려진 FDA 지정 중요 7 가지 transporter 중, human OAT3 를 선택하여 cloning 하고 이 gene 을 MDCK cell 에 기능을 안정적으로 발현하는 cell line 을 구축하였다. RT-PCR 과 function study 를 통해 발현을 확인한 후, 상용화된 8 가지 모델 화합물과의 DDI. 평가. 실험을. 실시하였다.. 화합물의. DDI. 양상은. 문헌과. 유사하게 나타났으며, DDI potency 인 IC50 및 transporter 의 Km ii. (4) / Vmax 를 표준적인 동태결과 해석법에 따라 평가하였다. 따라서 본 연구를 통하여 DDI 와 관련된 중요 transporter 인 OAT3 를 cloning 하고 기능적으로 발현하였으며, 향후 본 세포주를 이용하여 특정 물질에 대한 OAT3 경유 DDI 가능성을 신약개발 초기에 screening 할 수 있을 것으로 사료되었다.. 주요어 : OAT3, DDI, Estrone 3-sulfate (E3S), IC50 학번 : 2011-21769. iii. (5) 목 차 국문초록 .......................................................................................... ii 목 차 .............................................................................................. iv 표 목차 ........................................................................................... v 그림 목차 ....................................................................................... vi 1. Introduction .............................................................................. １ 1.1. Drug transporter................................................................ １ 1.1.1. OAT3 (SLC22A8) ...................................................... １ 1.2. 약물상호작용 (DDI) ........................................................... ２ 1.3. In-vitro screening system ............................................... ３ 2. Materials ................................................................................... ５ 3. Methods .................................................................................... ８ 3.1. Establishment of stable cell line ....................................... ８ 3.1.1. Cloning ......................................................................... ８ 3.1.2. Subcloning ................................................................１０ 3.1.3. Sequencing ...............................................................１１ 3.1.4. Mutagenesis .............................................................１２ 3.1.5. Transfection and selection ......................................１４ 3.1.6. RT-PCR ...................................................................１５ 3.1.7. Function study .........................................................１５ 3.2. DDI screening .................................................................１７ 4. Result .....................................................................................１９ 5. Discussion & Conclusion .......................................................２９ 6. Reference ..............................................................................３２ Abstract iv. (6) 표 목차 표 1 LB media .............................................................................. ５ 표 2 Cell culture media ................................................................ ６ 표 3 Transport media .................................................................. ７ 표 4 RT Reaction mixture ........................................................... ８ 표 5 RT 조건 ................................................................................ ８ 표 6 PCR Reaction mixture ......................................................... ９ 표 7 PCR 조건 ...........................................................................１０ 표 8 Ligation mixture 와 ligation 조건 ....................................１１ 표 9 Mutagenesis mixture ........................................................１２ 표 10 Mutagenesis 조건............................................................１３ 표 11 RT-PCR 용 프라이머 .....................................................１５ 표 12 OAT3 Function study .....................................................１６ 표 13 RI substrate specification...............................................１６ 표 14 DDI screening 약물 .........................................................１８ 표 15 MDCK-OAT3 의 function study 결과 ..........................２２ 표 16 OAT3 의 Km, Vmax .......................................................２３ 표 17 Inhibitor 로 작용한 모델 약물들의 IC50 ........................２８. v. (7) 그림 목차 그림 1 주요 장기에 분포하는 transporter ................................... ４ 그림 2 pcDNA3.1(-)/myc-his vector map .............................１１ 그림 3 OAT3 PCR 젤 전기영동 결과 ........................................１９ 그림 4 OAT3 Subcloning 결과 ..................................................１９ 그림 5 OAT3 sequencing 결과 .................................................２０ 그림 6 OAT3 stable cell line RT-PCR 결과 ............................２１ 그림 7 MDCK-OAT3 function study 결과 ...............................２２ 그림 8 OAT3 의 Km, Vmax 평가 .............................................２３ 그림 9 Rifampicin 에 대한 DDI screening ...............................２４ 그림 10 Rosuvastatin 에 대한 DDI screening .........................２４ 그림 11 Pravastatin 에 대한 DDI screening ............................２５ 그림 12 Digoxin 에 대한 DDI screening ..................................２５ 그림 13 Cyclosporin A 에 대한 DDI screening .......................２６ 그림 14 Cimetidine 에 대한 DDI screening .............................２６ 그림 15 Cidofovir 에 대한 DDI screening ...............................２７ 그림 16 Clevudine 에 대한 DDI screening ..............................２７. vi. (8) 1. Introduction 1.1. Drug transporter Drug transporter 는 인간의 다양한 조직에 존재하며, 내인성, 외 인성. 물질을. 흡수. (Absorption),. 분포. (Distribition),. 대사. (Metabolism), 소실 (Excretion) 하는 데 중요한 역할을 한다. 소 장과 간에 집중적으로 발현된 약물대사효소 (metabolizing enzyme) 와는 달리 그 분포 양상이나 발현 정도는 조직마다 다양하다 (그림 1). 약물동태학적 프로파일에 밀접하게 관여함에 따라 약물의 안전 성 (safety), 유효성 (efficacy) 문제와도 직결되어 있기 때문에 신 약개발과정에서 그 중요성이 커지고 있는 추세이다. Transporter 의 특성에 따라 여러 가지 방법으로 나눌 수 있으나 대게 influx transporter 로 알려진 SLC transporter 와, efflux transporter 인 ABC transporter 로 분류한다.. 1.1.1. OAT3 (SLC22A8) OAT3 는 SLC22 family 에 속하는 transporter 로서 신장의 근 위세뇨관에 주요하게 발현되어 있으며 (그림 1) 그 외 간, 뇌, 폐, 근육 등에도 있다. Basolateral memberane 에 존재하여 내인성, 외 １. (9) 인성 물질을 체내로 분포하고, 신장으로 배설하는 데 중요한 역할을 한다. 내인성 물질인 prostaglandin, 요산, 담즙산, 호르몬 포합체 등과 함께 많은 종류의 항생제, 항바이러스제가 OAT3 의 기질이 된다. OAT1 과 구조적, 기능적 유사성이 크며, OATP family 와도 상당부분 기질을 공유한다.. 1.2. 약물상호작용 (DDI) Drug transporter 에 의해 체내동태양상이 크게 영향 받는 약물 인 경우 함께 투여된 다른 약물이 inhibitor 로 작용하여 혈중 프로 파일이 크게 변할 수 있다. 이처럼 다른 약물과의 상호작용 (DDI) 측면에서도 transporter 의 중요성이 커지고 있는데, 최근 연구가 활발히 진행됨에 따라 FDA 에서는 약물상호작용에 주요한 영향을 미치는 7가지 transporter 을 발표했으며, 신약개발 승인 과정에서 이에 대한 자료를 요구하고 있다. 7 가지 transporter 는 4가지 SLC transporter (OATP1B1, OATP1B3, OAT3, OCT2) 와 2 가 지 ABC transporter (P-gp, BCRP) 로 구성되어 있다. 예를 들어, cyclosporine 은 고지혈증 치료제인 pravastatin, rosuvastatin, pitavastatin 의 AUC 를 각각 10 배, 7 배, 5 배 높이는 것으로 알려져 있는데, cyclosporine 이 OATP1B1 을 비롯한 transporter 을 inhibition 하기 때문이다. 또한 lopinavir 와 ２. (10) ritonavir 은 Bosentan 의 AUC 를 5~48 배로 증가시키는데, bosentan 은 therapeutic window 를 벗어날 경우 간독성을 유발하므로 병용 투여 시 주의해야 한다.. 1.3. In-vitro screening system 약물상호작용을 임상적으로 평가하는 것은 직접적일 수 있으나 인체 위해성을 유발할 수 있을 뿐 아니라 시간적, 자본적 소요가 크므로 한계가 있다. 따라서 이를 대체하면서 보완 가능한 in-vitro system 구축이 필요하다. 본 연구에서는 인간 drug transporter 을 안정적으로 과발현시킨 MDCK cell line system 을 선정하였으며 transporter 의 특성에 따라 적절한 assay 를 선택하여 의미 있는 데이터를 얻을 수 있었다.. ３. (11) 그림 1 주요 장기에 분포하는 transporter. ４. (12) 2. Materials *Cloning Human liver total RNA (Takara) Maxime RT-PCR PreMix Kit (iNtRON BIOTECHNOLOGY) Ex Taq polymerase, Restriction enzymes (Takara) QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagen) E.coli dH5-α competent cell (Takara) Welprep Gel Extraction Kit, Welprep Plasmid Miniprep Kit (Welgene) LB media (전체를 500ml로 맞춘다, 표 1) 표 1 LB media Materials. Mass. Tryptone. 5g. NaCl. 5g. Yeast extract. 2.5g. Agarose(고체배지일 경우). ５. 제조사. BecktonDickinson(BD). (13) *Stable cell line formation MDCK pcDNA3.1(-)myc-his , Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Hygromycin (50mg/ml), Geneticin (G418, 50mg/ml) (Invitrogen) 25T, 75T flask (BD) Cell culture media (전체 500ml, 표 2) 표 2 Cell culture media Material. Volume. DMEM. 433ml. FBS. 50ml. Penicillin-streptomycin. 5ml. HEPES. 5ml. Gentamicin. 2ml. Non-essential amino acid. 5ml. *Function study Estrone 3-sulfate (sigma) [3H] Estrone 3-sulfate (Perkinelmer) Rosuvastatin (한국유나이티드제약) RNeasy Mini Kit (Qiagen). ６. 제조사. Welgene. Sigma. (14) Poly-L-Ornitine (Sigma), Bradford reagent (Biobasic) 24well plate (Corning), 1N NaOH Ultima Gold LSC-coctail (Packard bioscience) Transport media (TM, 전체 1L, 표 3) 표 3 Transport media Materials. Mass. Hank’s Balanced Salts(HBSS). 9.7g. HEPES. 2.38g. Glucose. 1.95g. NaHCO₃. 0.35g. 제조사. Sigma. *DDI screening Substrate: Estrone 3-sulfate (sigma), [3H] Estrone 3-sulfate (Perkinelmer) 8 model compounds: Rifampicin, Pravastatin, Digoxin, CsA, Cimetidine, Cidofovir (sigma), Rosuvastatin (한국유나이티드제 약), Clevudine. ７. (15) 3. Methods 3.1. Establishment of stable cell line 3.1.1. Cloning Human liver total RNA 를 template 로 사용, Maxime RTPCR PreMix Kit 를 이용하여 Reverse transcription (RT) 를 수 행하였다. 반응 조건은 다음과 같다 (표 4, 5). 표 4 RT Reaction mixture. Materials. Volume. RNase free water. 18 ㎕. RNA (500ng/㎕). 2 ㎕ Total 20 ㎕. 표 5 RT 조건. Reaction step. Temperature. Time. cDNA synthesis. 45 ℃. 60 min. RTase inactivation step. 95 ℃. 5 min. ８. (16) RT. 결과로. 얻은. cDNA. 를. template. 로. 하여. Ex. Taq. polymerase 를 이용, PCR 을 수행하였다. 반응 조건 (표 6, 7) 과 primer 은 다음과 같다. hOAT3 sense strand (및 줄 친 부분은 Hind III site이다.) 5’-CCC AAG CTT GCC GCC ACC ATG ACC TTC TCG GAG ATC CTG-3’. hOAT3 antisense strand (및 줄 친 부분은 Xho I site이다.) 5’-CCG CTC GAG CGC TGT TTA TTG AAA CCT CCC-3’ 표 6 PCR Reaction mixture. Materials. Volume. RNase free water. 14.15 ㎕. 10x Ex Taq buffer. 2 ㎕. dNTP. 1.6 ㎕. Template DNA. 1 ㎕. Primer(sense, antisense). 0.5 ㎕ x 2. Polymerase. 0.25 ㎕ Total 20 ㎕. ９. (17) 표 7 PCR 조건. Temperature. Time. Cycles. 94 ℃. 5 min. 1. 94 ℃. 30 sec. 50~65 ℃. 30 sec. 72 ℃. 2 min. 72 ℃. 10 min. 30 (2~4 step). 1. 3.1.2. Subcloning OAT3 gene (약 2100bp) 을 젤 전기영동한 후 gel extraction 하여 그 DNA 를 얻었다. Primer design 시 고려했던 enzyme site 인 Hind III 와 Xho I 으로 double digestion 후 pcDNA5-FRT vector로 옮기고 다시 Nhe I 과 Xho I 을 사용하여 MDCK cell 에 transfection 시킬 최종 vector 인 pcDNA3.1(-)/myc-his 로 subcloning 하였다 (그림 2). 잘려진 DNA 와 vector 의 ligation 은 아래와 같은 조건으로 하였다 (표 8). DNA 농도가 너무 클 경 우 ligation 효율이 떨어지므로 적정 농도로 희석해야 한다.. １０. (18) 그림 2 pcDNA3.1(-)/myc-his vector map. 표 8 Ligation mixture 와 ligation 조건 Materials. Volume. DNA Ligation Mix. 7.5 ㎕. DNA. 7 ㎕. Vector. 0.5 ㎕. Total 15 ㎕, 16℃ Overnight. 3.1.3. Sequencing PCR 에 사용한 Ex Taq polymerase 는 error rate 가 매우 낮 다고 알려져 있으나 mutation 이 CDS 내에 존재할 경우 function 에 영향을 줄 가능성이 있기 때문에 template 와 비교하는 일이 반 １１. (19) 드시 필요하다. 적절한 primer 을 디자인하여 바이오닉스사에 sequencing 을 의뢰하였다.. 3.1.4. Mutagenesis Sequencing 으로 알아낸 mutation 이 아미노산 종류를 바꾸는 경우 새 primer 을 design 하여 mutagenesis 를 해야 한다. Primer 는 mutation 을 수정할 수 있어야 하며, 길이가 너무 길 경 우 자체 dimer 을 형성할 수 있기 때문에 25~45 base 범위에 수 정 부위가 가운데 위치하는 것이 좋다. 또한 melting temperature (Tm) 가 75℃ 이상이어야 한다.. Stratagene 사의 QuickChange. II XL Site-Directed Mutagenesis Kit 를 이용하였으며 조건은 다 음과 같다 (표 9, 10). 표 9 Mutagenesis mixture Materials. Volume. 10x reaction buffer. 5 ㎕. Primer(sense, antisense). 1.5 x 2 ㎕. DNA template. 1 ㎕. dNTP mix. 1 ㎕. QuickSolution. 3 ㎕. dd. up to 50 ㎕. PfuUltra HF Polymerase. 1 ㎕１２. (20) 표 10 Mutagenesis 조건 Temperature. Time. Cycles. 95℃. 1 min. 1 ㎕. 95℃. 50 sec. 60℃. 50 sec. 68℃. 7 min. 68℃. 7 min. 18 ㎕ (2~4 step). 1 ㎕. 반응이 끝난 후에는 반응 mixture 에 Dpn I restriction enzyme 을 1 ㎕ 넣고 37℃ 에서 1 시간 동안 incubation 한다. 이렇게 해 서 얻은 DNA 는 낮은 농도와 적은 양 때문에 바로 사용하기 쉽지 않다. 따라서 DNA 를 dH5-α strain 의 E.coli competent cell 에 transformation 한 후 복제된 plasmid 를 얻는 과정을 실시하였다. Transformation 은 우선 prechilled EP tube 에 E.coli 30 ㎕ 와 ligation 끝난 DNA 10 ㎕ 을 섞은 후 ice 에서 30 분간 방치한다. 42℃ 로 미리 가온한 수조에 EP tube 를 45 초간 heat shock 하 고, 2 분간 다시 ice 에서 cooling 한다. 항생제가 들어있지 않은 LB 배지를 400 ㎕ 가한 후 shaking incubator 에서 37℃, 1시간 30분 가량 incubation 한다. Ampicillin 100 ㎍ /ml 이 되도록 미리 만들어진 고체 LB 배지를 37℃ 로 데워서 준비하고, 여기에 incubation 이 끝난 mixture 을 일부만 pipette 로 덜어 배지 위에 １３. (21) 뿌리고 뻑뻑해질 때까지 spreading 한다. 그 후 37℃ CO₂ incubator 에서 overnight 배양한다. Colony 를 확인 한 후 액체배 지에서. colony. 를. 15~18시간. 가량. 키워. Welprep. Plasmid. Miniprep Kit 을 이용하여 OAT3 gene 이 ligation 된 vector 을 고농도로. 다량. 얻을. 수. 있었다.. Sequencing. 을. 통해. 전체. sequence 및 vector 의 존재 유무를 확인하였다.. 3.1.5. Transfection and selection 24 well plate 에 MDCK cell 을 seeding 한 후 70~90% confluency 가 될 때까지 키웠다. Transfection 시약은 Invitrogen 사의. Lipofectamine. 2000. 으로서. cationic. lipid-mediated. transfection method 가 원리이다. OAT3 gene 이 삽입된 vector 500 ng 을 serum-free media 50 ㎕ 에 희석하고 Lipofectamine 2 ㎕ 도 역시 50 ㎕ 에 희석시켰다. 5 분 후 Lipofectamine mixture 을 다른 DNA 쪽 tube 에 섞은 후 20 분간 상온에서 방 치했다. 마지막으로 전체 100 ㎕ 을 seeding 한 well 에 조심스럽 게 떨어뜨렸다. 24~48시간 배양 후 harvest 하여 25T flask 에 옮 기고 selection marker 가 들어간 complete media 로 배양했다. 문헌을 참고하여 selection 은 geneticin (G418) 600 ㎍ /ml 로 실시하였다. 약 2~3주 selection 후 stable cell line 을 얻을 수 있 １４. (22) 었다. 3.1.6. RT-PCR Cell line 이 완성되고 transporter 가 발현되었는지 여부를 mRNA 수준에서 확인해보았다. 약. 을 harvest 한 후. RNeasy Mini Kit 로 세포 내 RNA 를 추출하였다. 이 RNA 를 template 로 표 4~7 와 같은 방법으로 RT-PCR 을 수행하였고 Positive control 은 House-keeping gene 으로 알려진 canine GAPDH 로 정했다. Primer 는 다음과 같다 (표 11). 표 11 RT-PCR 용 프라이머 Gene. Sense primer. antisence primer. size(bp). OAT3. CGCAAGTGAC. CCCGTAGATG. 500. CTGTTCCGG. ATATTGGGG. AACATCATCC. GACCACCTGC. CTGCTTCCAC. TCAGTGT. GAPDH. 247. 3.1.7. Function study mRNA 발현이 확인되면 다음으로는 실제적인 Functional 확인이 필요하다. MDCK 는 많은 연구를 통해 적절한 실험계가 구축되어 있는데, OAT3 는 influx transporter 로서 uptake study 가 신뢰 성과 재현성을 가지는 좋은 방법이다. 24 well plate 에 n=4 로 대 １５. (23) 조군 cell (wild type MDCK) 와 실험군 cell (MDCK-OAT3 stable cell line) 을 각각 seeding 하고 confluent 할 때까지 48 시간 정도 배양했다. 배지를 제거하고 37℃ PBS 로 두 번 washing 하고, TM 을 가하여 30 분간 pre-incubation 시킨다. TM 을 제거하고 미리 만든 약물을 각 well 에 250 ㎕ 씩 가한 후 10 분간 37℃ 에서 incubation 하였다. 표 12 OAT3 Function study Cell type. 약물. Volume. MDCK-wt (n=4). Estrone 3-sulfate. MDCK-OAT3 (n=4). Estrone 3-sulfate. MDCK-OAT3 (n=4). Estrone 3-sulfate. 250 ㎕. +Rosuvastatin. 표 13 RI substrate specification [3H]Estrone-3-sulfate 분자량. 270.4. Specific activity. 50-100Ci/mmol. 농도. 1mCi/mL. １６. (24) OAT3 의 좋은 기질로 알려진 Estrone 3-sulfate 는 Km value 를 고려하여 최종 농도를 1μM 로 설정하였고, potent inhibitor 인 Rosuvastatin 은 강한 inhibition 효과를 주기 위해 500 μM 로 하였다. 실험 직전에 RI 기질은 전체 기질 농도의 1% 가 되도록 가했다. 10 분이 지나면 약물을 제거하고 cold substrate (non-RI substrate) 을 고농도로 용해시킨 prechilling 한 TM 으로 3~5번 washing 하였다. 이를 통해 transporter 의 활성을 정지시키고, 비특이적으로 흡착된 약물 분자를 제거할 수 있다. 0.2N NaOH 를 각 well 에 500 ㎕ 씩 가하고 2시간~overnight 방치 후 lysate 400 ㎕ 를 LSC로 분석했다. Well 당 존재하는 cell 수 차이로 발생하는 오류를 Bradford assay 로 보정해 주었다.. 3.2. DDI screening OAT3 에 의한 모델 약물들의 약물상호작용을 평가하기 위해 uptake study 을 통한 screening 실험을 수행하였다. 마찬가지로 기질은 Estrone 3-sulfate, 농도는 1 μM 이 되게 하였다. Inhibitor 각 농도마다 대조군 cell 과 실험군 cell 을 n=3 로 하여 3.1.7. 에서 기술한 방법으로 실시하였다. 모델 약물은 Rifampicin, Rosuvastatin,. Pravastatin,. Digoxin,. Cyclosporin. A. (CsA),. Cimetidine, Cidofovir, Clevudine 이하 8 가지 상용화된 약물로 １７. (25) 선정하였다. 약물은 용해도와 문헌을 고려하여 6 가지 농도를 정하였다 (표 14). Transporter 의 Vmax 와 Km 을 평가하기 위해 RI substrate 을 cold substrate 로 inhibition 하는 실험을 실시하였다. Cold substrate 농도는 역시 문헌을 참고하여 0, 0.1, 1, 5, 10, 50 μM 로 설정하였고, RI substrate 은 0.0167 μM 로 같게 해주었다.. 표 14 DDI screening 약물 약물. 용도. 농도 (μM). Rifampicin. 항결핵제. 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 500. Rosuvastatin. 고지혈증 치료제. 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 500. Pravastatin. 고지혈증 치료제. 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000. Digoxin. 심부전 치료제. 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 250. CsA. 면역억제제. 0.01, 0.1, 1, 2, 5, 10. Cimetidine. 위궤양 치료제. 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000. Cidofovir. 항바이러스제. 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 500. Clevudine. B형 간염 치료제. 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000. １８. (26) 4. Result 그림 3 OAT3 PCR 젤 전기영동 결과 (왼쪽) 그림 4 OAT3 Subcloning 결과 (오른쪽). PCR 결과 annealing temperature 55℃ 에서 ladder 상 2000bp 에 해당하는 밴드보다 약간 위쪽에 product 밴드가 나왔음을 확인하였다 (그림 3, 두 번째 lane). 또한 house-keeping gene 인 GAPDH 도 진하게 나왔다 (그림 3, 세 번째 lane). Cloning size 가 대략 2100bp 임을 감안할 때, 원하는 product 라고 생각하여 gel extraction 후 Xho I 과 Hind III 로 double digestion 하여 pcDNA5/FRT vector에 subcloning 하였다 (그림 4.A). 다시 Nhe I 과 Xho I 로 subcloning 하여 pcDNA3.1(-)/myc-his vector 에 OAT3 가 삽입된 DNA 를 얻을 수 있었다 (그림 4.B). Sequencing 결과 CDS 상 mutation 이 세 개가 있었다 (그림 5). 그 중 328, 865 번 mutation 은 아미노산을 변화시키지 않는 １９. (27) silent mutation 이므로 고치지 않고, 149 번은 phenylalanine 를 valine. 으로. 바꾸었기. 때문에. mutagenesis. 를. 한. 후. 다시. sequencing 하여 고쳐졌음을 확인하였다. OAT3 를 transfection 하고 2 주간 selection 후 resuspension 시켜 25T flask 에서 monolayer 하게 배양했다. RT-PCR 결과 mRNA 가 발현되었음을 알 수 있었다 (그림 6).. 그림 5 OAT3 sequencing 결과. ２０. (28) 그림 6 OAT3 stable cell line RT-PCR 결과. *왼쪽 열부터 1kb ladder, 100bp ladder, OAT3, GAPDH 이다.. Function study 결과 OAT3 에서는 Wild type MDCK 대비 estrone 3-sulfate (E3S) uptake 가 3.13 배 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. Rosuvastatin 500 μM 을 함께 처리했을 때는 1.46 배로 uptake 증가 정도가 현저히 감소하였다. t-test 결과 대조군 (wild type MDCK) 과 OAT3 군에서 그리고 OAT3 와 inhibition 군에서 모두 p=0.0004 가 나왔다 (그림 7, 표 15).. ２１. (29) 400. *** 300 200. ***. 100 0. ro su. va. T3 A O A. T3. +. O. W. T. E3S Uptake % of control. 그림 7 MDCK-OAT3 function study 결과. 표 15 MDCK-OAT3 의 function study 결과. Uptake % of control. wild type MDCK. OAT3. OAT3 +rosuva. 100 ± 21.0. 314 ± 38.7. 147 ± 24.7. ２２. (30) OAT3 의 Km 과 Vmax 를 구하기 위해 RI substrate 을 Cold substrate 로 inhibition 실험한 결과이다 (그림 8, 표 16).. Substrate conc.(pmole/mg/min). 그림 8 OAT3 의 Km, Vmax 평가. OAT3_Cold substrate 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 0.01. 0.1. 1. 10. 100. Inhibitor concentration. 표 16 OAT3 의 Km, Vmax. OAT3. Km (μM). Vmax (pmole/mg/min). 7.12 ± 1.33. 29.7 ± 5.00. 표 16 와 같이 Estrone 3-sulfate 를 기질로 했을 때 OAT3 의 Km 과 Vmax 값을 예측할 수 있었다.. ２３. (31) 8 가지 모델 약물에 대한 OAT3 의 DDI screening 결과는 다음과 같다 (그림 9~16). 그림 9 Rifampicin 에 대한 DDI screening. OAT3_Rifampicin Uptake % of control. 150. 100. 50. 0 0.01. 0.1. 1. 10. 100. 1000. Inhibitor concentration 그림 10 Rosuvastatin 에 대한 DDI screening. OAT3_Rosuvastatin Uptake % of control. 150. 100. 50. 0 0.01. 0.1. 1. 10. 100. Inhibitor concentration ２４. 1000. (32) 그림 11 Pravastatin 에 대한 DDI screening. OAT3_Pravastatin Uptake % of control. 150. 100. 50. 0 0.01. 0.1. 1. 10. 100. 1000. Inhibitor concentration. 그림 12 Digoxin 에 대한 DDI screening. OAT3_Digoxin Uptake % of control. 150. 100. 50. 0 0.01. 0.1. 1. 10. 100. Inhibitor concentration ２５. 1000. (33) 그림 13 Cyclosporin A 에 대한 DDI screening. OAT3_Cyclosporin A Uptake % of control. 150. 100. 50. 0 0.01. 0.1. 1. 10. Inhibitor concentration. 그림 14 Cimetidine 에 대한 DDI screening. OAT3_Cimetidine Uptake % of control. 150. 100. 50. 0 0.01. 0.1. 1. 10. 100. Inhibitor concentration ２６. 1000. (34) 그림 15 Cidofovir 에 대한 DDI screening. OAT3_Cidofovir Uptake % of control. 150. 100. 50. 0 0.01. 0.1. 1. 10. 100. 1000. Inhibitor concentration. 그림 16 Clevudine 에 대한 DDI screening. OAT3_Clevudine Uptake % of control. 150. 100. 50. 0 0.01. 0.1. 1. 10. 100. Inhibitor concentration ２７. 1000. (35) 실험한 농도 범위에서, 8 가지 약물 중 rosuvastatin, pravastatin, 그리고 cimetidine 이 inhibitor 로 작용하는 것을 확인할 수 있었다. Inhibition potency 를 의미하는 IC50 값은 표 17와 같다.. 표 17 Inhibitor 로 작용한 모델 약물들의 IC50 MDCK-OAT3. IC50 (μM). Rosuvastatin. 57.7 ± 19.7. Pravastatin. 431 ± 73.5. Cimetidine. 125 ± 23.9. ２８. (36) 5. Discussion & Conclusion 본 연구에서는, 약물상호작용에 중요한 역할을 한다고 알려진 transporter 7 가지 중 OAT3 를 선택하여 human liver RNA 로부터 cloning 을 시작으로 stable cell line 을 완성하였다. 그림 2 에서의 vector map 과 달리 selection marker 로 geneticin 을 사용한 것은 MDCK 와 같은 진핵세포가 neomycin 에 저항성을 가지며. neomycin. 가지기 때문이다.. 저항성 OAT3. 유전자가. geneticin. 의 발현을 확인하기. 에. 교차내성을. 위하여. mRNA. 측면에서와 function 측면에서 평가하였다. mRNA 는 전기영동 시 디자인한 primer 에 의해 예상되는 size 에서 band 가 나왔으며, function study 에서는 대조군 (wild type MDCK) 에 비해 기질 uptake 가 약 3.14배 증가하였고 rosuvastatin 고농도 처리 시 대조군에. 가까운. 수준으로. inhibition. 되는. 것을. 확인하였다.. Michaelis-Menten kinetics 을 따르는 transporter 의 Km 과 Vmax 를 구하기 위해서 아래의 식을 이용하였다.. V는 uptake 속도로서 단위는 pmole/mg/min 이며 이는 각 well 당 세포 수 차이를 고려하기 위해 단백질 양을 보정한 값이다. [s]는 ２９. (37) substrate 의 농도로, 여기서는 RI substrate 만의 농도를 의미하며 0.0167. μM. 로. 고정하였다.. 그리고. cold. substrate. 가. RI. substrate 의 competitive inhibitor 로 작용하므로 [I] 는 변하는 cold substrate 의 농도가 되며 컴퓨터 소프트웨어를 이용해 plotting. 할. 수. 있었다.. Km. 값은. 7.12. ±. 1.33. μM. 로. 예측되었으며, 문헌과 마찬가지로 estrone 3-sulfate 가 실제로도 선택성이 큰, 좋은 기질임을 알 수 있었다. Function study 와 같은 uptake 방법으로 DDI screening 을 실시하였는데, OAT3 는 IC50 값 차이는 있었으나 문헌에서 알려진대로. rosuvastatin. 과. pravastatin,. cimetidine. 에서. inhibition 이 나타났다. 그런데 나머지 5 개 약물 그래프에서 inhibitor 로 사용한 약물의 농도가 증가할수록 E3S uptake 가 증가하는듯한 양상이 보였다. 특히, clevudine 의 경우 최저 농도와 최고 농도 처리군에서의 uptake 비교 시 p=0.0323 로 유의미한 차이를 나타냈다 (*). 이는 약물 처리 후 PBS 로 washing 시 저농도 군부터 순차적으로 함에따라 고농도 처리군에서 약물 처리 시간이 길어지는 효과를 주기 때문으로 보인다. Cimetidine 은 cationic compound 이나, OAT3 의 competitive inhibitor 이다. 실제로, OATs 와 OCTs 는 SLC22 family 이며 sequence 적 구조적 homology 가 크다. 따라서 두 family 는 상당부분 기질과 ３０. (38) inhibitor 을 공유하며 cimetidine 또한 OCTs 뿐 아니라 OAT1 과 OAT3 를 inhibition 시킨다. 만약 특정 기질에 대해 inhibitor 로 사용한 약물의 IC50 값이 매우 낮게 나타난다면, 두 약물이 병용투여 될 때 약물상호작용이 유발될 수 있다. 특히 therapeutic index. 가. 좁은. 약물이거나. 병용투여가. 빈번하게. 일어나는. 약물이라면 임상적인 의미를 가지므로 주의가 필요하다. MDCK 에 인간 transporter 을 발현시킨 in-vitro system 은 실제로도 약물상호작용 연구에 활용 가능하였으며, 같은 방식으로 다른 transporter 들에도 확장할 수 있을 것이다. 뿐만 아니라 MDCK 에 이미 발현된 canine transporter 을 knock-out 시켜 basal activity 를 없앤다면 더 명확한 데이터를 얻을 수 있을 것이며. 두. 가지. 이상의. transporter. 를. co-transfection. 시킴으로써 상호작용연구 또한 가능하리라 생각한다. 결과적으로 신약개발 초기단계에서 적합한 후보군을 결정하는 데 이 시스템을 적용할 수 있으며 임상단계에서 연구가 실패할 가능성을 크게 줄임으로써. 신약개발의. 효율성을. 사료된다.. ３１. 크게. 증진시킬. 수. 있다고. (39) 6. Reference Bleasby, K., X. Chu and R. Evers (2010). "In Vitro Techniques to Study Transporter-Based DDI." Enzyme-and Transporter-Based DrugDrug Interactions: 237-255. Degorter, M., C. Xia, J. Yang and R. Kim (2012). "Drug transporters in drug efficacy and toxicity.". Annual review of pharmacology. and. toxicology 52: 249-273. Fujino, H., T. Saito, S. Ogawa and J. Kojima (2010). "Transporter‐mediated influx and efflux mechanisms of pitavastatin, a new inhibitor of HMG‐CoA reductase." Journal of pharmacy and pharmacology 57(10): 1305-1311. Giacomini, K. M., S. M. Huang, D. J. 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(42) OAT3 transporter was selected in this study because the anion transporter may be a prototype SLCs. Human OAT3 was cloned from human kidney total RNA and functionally expressed in MDCK cells using cationic lipid-mediated transfection method. RT-PCR study and function study were carried out using the transfected. cell. to. confirm. the. biochemical/functional. expression of the transporter. A series of inhibition studies were carried out to evaluate the DDI properties using 8 clinically used drugs with uptake method. When estrone 3sulfate was used as the substrate, kinetic analysis indicated that the transport may be best described by Michaelis-Menten kinetics with Km and Vmax. Also, IC50 (inhibition potency) values were estimated for 8 test compounds. Therefore, Human OAT3 screening system established in this study may be practically useful in predicting DDIs in early phase of drug development.. Key Words : OAT3, DDI, Estrone 3-sulfate (E3S), IC50 Student Number : 2011-21769. ３５. (43) ３６. (44) ３７. (45) ３８. (46) ３９. (47) ４０. (48) ４１. (49) ４２. (50) ４３. (51) 감사의 글 우선, 정석재 교수님 진심으로 감사합니다. 대학원에 들어온 그 순간부터 연구를 마무리 하기까지 항상 기다려주시고, 격려해주시고 지원을 아끼지 않으셨던 큰 마음 때문에 많은 것을 배울 수 있었습니다. 약제학실의 기둥과 같은 심창구 교수님 감사합니다. 약학연습 때마다 제 연구에 날카로운 질문을 해주셔서 제 연구에 대한 생각을 넓힐 수 있었습니다. 그리고 항상 따뜻한 말로 격려를 아끼지 않으시는 김대덕 교수님, 미국에 계시지만, 약제학 식구들 마음속에. 늘. 함께하시는. 정세호. 교수님께도. 감사의. 말씀을. 드립니다. 가족 같은 317호, 제 인생에서 마지막 학창시절을 함께한 소중한 기억입니다. 점심 때 둘러앉아 같이 밥 먹으면서 했던 소소한 이야기과 폭로전들, 악마의 사다리 게임, 날씨 좋을 때 갔던 소풍들, 이제는. 동참할. 수. 없어. 아쉽고. 서운한. 마음이. 듭니다.. 지금. 누구보다 행복하실 경륜오빠, 윤지언니, 지난 가을 실험 달리며 매일 같이 저녁 먹었던, 숨겨진 매력을 많이 가지고 계신 준형오빠, 실험실 어머니에서 실험실의 기둥이 되신, 눈치 백단 센스 넘치는 창순오빠, 실험 같이 맡으면서 책임자로 고생 많이 하셨던 실험실 맡형 치경오빠, 감수성 풍부한! 꼼꼼 다정 배려쟁이 헌민오빠, 저를 강하게 키워주신 실험실 분위기 메이커였던 승엽, 채림오빠, 대학원 신환회 주인공에서부터 온갖 희로애락을 함께한 재일오빠, 학부 때보다 더 많은 추억 쌓고 싶었지만 그러지 못해 아쉬운, 비율 좋은 정현이 고맙습니다. 그리고 귀염둥이들, 우리에게 놀람 면역을 선사한 해피바이러스 애교쟁이 인영이, 컴퓨터 문제 생길 때마다 해결해줘서 너무 고마웠던 커피를 즐기지 않는 워너비 네이티브 스피커 성우, 16호 더부살이 했지만 열정적인 실험으로 존재감을 ４４. (52) 뿜어냈던 유성이, 회식의 소리 없는 강자 실험실의 식사를 책임지는, 실험에 고민이 많은 유경이에게 이 글을 통해 더 잘 챙겨주지 못해 미안하다는 말을 하고 싶습니다. 그리고 빛과 소금과 같은 지식을 나누어주시는 새 식구 명재오빠, 늘 격려 해주시고 실험실 안부 챙겨주시는 종화 선배님, 주현 선배님께도 감사드립니다. RI 실에서 자주 데이트했던 수다 파트너 은서, 카이저소제 연기왕 수원오빠, 외강내유 부드러운 남자 태광이, 필력 좋고 기계랑 친한 능력 많은 준영이, 앞으로 무궁한 발전이 있을 박사 브라더스 기택이, 재영오빠, 보쌈해서 친언니 삼고 싶은 지현언니, 동기로서 너무 재미있고 소중한 시간이었습니다. 316호. 지은언니,. 은영언니,. 규상오빠,. 우영오빠,. 보란언니,. 318호의 현종오빠, 충길오빠, 인수오빠, 알렉스, 준호오빠, 상범오빠, 동환오빠,. 은재오빠,. 주환오빠.. 성락오빠,. 성준오빠,. 유진언니,. 윤정언니, 연화언니, 건이, 민주, 미연이, 남미정 선생님, 길모오빠 유진언니 모두 저에게 잊지 못할 분들입니다. 저도 친근한 선배, 귀여운 후배로 기억될 수 있으면 좋겠습니다. 서울대학교. 약제학실의. 구성원으로서. 공부한. 시간들이. 제. 인생에서 큰 힘이 되리라 생각합니다. 다시는 느끼지 못할 끈끈한 소속감 가슴 깊이 간직하며, 모두의 앞길에 건강과 사랑과 행운과 학문적 성취감이 가득하길 기원합니다.. ４５. (53)