사랑과 열정으로 더불어 함께 하는 세상 만들기 - 율촌재단(栗村財團)

식물성 유지류에서 산화독성물질인 4-hydroxy-2-alkenals 의 생성과 소멸에 관여하는 인자 및 메커니즘 규명

서정희 강원대학교 식품영양학과

1. 서 론

4-hydroxy-2-nonenal(HNE)는 4-hydroxy-2-alkenals(<Figure 1>)계열의 물질로, 식품이나 생체 내에서 DHA(docosahexaenoic acid, C22:6, n-3), 아라키돈산(C20:4, n-6), 리놀렌산(C18:3, n-3), 리놀레산 (C18:2, n-6) 등의 지방산이 효소적 혹은 비효소적으로 산화되는 과정 중에 형성되는 반응성이 강한 독성 α,β-unsaturated aldehyde이다(1～2). 4-hydroxy-2-alkenals는 그 구조에 포함되어 있는 3개의 작 용기인 알데히드기, α,β C=C 이중결합, hydroxyl기로 인해 반응성이 매우 크므로, 단백질, DNA 등 의 친핵성 생체 고분자들과 Schiff base 반응 혹은 Michael addition 반응을 통해 adduct를 쉽게 형성 함으로써, 약물대사 효소체계인 CYP450을 포함한 세포 내 효소들의 활성 억제, 단백질과 DNA, RNA 합성 억제 및 적혈구 용해, LDL(low density lipoprotein) 변형, 돌연변이 유발 등 넓은 범위의 생물학적 독성을 보이는 것으로 알려져 있다(1～2).

<Figure 1> Chemical structures of 4-hydroxy-2-alkenals

R=C2H5: 4-hydroxy-2-hexenal(HHE), R=C5H11: 4-hydroxy-2-nonenal(HNE)

유지의 산화에 의해 생성될 수 있는 이러한 4-hydroxy-2-alkenals는 일단 음식을 통해 체내에 흡수 될 경우, 생물체 내에서 단백질과 인지질, LDL 등을 변형시킬 수 있으므로, 심혈관 질환이나 뇌졸중, 파킨슨병, 헌딩턴병, 간질환, 심지어 암 위험도까지 높일 수 있다고 보고되고 있다(3~6).

4-hydroxy-2-alkenals 계열의 알데히드 중에서 독성이 가장 강한 것으로 알려진 HNE와 HHE (4-hydroxy-2-hexenal)는 n-6 지방산과 n-3 지방산의 산화에 의해 각각 특이적으로 형성되는 것으로 알려져 있다(1~2). 이에 따라 Surh & Kwon은, 한국인에게 있어 n-6와 n-3 지방산의 주요 급원식품인 식물성 유지와 어패류에서 4-hydroxy-2-alkenals를 정량하고, 이를 식품 섭취량 데이터와 결합함으로 써, 식이를 통한 한국인의 4-hydroxy-2-alkenals 노출량을 체중 당 0.3μg/kg으로 보고하였고, 노출량에 따른 위해도를 추정하고자 하였다(7~9). 한편 HHE와 HNE를 생성하는 근원 지방산인 n-6와 n-3 지 방산은, 심혈관계 질환을 예방할 수 있는 기능성 지방산으로 더 널리 알려져 있어, 이들 고도불포화 지방산을 강화한 일반 식품 및 건강기능식품들이 현재 시판 중에 있다. 이들 지방산이 4-hydroxy- 2-alkenals의 전구체임으로 고려할 때, DHA와 EPA(eicosapentaenoic acid, C20:5, n-3) 등의 기능성 지 방산을 다량 함유한 식품을 특이적으로 많이 섭취하는 집단에서는, 식이를 통한 4-hydroxy-2-alkenals 노출량이 더 증가될 것을 예상할 수 있다. 실제로 Surh & Kwon은, 국내 시장에서 시판되고 있는 고 도불포화지방산 강화 제품을 수거하여 4-hydroxy-2-alkenals를 정량하고, 이를 특이적으로 많이 섭취 하는 집단에서 노출량을 평가하였다. 그 결과 3개월～1세의 영유아는 고도불포화지방산이 강화된 분 유를 섭취함으로써, 성인 노출량의 최대 70배에 해당하는 체중 당 20.2μg/kg의 4-hydroxy-2-alkenals에 노출될 수 있다고 보고하였다(10). 4-hydroxy-2-alkenals의 높은 반응성에도 불구하고 노출량에 따른 위해도를 평가할 충분한 독성 데이터가 현재로서는 충분히 확보되지 않아 정확한 위해도를 추정하는 것이 어려운 실정이나, 이 연구 결과는 기능성만이 강조되었던 n-3, n-6 고도불포화지방산의 섭취가 성장과 발달 과정에 있는 영․유아에게 있어서 4-hydroxy-2-alkenals 노출에 따른 위해성을 동반할 수 있으므로 n-3와 n-6 지방산이 안전성 측면에서도 함께 평가되어야 함을 제시하는 계기가 되었다.

식품 유래의 4-hydroxy-2-alkenals에 대한 한국인의 노출량 평가 및 그에 따른 위해도를 평가하고 자 한 일련의 연구들은, 대상 식품에서 이 계열의 독성물질을 저감화시킬 수 있는 연구가 필요함을 시사하였다. 이를 위해서는 식품 내에서 4-hydroxy-2-alkenals가 생성 및 소멸되는 기전을 파악하는 일이 선행되어야 한다. HHE와 HNE가 각각 n-3와 n-6 지방산에서 특이적으로 생성되는 독성 알데히 드로 알려져 있으나, 실제 선행 연구들은 지방산의 절대적 함량 이외에 다른 촉매 요인이 식품 내에 서 4-hyroxy-2-alkenals의 생성에 관여하고 있음을 암시하였다. 다시 말해 첫째, 지방산의 조성과 함량 이 유사했던 일부 동종의 시료에서 4-hydroxy-2-alkenals 함량이 현저한 차이를 보였던 점과 둘째, 이

생성되는 물질이고, 단백질과 같은 친핵성 고분자 물질에 대해 높은 반응성을 보인다는 점을 고려하 면, 식품 시료 속에 존재하는 (i) NaCl, 항산화제 등 산화와 관련 있는 성분, 즉 항산화제 혹은 산화 촉진제들의 함량 차이, (ii) 단백질 등과 같이 4-hydroxy-2-alkenals와 반응할 수 있는 식품 구성성분의 차이, (iii) 식품 시료의 저장조건의 차이, (iv) 4-hydroxy-2-alkenals를 분석한 시점에서의 식품의 산화 상태(4-hydroxy-2-alkenals가 지질 과산화의 최종 산물이 아니므로 식품의 산화 진행 정도에 따라 4-hydroxy-2-alkenals를 분석한 시점이 이 독성물질이 축적되고 있는 시점일 수도 있고, 다른 물질로 이미 분해된 시점일 수도 있기 때문)에 따라, 4-hydroxy-2-alkenals의 함량은 영향을 받을 것으로 예 상된다. 따라서 지질 함유 식품에서 4-hydroxy-2-alkenals 생성량의 정확한 예측을 통해 안전성을 확 보하기 위해서는, 특정 시점에서 해당 식품의 4-hydroxy-2-alkenals만을 정량하는 screening 차원을 넘 어서서, 4-hydroxy-2-alkenals의 생성(formation) 및 소멸(removal or decomposition)에 관여하는 식품 내 촉매 및 산화지표를 포함한 관련 인자를 규명하는 연구가 절대적으로 필요한 실정이다.

Gasc et al.(2007)은, 최근 연구에서 그들의 주요 지질 공급원인 육류 및 육가공 식품을 대상으로 HNE의 생성에 영향을 주는 식품 내 주 요인으로 지방산 조성, heme 농도, 동결건조, 염 등을 보고 하였다(11). 이러한 연구는 육류 및 육가공 식품에서 4-hydroxy-2-alkenals의 저감화를 위한 일련의 방 안을 제시할 수 있을 것으로 기대되나, 식이 지질의 50% 이상을 유지류(fats and oils)로부터 공급받 고 있는 한국인의 경우에 현실적으로 이 연구 결과를 4-hydroxy-2-alkenals의 노출량을 감소시키는 데 적용하는 것은 한계가 있을 수밖에 없다. 그러므로 (i) 한국인이 식이 지질의 56%를 유지류로부터 공급받고 있는 현실과, (ii) 4-hydroxy-2-alkenals의 근원 물질이 고도불포화지방산이라는 점, (iii) 한국 인의 30% 이상, 7~19세 한국인의 50% 이상이 일주일에 1회 이상 튀김음식을 섭취한다는 보고 등을 고려한다면(12), 한국인이 가장 많이 소비하는 식물성 유지(vegetable oils)에서 4-hydroxy-2-alkenals의 생성 및 소멸에 영향을 주는 주요 인자 및 기전(mechanism)을 찾아가는 국내 연구가 한국인에게 있 어 실질적으로 4-hydroxy-2-alkenals 노출량을 줄이는 데 기여할 것으로 기대된다.

본 연구에서는, 한국인이 노출되는 4-hydroxy-2-alkenals의 상당량은 국내에서 유통되는 식물성 유 지류의 섭취를 통해 일어날 것이라는 예측을 기반으로 하여, 국내에 유통되는 식물성 유지류에서 고 도불포화지방산에 의해 특이적으로 생성되는 독성물질인 4-hydroxy-2-alkenals의 생성(formation) 및 소멸(removal or decomposition)에 영향을 미치는 식품 내 관련 인자를 찾아내고, 이를 통해 4-hydroxy-2-alkenals의 생성을 예측할 수 있는 지표를 제시하고자 하였다. 특히 국내에서 소비되고 있는 식물성 유지류는 그 종류에 따라 (i) 지방산 조성 및 함량, (ii) 제조방법(상업적 제조 vs. 전통적 제조), (iii) 항산화제 및 산화촉진제의 함량, (iv) 조리 시 주요 용도(고온가열: 튀김, 전, 볶음/ 상온:

무침) 등이 다르므로, 이러한 요인들을 유지류의 산화 평가 및 산화 민감도 분석 시 반영하고자 하였 다. 또한 4-hydroxy-2-alkenals가 지방의 산화물이라는 점을 감안하여, 다른 산화지표들의 변동 및 산 화지표 사이의 상관관계와 유지의 자동산화 기전을 근거로 하여, 4-hydroxy-2-alkenals의 생성을 예측

할 수 있는 지표를 추출하고자 하였다.

2. 연구방법

2.1 실험재료

국내 시장에서 유통되는 다소비 식물성 유지류 Sampling

국내에서 유통되는 식물성 유지를 콩기름(n=7), 옥수수유(n=14), 참기름(n=18), 들기름(n=13), 올리브 유(n=16), 포도씨유(n=11), 고추씨유(n=3), 카놀라유(n=4), 헤이즐넛 오일(n=1), 건강기능성 오일(n=2) 을 포함하여 총 79종 수거하였다(<Table 1>). 참기름과 들기름의 경우에는 지역적 제조․소비하는 빈도가 높으므로, 이를 고려하여 대규모 공정에 의해 제조 유통되는 다른 유지류에 비해 시료의 수 거 범위를 넓혀 슈퍼마켓에서 시판되는 것뿐만 아니라 재래시장에서 제조한 것들도 포함시켜 수집하 였다.

<Table 1> Commonly consumed vegetable oils marketed in Korea

Consumption Frequency Manufacturing Type-I Major Fatty Acids Commonly-

Consumed(n=69)

Others (n=10)

Industrialized (n=69)

Traditional (n=10)

MUFA (n=16)

n-3 PUFA (n=13)

n-6 PUFA (n=40)

(n=7)

Pepper seed oils(n=3)

Soybean oils (n=7)

Sesame oils (n=4)

Olive oils (n=16)

Perilla oils (n=13)

Soybean oils (n=7) Corn oils

(n=4)

Canola oils (n=4)

Corn oils (n=4)

Perilla oils (n=6)

　 　 Corn oils

(n=4) Sesame oils

(n=18)

Hazelnut oil (n=1)

Pepper seed oils(n=3)

　 　 　 Sesame oils

(n=18) Perilla oils(n=13) Functional

oils(n=2)

Canola oils(n=4)

　 　 　 Grapeseed

oils(n=11) Olive oils

(n=16)

　 Hazelnut oil

(n=1)

Grapeseed oils (n=11)

　 Functional oils

(n=2)

Consumption Frequency Manufacturing Type-I Major Fatty Acids Commonly-

Consumed(n=69)

Others (n=10)

Industrialized (n=69)

Traditional (n=10)

MUFA (n=16)

n-3 PUFA (n=13)

n-6 PUFA (n=40)

　 　 Olive

oils(n=16)

　 　 Grapeseed

oils(n=11)

　 　 Sesame

oils(n=14)

　 　 Perilla

oils(n=7)

Manufacturing Type-II Cooking Type

Pressing(n=50) Solvent Extraction

(n=29) Frying, Stir-frying(n=45) as seasonings at room temperature(n=34)　

(n=7)

Sesame oils(n=18)

Perilla oils(n=13) Soybean oils (n=7)

Corn oils (n=4)

Perilla oils(n=13)

Pepper seed oils(n=3)

Corn oils (n=4)

Olive oils(n=16) Pepper seed oils(n=3)

Olive oils(n=16) Canola oils(n=4) Grapeseed oils(n=11)

　 Functional oils(n=2) Canola oils(n=4)　

　 Grapeseed oils(n=11) Hazelnut oil(n=1)

　 　 Functional oils(n=2)

조리 조건에 따른 튀김 유지류 Sampling

4-hydroxy-2-alkenals가 고도불포화지방산의 함량이 높은 식품군인 식물성 유지류에서 많이 생성되고, 산화물이라는 점을 고려하여, 실제 대량 조리에 사용된 식물성 유지를 수거하여 다양한 산화지표로 산화 정도를 평가함으로써 식물성 유지류에서 4-hydroxy-2-alkenals의 생성을 감소시킬 수 있는 조리 조건을 제안하고자 하였다.

강원 동해․삼척 지역에서 급식 인원이 600명 이상인 6곳의 초․중․고등학교로부터, 실제 튀김 조리에 사용된 기름을 1차로 154종을 수거하였고, 이 6곳의 학교 중 1차에서 수집된 시료에서 비교 적 높은 산화물이 검출된 1곳에 대해서는 2차로 80종의 기름을 추가 수거하였다. 시료 수거 지역인 6곳의 학교에서 제공하는 튀김식품의 종류는 야채류, 어류, 육류, 혼합튀김으로 크게 4종으로 구분하 였다. 학교 단체급식에서 실제로 사용되고 있는 조리 조건은 <Table 2>와 같았다. 튀김(deep-frying) 에 사용된 기름은 튀김 직후에 바로 수거하였으며, 그 시점에서의 산화 상태를 정확히 평가하고 추 가의 산화가 진행되는 것을 막기 위해, 유지 g당 0.01g의 Butylated Hydroxy Toulene(BHT; Sigma,

St. Louis. MO. USA)을 처리하였다.

<Table 2> Actual deep-frying conditions at school food service

Vegetable Fish Meat Mixture

Frying temp(℃)

Frying time(min)

Frying oil(L/400L container)

Use fresh oil?

Store the fried oil for reutilization?

1 Mixed vegetables and other food items

2 The oils used for deep-frying vegetables or their mixtures tended to be reutilized when frying fish or meat

3 Once the oils were used in frying fish or meat, they tended to be discarded.

2.2 수분

화학적 수분 측정법인 Karl Fischer 방법에 의해 식물성 유지류에 함유된 수분을 측정하였다. I2, 무수 아황산, pyridine의 혼합액인 Karl Fisher reagent(HYDRANAL-Composite 5, Riedel-de Haën^Ⓡ Seelze, Germany)가 methanol 존재 하에서 물과 정량적으로 반응하여 I2를 소비하는 반응에 근거하여 수분적 정장치(702 SM Titrino, Metrohm, Flawil, Switzerland)를 사용하여 기름 속의 수분을 정량하였다.

2.3 식물성 유지의 지방산 조성

시료의 지방산은 Lepage와 Roy(1986) 방법에 따라 분석하였다(15). 유지 시료 0.1g에 내부 표준물질로 tridecanoic acid(C13:0, Sigma, St. Louis, USA)를 100ml 함유한 methanol:benzene 4:1(v/v) 혼합용액 2ml를 넣고 vortex(KMC-1300V, Vision Scientific, Korea)로 교반하면서, 200ml의 acetyl chloride(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)를 drop-wise로 천천히 첨가하였다. 이후 이 반응액을 100℃에서 1시간 동안 열처리함으로써 methanolysis 반응을 유도하였다. 반응 시간이 경과한 후, 찬물로 식혀 반응액을 실온으로 유지시키고, 6% K2CO3 5ml를 천천히 넣어주면서 반응액을 중화시켜 methanolysis 반응을 종결시켰다. 그 후 원심분리기(5810R, eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여 10℃, 3,000rpm에서 10min 동안 원심분리한 후 상층액을 취해 GC-FID(Gas Chromatograph-Flame

온도는 모두 200℃, 시료 주입량은 1μl, 이동상 기체 N2의 유속은 1ml/min이었다. 컬럼 온도는 90℃에서 5min 동안 유지하고 180℃까지 10℃/min의 속도로 상승시켜 3분간 유지하고, 180℃에서 195℃까지는 3℃/min, 195℃에서 199℃까지는 1℃/min, 199℃에서 202℃까지는 4℃/min으로 상승시킨 뒤 5분간 유지하였다. 이후 212℃에서 240℃까지 1℃/min으로 상승시킨 후, 최종온도 240℃에서 20분 동안 유지하는 temperature-gradient 분석조건으로 설정하여, 총 33개의 지방산에 대해 분석하였다. 33개의 개별 지방산 각각에 대해 ‘농도 vs. peak 면적’의 표준정량곡선들을 작성하여 유지 시료의 지방산을 정량하였다.

식물성 유지류의 peroxidability index(PI, 산화가능지수)는 지방산(fatty acid, FA) 조성을 기준으로 하여 다음과 같이 산출하였다(16). PI=(% monoenoic FA×0.025)+(% dienoic FA×1)+(% trienoic FA×2)+(% tetraenoic FA×4)+(% pentaenoic FA×6)+(% hexaenoic FA×8)

2.4 지질 과산화물 hydroperoxides 분석

식물성 유지류에서 산화에 의해 생성된 hydroperoxides는 ferrous oxidation/xylenol orange(FOX) 방법 에 의해 분석하였다. 이 방법은, 낮은 pH에서 peroxides가 ferrous 이온(Fe²⁺)을 ferric 이온(Fe³⁺)으로 산화시키는 성질을 활용하여 분광학적으로 측정하는 방법이다(13). 0.1g 정도의 유지 시료(0.01g BHT 함유)를 정확하게 취한 후, chloform/methanol 혼합용액(7:3)을 9.9ml 첨가한 후 5초 동안 교반하여 유지를 용해시켰다. 이 용액에 10mM xylenol orange 50µl, iron(II) chloride 50µl를 차례로 넣어 교반 한 후, 상온에서 정확히 5분 동안 정치시킨 후 560nm에서 흡광도(UV-1650, Shimazu, Kyoto, Japan) 를 측정하였다. 유지 속 hydroperoxides의 양은 cumene hydroperoxide를 외부 표준물질로 하여 정량 하였다.

2.5 지질 과산화물 malondialdehyde 분석

지질 과산화의 2차 산물인 malondialdehyde(MDA)의 측정은, 산성 조건에서 시료를 thiobarbituric acid(TBA, Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japan)와 함께 가열하는 동안, 1분자의 MDA가 2분자의 TBA와 반응하여 붉은색의 발색물질을 형성하는 성질을 이용하여 분광학적으로 측정하였다. 0.1g 정 도의 유지 시료(0.01g BHT 함유)에 1-butanol 5ml를 첨가하여 10초 간 교반하여 유지 시료를 잘 용 해시켰다. 이 시료 용액에 0.2%의 TBA 시약을 5ml 가한 후 95℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 실온으로 냉각시켜 532nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준정량곡선 작성을 위해 MDA의 전구체인 1,1,3,3-tetraethoxypropane(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 사용되었다.

2.6 α,β-unsaturated aldehydes 분석

4-hydroxy-2-alkenals는 α,β-unsaturated aldehyde 계열의 물질이다. 식물성 유지류에서 이 계열에 속하 는 물질들의 생성 정도를 screening하기 위해, p-anisidine test를 실시하였다. 이 방법은 유지 속 aldehydes를 정량하는 AOCS 방법으로, 특히 2,4-dienals와 2-alkenals를 포함한 비휘발성 알데히드 (non-volatile aldehydes)의 생성 수준을 측정할 수 있다. 25ml의 volumetric flask에 유지 시료 약 0.5g 을 넣고 iso-octane으로 총 부피를 25ml로 맞추어 유지를 희석 용해시켰다. 이 시료 용액 5ml에 anisidine reagent(0.25g/100ml acetic acid) 1ml를 넣고 10초 동안 교반하여 잘 섞어준 후, 이후 10분 동안 정치시켜 반응을 유도하였다. 생성된 반응 결과물은 iso-octane으로 희석시킨 유지 시료를 blank(As)로 하여 350nm에서 흡광도를 측정(Ab)함으로써 산출되었다. p-anisidine value(p-AV)는 다음 과 같은 식으로 산출되었다. p-AV=25×(1.2As-Ab)/m(m=sample g)

2.7 식물성 유지류의 산화 민감도(oxidation susceptibility) 평가

Kornbrust와 Mavis(1980)의 방법에 따라(14), 유지 시료를 철(iron)과 ascorbic acid를 포함하는 산화 유도 시스템에 노출시킨 후, 시간의 경과에 따라 산화 생성물인 MDA를 측정함으로써, 유지의 종류 및 제조방법에 따른 식물성 유지류의 산화안정성을 비교 평가하였다. 시료 0.5g을 50ml tube에 정량 하고 1.15% KCl(Showa Chemical Industry Co., Tokyo, Japan) 21ml을 첨가하여 1분 동안 교반시켰 다. 이 중 2.5ml을 취하여 80mM tris-malate buffer(pH=7.4) 12.5ml, 5mM FeSO4․7H2O(Showa Chemical Industry Co.) 5ml, 2mM ascorbic acid(Junsei Chemical Industry Co., Tokyo, Japan) 5ml를 차례대로 넣고 10초 동안 vortex mixer를 이용하여 잘 섞은 후 37℃ 항온수조에 넣었다. 반응액을 항 온수조에 넣은 시점(0min)부터, 반응 진행 후 20, 40, 60, 90, 150, 210, 270, 330min에, 반응액 중 2ml를 취하여 TBA-TCA(trichloroacetic acid, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)-HCl이 혼 합되어 있는 반응 시약(15% TCA+0.37% TBA in 0.25N HCl) 4ml를 넣고 잘 섞은 후, 100℃에서 정 확히 15min 동안 반응시켰다. 이후 차가운 물로 식혀 반응을 종결시키고 3,500rpm에서 15min 동안 원심분리(5810R, eppendorf, Germany)하였다. 상층액을 UV-visible spectrophotometer(UV-1650, Shimadzu, Kyoto, Japan)로 531nm에서 흡광도를 측정함으로써 반응액 속에 형성된 MDA-TBA complex를 정량하였다. 표준정량곡선 작성을 위해 MDA의 전구체인 1,1,3,3-tetraethoxypropane (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 사용되었다.

2.8 4-hydroxy-2-alkenals 분석

식물성 유지에서 4-hydroxy-2-alkenals의 분석은 Surh & Kwon(2002)의 방법에 따라 분석하였다(7).

우선 유지로부터 4-hydroxy-2-alkenals를 추출하기 위해 시료를 10배의 물로 2회 추출하고, 얻어진 수 용액 층을 다시 동량의 chloroform으로 3회 연속 liquid-liquid extraction을 실시하였다. 즉 BHT(0.01 g/sample g)를 처리한 1g의 유지 시료에 10배 부피의 증류수를 첨가한 후 진탕 배양기를 사용하여 150rpm의 속도로 20분 동안 흔들어 주면서 추출한 후 수용액 층을 취하였다. 2회 반복 추출을 통해 얻어진 수용액 층을 합하여 3,000g에서 20분 동안 원심분리하였다. 이렇게 하여 얻은 수용액 층을 동일 부피의 chloroform으로 3회 연속 추출하였다.

GC 분석을 위해 4-hydroxy-2-alkenals 추출액을 회전식 진공 농축기(EYELA Rotary Vacuum Evaporator N-N Series, Rikakikai Co., Japan)를 이용하여 1ml로 농축한 후 질소로 용매를 날리고, 여 기에 500μl acetonitrile과 200μl N,O-bis(Trimethylsilyl) trifluoroacetamide(BSTFA, Sigma, St. Louis.

MO. USA)를 첨가하여 70℃에서 15분 동안 가열하여 유도체화를 시켰다.

HHE와 HNE를 칼럼 SPB^TM-5(50m×0.20mm I.D.×film thickness 0.33m, Supelco, PA, USA)를 사용 하여 GC/MS(Hewlett Packard; GC-5987, MS-6890, DE, USA)로 분석하였다. 분리를 위한 오븐 온도 는 120℃에서 5분 동안 유지하고 5℃/min의 속도로 160℃까지 올린 후, 15℃/min의 속도로 200℃까 지 올려 5분 동안 유지하였다. 헬륨을 운반기체로 하여 0.7 ml/min으로 유속을 일정하게 유지하였다.

검출기는 Mass Selective Detector(MSD)이고, 70eV의 전자충격 이온화법을 사용하였다. 4-hydroxy- 2-alkenals를 선택적이고 높은 감도로 정량하기 위해, HHE와 HNE를 BSTFA로 유도체화시킨 후 각 각의 질량스펙트럼에서 동일하게 base peak로 나타난 m/z=157 조각 이온(fragment ion)을 Selective Ion Monitoring(SIM) 사용을 위한 선택 이온으로 정하여 분석을 실시하였다. HHE(Cayman Chemical Co., Michigan, USA)와 HNE(Cayman Chemical Co., Michigan, USA)를 외부 표준물질(external standards)로 하여, 수거한 식물성 유지로부터 4-hydroxy-2-aleknals를 정량하였다. 분석방법은 정확도 (accuracy; recovery)와 정밀도(precision; repeatability) 측면에서 validation하였다(<Table 3>).

<Table 3> Method validation for the determination of 4-hydroxy-2-alkenals

4-hydroxy-2-alkenals Mass fragments Recovery Repeatability LOD

HHE 157, 186 93% RSD=14% 5μg/kg

HNE 157, 199 86% RSD=17% 3μg/kg

2.9 식물성 유지류에서 산화촉진제 분석

유지의 종류(species), 제조방법(manufacturing type), 조리 목적(cooking type)에 따라 식물성 유지류의 산화 민감도(oxidation susceptibility)를 분석한 결과에 따라, 실제 조리 시 동일한 목적으로 사용되고 있으나, 산화안정도 측면에 있어서는 현저한 차이가 관찰된 참기름과 들기름에 대해 산화촉진제 분 석을 실시하였다. (i) 식품성분표를 근거로 한 두 기름의 주요 구성성분 비교 평가와, (ii) 두 종류의 유지류를 생산하는 제조업체와의 personal communication을 바탕으로 하여, 들기름과 참기름에서 4-hydroxy-2-alkenals 생성과 관련된 인자로 산화가능지수(PI)와 전이금속을 포함한 무기질 함량을 우 선적으로 선정하여 분석하였다.

전통적(traditional) 방법과 산업적(industrialized) 공정의 두 가지 방법으로 제조되고 있는 들기름과 참기름의 전이금속 함량은 다음과 같이 측정되었다. 일정량(0.2g)의 기름 시료를 취하여 HNO3 7ml와 과산화수소 2ml를 가한 후 마이크로파 시료용해장치(Microwave Digestion System, Ethos Touch Control, Milestone Inc, Bergamo, Italy)를 사용하여 시료를 다음의 온도 조건으로 분해 추출하였다.

시료를 3분 동안 온도를 85℃까지 올린 후, 다시 9분 동안 145℃까지 상승시킨 후, 다시 4분 동안 180℃까지 올린 후 15분간 유지시켰다. 이렇게 분해된 시료를 증류수로 20배 희석한 후 ICP-AES(Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometer, Vista-Pro, Varian, Mulgrave, Australia)에 주입하여 refected power는 1.2kw, quartz torch, flow gas는 argon, plasma flow는 15L/min, auxiliary gas flow rate는 1.5L/min, nebulizer gas flow rate는 0.7L/min의 조건에서 정량 분 석하였다.

2.10 통계 분석

실험 결과들은 통계처리 프로그램 SAS(version 9.1 for windows, Cary, NC, USA)를 이용하여 평균값 과 표준편차로 나타내었으며, ANOVA, Duncan's mulitple range test로 유의적인 차이가 있는지를 검 증하였다. 또한 산화지표 사이의 상관성은, SPSS 12.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 데 이터를 처리한 후, Pearson's correlation coefficient로 나타내었다.

3. 결과 및 고찰

3.1 식물성 유지류의 분류(Classification)

국내에 유통되는 식물성 유지를, 주요 구성 지방산(MUFA vs. n-3 PUFA vs. n-6 PUFA), 섭취 빈도, 제조사(industrialized vs. traditional), 제조방법(압착법 vs. 용매추출법), 조리조건 등 지질 산화 및 4-hydroxy-2-alkenals 생성과의 관련성에 따라 <Figure 2>와 같이 구분하였고, 이 구분 범주에 따라 산화물의 생성이 가장 큰 차이를 보이는 그룹을 선정하고자 하였다.

첫째로, 주요 구성 지방산에 따라 유지류를 구분하기 위해, 한국인이 상용하는 식물성 유지류의 주요 지방산을 결정하였고, 지방산 조성을 근거로 한 산화가능지수(PI)를 산출하였다(<Table 4>).

<Table 4> Classified fatty acid composition and peroxidability index(PI) of vegetable oils that are most consumed in Korea

Fatty acids Sesame Perilla Olive Corn Soybean Pepper seed

SFA

MUFA

PUFA

n-3 PUFA

n-6 PUFA

P/S

n-6/n-3

PI

4-hydroxy-2-alkenals 계열의 물질들 중 가장 독성이 강한 것으로 알려진 HNE와 HHE가 각각 n-6 PUFA와 n-3 PUFA에서 특이적으로 생성되는 산화 알데히드이고, 이 독성 알데히드들이 지방산화물 이며, 지방산의 산화는 유지를 구성하는 다른 불포화지방산의 존재에 의해서 상호 영향을 받을 수 있으므로, 수거된 식물성 유지류를 이를 근거로 하여, 주요 구성 지방산에 따라 MUFA군, n-6 PUFA 군, n-3 PUFA군으로 구분하였다. 수거된 식물성 유지류 중, 올리브유는 MUFA군, 콩기름, 옥수수유, 참기름, 포도씨유는 n-6 PUFA군, 들기름은 n-3 PUFA군을 대표하는 유지류로 확인되었다. 지방산 조 성을 근거로 하여 산출되는 산화가능지수는, 올레산(oleic acid, C18:1)이 주요 지방산(75.3%)인 올리 브유에서 최저치 8.0, 리놀렌산(linolenic acid, C18:3)이 주요 지방산(61.3%)인 들기름에서 최고치 136.2를 나타내어, 식물성 유지의 경우, 종별로 넓은 범위에 걸쳐 분포함을 알 수 있었다. 이러한 결

과는 식물성 유지류는 4-hydroxy-2-alkenals의 전구체 함량뿐 아니라, 개별 유지류가 처해 있는 산화 적 환경도 서로 상이함을 시사한다고 할 수 있다. 따라서 식물성 유지류의 산화 상태, 산화 민감도, 산화 유래 독성물질의 평가에 있어서는 전체 유지류를 grouping하는 방식이 아닌, 종별 유지류 각각 을 평가하는 과정이 필요하다고 할 수 있다.

<Figure 2> Various classifications of vegetable oils commonly consumed in Korea

둘째로, 국민영양조사에 근거하여 식물성 유지류를 분류한 결과, 한국인이 섭취하는 총 식물성 유 지류의 98%를 차지하는 참기름, 들기름, 옥수수유, 콩기름이 다소비 식물성 유지류로 구분되었다. 위 해 물질인 4-hydroxy-2-alkenals에 대한 노출량은 개별 식물성 유지류에서 형성되는 4-hydroxy- 2-alkenals의 함량뿐 아니라, 해당 유지류의 섭취량에 의해 절대적으로 영향을 받으므로, 특히 이들 4 종 유지류의 산화 상태, 산화 민감도 평가 및 이에 따른 4-hydroxy-2-alkenals 저감화 방안 제시는 식 품 위생 및 안전성 측면에서 그 의미가 크다고 할 수 있다.

셋째, 들기름과 참기름의 경우는 다른 유지류와는 달리, 산업적 공정에 의해 제조될 뿐 아니라, 각 지역에서 전통적 방법으로 제조․소비되는 경향이 크게 나타났다. 따라서 시료 수거에 있어서도 전 통적 시료를 포함시켰다. 들깨나 참깨를 볶고(roasting), 압착(pressing)하여 제품을 완성하는 전통적

러한 추가 공정은 전이금속(transition metals)과 같은 산화촉진제를 제거하여 산화를 억제할 수도 있 고, 내재하는 고유의 항산화제를 제거하여 산화를 촉진시킬 수도 있어, 해당 유지류에서 4-hydroxy-2-alkenals의 생성에 긍정적 혹은 부정적으로 작용할 수 있다. 따라서 다소비 유지류에 속 하며, n-6 PUFA군과 n-3 PUFA군에 각각 속하는 참기름과 들기름에서 제조공정에 따른 산화 상태의 비교 및 산화 촉진제 분석은 4-hydroxy-2-alkenals의 생성과 소멸을 이해하는 데 중요한 정보를 제공 할 것으로 예상할 수 있다.

넷째, 식물성 유지류는 실제의 조리 조건에서 볶음, 무침, 튀김의 용도로 사용된다. 4-hydroxy- 2-alkenals가 산화 유래 생성물임을 고려할 때, 다양한 조리 방법들 중 고온에서 진행되는 튀김 (deep-frying) 조리법은 4-hydroxy-2-alkenals의 생성을 가장 현저하게 증가시킬 수 있음을 예상할 수 있다. 강원도 삼척, 동해 지역에 소재하는 급식인원 600명 이상인 초, 중, 고등학교 단체급식소를 대 상으로 문의 조사한 결과를 그 근거로 할 때, 한국인이 섭취하는 다소비 유지류 4종 중에서, 실제 튀 김에 사용된 기름은 콩기름으로 확인되었다. 콩기름의 경우, HNE를 생성하는 전구체 지방산인 n-6 PUFA가 주요 구성 지방산이므로, 고온 처리 시 상당량의 HNE가 생성될 가능성이 있으므로, 콩기름 의 산화 상태 및 산화 민감도 평가는 4-hydroxy-2-alkenals의 생성과 소멸을 이해하는 데 필요하다고 말할 수 있다.

식물성 유지류를 분류한 위의 결과는, 지방산 산화에 의해 생성되는 독성 알데히드인 4-hydroxy-2-alkenals의 국민 노출량을 감소시키기 위해서 다소비 유지류에서 이 독성 알데히드의 생 성과 소멸을 이해하는 과정이 필요함을 시사하고 있다. 이를 위해 다음 단락에서는, (i) 산화가능지수 (PI)가 유지의 종별로 넓게 분포하였기 때문에, 종별 유지류의 산화 상태 및 산화 민감도를 우선적으 로 평가하였고, (ii) 이 결과에 근거하여, 4-hydroxy-2-alkenals의 생성이 소비자의 선택에 따라 현저한 차이를 유발할 수 있을 식물성 유지류를 선별하였다. (iii) 이후 해당 유지류에서 4-hydroxy-2-alkenals 를 측정하였고, (iv) 다양한 산화지표와의 상관성을 분석하여 4-hydroxy-2-alkenals의 생성에 영향을 주는 관련 인자를 추출하고자 하였다.

3.2 식물성 유지류의 산화 상태(Oxidation Status) 평가

종별 폭넓은 산화가능지수를 보였던 다양한 식물성 유지를 개봉 직후 일정량을 취하여 식물성 유지 의 종별 산화 정도를 비교하였다(<Table 5>). 수분은 0.03～0.08%, hydroperoxides는 36.0～700.3μg/g, MDA는 36.5～1068.2μg/g의 범위를 보였다. 특히 hydroperoxides의 경우 참기름에서 최소값을 헤이즐 넛유에서 최대값을 보였으며, MDA의 경우 헤이즐넛유에서 최소값을 들기름에서 최대값을 나타내었 다. Hydroperoxides의 경우 산화의 중간 산물로 산화가 진행됨에 따라 생성된 hydroperoxides는 β- scission에 의해 분해가 일어나 aldehyde, alcohol, ketone 등의 물질로 전환하게 된다. 이러한 사실을

고려할 때, 다른 식물성 유지류에 비해 헤이즐넛의 높은 hydroperoxides 수준과 낮은 MDA 수준은 헤이즐넛유의 산화 단계를 예측 가능하게 하였다. 즉 hydroperoxides의 증가는 뒤이은 decomposition 반응에 의해 MDA의 증가를 유발하게 되는데, 헤이즐넛유의 낮은 MDA 수준은 다른 식물성 유지에 비해 산화가 비교적 느린 속도로 진행되고 있음을 암시하고 있다. 한편 식물성 유지 중 실제 조리에 서 동일한 목적(무침)으로 사용되는 들기름과 참기름의 경우 대조적인 결과를 보였다. 동일한 실험 조건에서, 참기름은 hydroperoxides 36.0μg/g, MDA 58.2μg/g, 들기름은 hydroperoxides 163.5μg/g, MDA 1068.2μg/g로 나타나, 참기름에 비해 들기름에서 hydroperoxides는 4.5배, MDA는 18.4배의 높 은 생성량을 나타내었다. 이러한 경향은 상업적으로 생산된 기름(<Table 6>)과 전통적 재래적으로 생 산된 기름(<Table 7>)으로 구분하여 참기름과 들기름을 비교했을 경우에도 일관되게 나타났다. 이는 앞서 평가된 지표인 기름의 산화가능지수(PI)와 관련이 클 것으로 사료된다(<Table 4>). 즉 식물성유 지를 구성하고 있는 지방산 조성을 근거로 한 PI값이 들기름은 136.2로 산출되어 평가된 식물성 유 지류 중에서는 가장 높은 것으로 확인되었고, 특히 이 수치는 참기름의 PI(45.8)와 비교할 때, 참기름 의 3배에 상당하였다.

4-hydroxy-2-alkenals는 독성을 지닌 대표적인 α,β-unsaturated aldehydes이고, 이 α,β-unsaturated aldehydes 생성량을 반영하는 산화평가지수로 p-anisinde value(p-AV)를 측정하였다. 그 결과 국내에 서 시판되는 식물성 유지류 중에서 한국인의 다소비 유지류에 속하는 4종의 기름, 즉 콩기름, 옥수수 유, 참기름 들기름에서 상대적으로 높은 수준의 α,β-unsaturated aldehydes가 생성되었음을 확인할 수 있었다. 이는 식물성 유지의 섭취로 노출될 수 있는 4-hydroxy-2-alkenals를 줄이기 위해서는, α,β- unsaturated aldehydes의 절대적 함량이 높았고 섭취 수준 또한 높았던 4종의 식물성 유지를 우선적으 로 검토해야 함을 시사하였다.

<Table 5> Oxidation status of various vegetable oils

Vegetable oils Moisture(%) Hydroperoxides(μg/g) MDA(μg/g) p-AV

Soybean oils 0.08±0.01^a 341.0±9.3^e 180.7±13.8^bc 2.9±4.8^ab

Corn oils 0.04±0.01^bc 280.8±6.8^ef 85.5±3.3^bcd 5.2±1.8^a

Sesame oils 0.03±0.00^bc 36.0±1.5^h 58.2±2.0^bcd 1.4±0.3^ab

Perilla oils 0.03±0.01^c 163.5±8.8^g 1068.2±224.2^a 2.9±0.9^ab

Olive oils 0.08±0.01^a 618.7±32.5^bc 50.4±2.2^cd -10.3±6.4^cd

Grapeseed oils 0.07±0.01^a 660.9±47.5^ab 62.8±9.68^bcd -13.6±4.1^ab

Canola oils 0.07±0.01^a 569.9±5.9^cd 187.5±14.3^b -10.0±8.1^cd

Pepper seed oils 0.05±0.02^b 598.0±26.3^bc 172.8±13.9^bc 0.4±0.4^ab

Hazelnut oils 0.03±0.01^bc 700.3±17.2^a 36.5±2.4^d -3.2±4.1^bc

Functional oil-1 0.08±0.00^a 249.9±8.9^f 124.0±5.8^bcd -3.0±5.8^bc

a d bc bc

<Table 6> Comparison of oxidation status between sesame oils and perilla oils that are produced in an industrialized manner

Vegetable oils Moisture(%) Hydroperoxides(μg/g) MDA(μg/g) p-AV Sesame oils

Perilla oils

F value 0.59 66.93 526.58 1.25

p value

Values with different superscripts in the same column are significantly different.

<Table 7> Comparison of oxidation status between sesame oils and perilla oils that are produced in a traditional way

Vegetable oils Moisture(%) Hydroperoxides(μg/g) MDA(μg/g) p-AV Sesame oils

Perilla oils

F value 2.08 66.60 376.53 0.29

p value

Values with different superscripts in the same column are significantly different.

4종의 다소비 식물성 유지류 중, 동일한 조리 목적으로 사용되고 있음에도 대조적인 산화 결과를 보인 들기름과 참기름은, 산업적 공정에 의해 제조된 기름뿐 아니라 재래식 방법에 의해 제조된 기 름도 아울러 소비되고 있다. Roasting-pressing 이후에 진행되는 공정에 의해 식물성 유지류 자체의 산화촉진제나 항산화 물질들의 증감이 예상되므로, 2가지 서로 다른 제조방법으로 제조․시판되고 있는 참기름과 들기름의 경우는 소비자의 선택에 따라 최종 소비 단계에서 노출될 수 있는 4-hydroxy-2-alkenals의 함량도 달라질 수 있을 것으로 보인다. 따라서 특히 이 두 종의 기름에 있어 서는, 제조방법에 따라 산화 정도가 유의적으로 차이를 나타내는지를 검토하고자, 수거된 참기 름과 들기름을 제조방법에 따라 구분하여 산화 정도를 평가하였다(<Table 8～10>).

앞서 설명한 것과 같이, 제조방법과 관계없이 들기름과 참기름의 산화 정도를 동일 조건에서 비교 했을 때, 들기름은 참기름에 비해 높은 수준의 산화물을 생성하였다(<Table 8>). 동일 기름 내에서 제조방법에 따라 비교하게 되면, 참기름과 들기름 모두에서 제조방법에 따른 산화 정도의 유의적인 차이가 관찰되었다. 참기름의 경우, 상업적으로 제조된 기름은 전통적 방식으로 제조된 기름이 비해 7배 높은 수준의 hydroperoxides, 1.5배 낮은 수준의 MDA 생성량을 보였다(<Table 9>). Hydro- peroxides의 생성과 분해를 경유하여 MDA가 생성된다는 사실을 고려하면, 상업적으로 제조된 참기 름은 전통적으로 제조된 참기름에 비해 상대적으로 산화가 느린 속도로 진행됨을 암시하고 있다. 들

기름의 경우는, MDA 생성량은 제조방법에 따라 유의적인 차이가 관찰되지 않았으나, hydroperoxides 의 함량은 전통적 방식으로 제조된 들기름에서 2.3배 낮게 관찰되었다(<Table 10>). 이 결과는 참기 름과 달리 들기름은, 전통적 제조방식이 상업적 제조 방식에 비해 산화물을 적게 생성함을 시사하고 있다. 한편 4-hydroxy-2-alkenals를 포함한 α,β-unsaturated aldehydes 총량을 반영하는 p-AV값은, 참기 름, 들기름 모두 제조방법에 따른 유의적인 차이를 나타내지 않았다(<Table 9～10>).

<Table 8> Comparison of oxidation status between sesame oils and perilla oils

Vegetable oils Moisture(%) Hydroperoxides(μg/g) MDA(μg/g) p-AV Sesame oils

Perilla oils

F value 4.29 37.07 958.96 6.21

p value

Values with different superscripts in the same column are significantly different.

<Table 9> Oxidation status of sesame oils depending on manufacturing type

Manufacturing

Type Moisture(%) Hydroperoxides(μg/g) MDA(μg/g) p-AV

Industrialized

Traditional

F value 0.47 6.85 37.33 2.39

p value

Values with different superscripts in the same column are significantly different.

<Table 10> Oxidation status of perilla oils depending on manufacturing type

Vegetable oils Moisture(%) Hydroperoxides(μg/g) MDA(μg/g) p-AV Industrialized

Traditional

F value 2.34 41.45 0.01 0.17

p value

Values with different superscripts in the same column are significantly different.

3.3 식물성 유지류의 산화 민감도 평가

지방의 산화는 시간의 함수이다. 소비자가 식물성 유지류를 구입하여 개봉하게 되면, 식물성 유지류 는 산소와의 접촉으로 개봉 시점을 시작으로 산화 반응이 개시된다. 시간이 경과함에 따라 산화 생 성물은 비례적으로 증가하는 경향을 보이므로, 시간의 경과에 따른 유지의 산화안정도를 평가하는 과정이 필요하다. 따라서 본 연구 단락에서는 개봉 직후 동일 조건에서 산화 정도를 평가한 위의 결 과에 덧붙여, 시간의 경과에 따른 산화물의 생성 정도를 예측하기 위해 산화 유도 시스템을 식물성 유지에 적용하여 각 식물성 유지의 종별 산화안정도를 비교 평가하였다(<Figure 3>, <Figure 4>). 또 한 상업적 방법과 전통적 방법으로 동시에 제조 판매되고 있는 참기름과 들기름에 한해서는 제조방 법에 따른 산화안정도를 함께 비교 평가하였다(<Figure 5>, <Figure 6>).

다양한 종류의 식물성 유지를 iron과 ascorbic acid로 유도된 산화 시스템에 노출시킨 후, 시간의 경 과에 따라 생성된 독성 알데히드인 MDA의 양을 모니터링함으로써, 국내에서 시판되는 식물성 유지 류의 산화 민감도(Oxidation Susceptibility)를 평가하였다. 리놀렌산(linolenic acid, c18:3)이 주요 구성 지방산을 이루어 가장 높은 산화가능지수(PI)를 보였던 들기름에서는, 시간의 경과에 따라 0분에서 79 μg/g의 MDA가 관찰되었고, 40분 경과 시점에서 이미 1,248μg/g의 MDA가 생성된 것으로 확인되었 다. 들기름 0분에서 관찰된 최소 MDA 양인 79μg/g은, 카놀라유를 제외한 모든 기름의 최대 MDA 생 성량보다도 높은 것으로 나타나, 들기름은 다른 종의 식물성 유지와 비교할 때 산화 민감도가 현저하 게 높은 것으로 나타났다(<Figure 3>). 들기름의 이러한 특성은, 앞서 평가된 동일 조건에서의 식물성 유지류의 산화 상태를 평가한 결과(hydroperoxides, MDA, p-AV)와도 일치하였다. 이는, 다소비 유지 류이면서 산화가능지수가 현저하게 높은 들기름을 소비자들이 섭취할 경우, 산화에 의해 생성되는 독 성 알데히드에 불가피하게 노출될 수 있으므로 안전성 문제를 유발할 수 있음을 시사하였다.

<Figure 3> MDA contents of various vegetable oils that were subjected to the oxidation system induced with iron and ascorbic acid. SO, soybean oil; GSO,

grapeseed oil; CaO, canola oil; OvO, olive oil; CO, corn oil; HO, hazelnut oil; FO, functional oil; PSO, pepper seed oil; SEO, sesame oil; PO, perilla oil

들기름을 제외한 다른 종의 식물성 유지류의 산화 민감도 및 시간에 따른 산화 추이는 <Figure 4>에 나타내었다. 포도씨유(GSO), 헤이즐넛유(HO), 기능성 오일(FO­1, FO-2), 참기름(SEO), 옥수수유 (CO), 고추씨기름(PSO)은 시간이 경과해도 MDA를 거의 생성하지 않았다. 특히 국내에서 조리 시 동일 목적으로 사용되고 있는 들기름과 참기름의 대조적인 산화 민감도는 주목할 만하다. 콩기름 (SO)의 경우, 270분 경과 시 27μg/g의 MDA가 생성되었으나, 이 양은 들기름과 비교할 때 들기름 0 분에서 관찰된 양보다 3배나 적은 양으로 유의적 수준이 아니었다. 한편 카놀라유(CaO), 올리브유 (OvO)는 시간이 경과함에 따라 MDA가 증가하는 경향을 나타내었다. 카놀라유는 330분에 최대 114.8μg/g, 올리브유는 270분에 37.4μg/g의 MDA를 생성하였으나, 이 양 역시 들기름에서 관찰된 양 과 비교하면 10배 이상 낮은 수준이었다. 올레산(oleic acid, C18:1)을 주요 구성 지방산으로 가지고 있어 다른 식물성 유지류에 비해 낮은 산화가능지수(PI=8.0)를 나타낸 올리브유를, 상대적으로 높은 PI값을 지닌 참기름(PI=45.8)과 비교하면, 올리브유에서 생성된 산화물의 양이 시간의 함수로 증가된 결과는, 지방산의 조성 이외에 이들 유지류에 고유하게 존재하는 산화촉진제, 혹은 항산화제가 식물 성 유지류의 민감도에 결정적 역할을 하고 있음을 알 수 있다.

<Figure 4> Induced MDA contents of various vegetable oils as a function of time. The oils

고 있는 들기름과 참기름의 경우는 상이한 패턴을 나타내었다(<Table 6～10>). 전체적으로 들기 름은 참기름에 비해 높은 산화 상태를 나타내었고, 이러한 현상은 제조방법에 관계없이 일관되게 관 찰되었다. 동종의 기름 내에서는, 참기름은 상업적으로 제조된 기름이, 들기름은 전통적 방법으로 제 조된 기름이 산화물의 생성이 낮은 것으로 확인되었다. 개봉 직후의 평가뿐 아니라, 시간의 함수로 평가된 들기름과 참기름의 산화안정도 실험 역시 동일한 결과를 나타내었다(<Figure 5>, <Figure 6>).

먼저 들기름의 경우를 살펴보면(<Figure 5>), 전통적 기름은 시간의 경과에 따라 MDA 생성량의 현 저한 변화가 관찰되지 않았으나, 상업적 기름은 시간에 따라 최대 22배까지 생성량이 증가되는 것이 관찰되었다. 특히 PO-6 상업적 시료와 PO-13 전통적 시료를 비교하면 MDA의 최대 생성량이 각각 4934.3μg/g과 439.3μg/g으로 10배 이상의 차이가 관찰되었다. 한편 참기름은 개봉 직후의 산화 상태 평가에서 낮은 수준의 MDA를 생성했던 대표적 상업적 시료 SEO-1과 SEO-2에서 선택적으로 시간 의 경과에 따른 산화안정도를 평가하였다(<Figure 6(Left)>). 그 결과 두 시료는 MDA를 거의 생성하 지 않아 높은 수준의 산화안정도를 나타내었다. 한편 전통적 방식으로 생산된 참기름은 산화 유도 후 270분까지는 상업적 참기름과 동일한 높은 수준의 산화안정도를 나타내었으나, 그 후 급격하게 MDA가 증가하는 것이 관찰되었다(<Figure 6(Right)>). 그러나 전통적 참기름에서 관찰된 MDA 수준 은 들기름에서 관찰된 최대 MDA 생성량의 1/40 수준으로 여전히 들기름에 비해 높은 수준의 산화 안정도를 나타내었다. 다만 참기름을 제조방법에 따라 구분하여 산화안정도를 평가할 경우, 상업적 참기름이 전통적 참기름에 비해 산화가 더 지연되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는, 상업적 참기름은 roasting-pressing 이후의 추가 공정으로 기름 내부에 항산화 인자를 전통적 참기름에 비해 더 보유했을 가능성을 시사하였다.

<Figure 5> Induced MDA contents of various brands of perilla oils depending on manufacturing type(Left: industrialized, Right: traditional) MDA was monitored as a function of time

<Figure 6> Induced MDA contents of various brands of sesame oils depending on manufacturing type(Left: industrialized, Right: traditional) MDA was monitored as a function of time

3.4 제조방법에 따른 참기름과 들기름의 4-hydroxy-2-alkenals 정량

다양한 식물성 유지의 개봉 직후의 산화 상태(oxidation status) 평가와 시간의 경과에 따른 산화민감 도(oxidation susceptibility)를 평가한 결과, 4-hydroxy-2-alkenals의 생성 및 소멸과 관련하여 검토될 식 물성 유지류로 참기름과 들기름을 선정하였다. 이는 참기름과 들기름이 첫째, 한국인이 소비하는 4대 다소비 유지류 중에 속하며, 둘째, 실제 조리 시 동일한 목적으로 사용되고 있고, 셋째, 그럼에도 산 화 상태 및 산화안정도를 평가한 실험에서 참기름은 높은 산화안정도를 보이고 들기름은 극도로 낮 은 산화안정도를 보임으로써 대조적인 양상을 나타냈기 때문이다. 또한 넷째, 국내에서 소비되고 있 는 다른 식물성 유지류와는 달리 두 가지의 제조방법, 즉 상업적 방법과 전통적 방법 모두로 제조․

소비되고 있기 때문이다. 따라서 본 연구 단락에서는 제조방법을 구분하여 들기름과 참기름의 4-hydroxy-2-alkenals를 정량 분석하였다.

<Table 11> 4-hydroxy-2-alkenals in perilla oils and sesame oils depending on manufacturing type

Perilla oils HHE(μg/g) HNE(μg/g) Sesame oils HHE(μg/g) HNE(μg/g)

Industrialized

Industrialized

Traditional

Traditional

p value

p value

4-hydroxy-2-alkenals의 전구체인 이들 지방산의 함량을 고려하면, 들기름은 HHE를, 참기름은 HNE를 더 우세하게 생성할 것으로 예상되었다. 실제로 4-hydroxy-2-alkenals를 분석한 결과, 들기름에서는 HHE, 참기름에서는 HNE가 상대적으로 더 많은 양이 검출되었다. 제조방법에 따라 들기름과 참기름 의 산화 상태 및 산화안정도를 평가한 앞의 결과에서, 들기름은 상업적 들기름이, 참기름은 전통적 참기름이 더 낮은 산화안정도를 보임으로써 제조방법에 따른 현저한 차이가 관찰되었다. 그러나 제 조방법에 따라 4-hydroxy-2-alkenals를 분석 비교한 결과, 들기름은 제조방법에 따른 HHE, HNE의 함 량 차이가 관찰되지 않았고, 참기름은 전통적 참기름에서 유의적으로 더 높은 수준의 HNE가 생성되었음을 알 수 있었다(<Table 11>). 다양한 식물성 유지에서 hydroperoxides, MDA를 측정함으 로써 유지의 산화 상태 및 산화민감도를 평가한 실험에서는, 측정된 산화지표들이 개별 유지류의 산 화가능지수(PI)와 상관성을 나타내었다. 즉 PI값이 비교적 높은 기름은, 개봉 직후의 산화 생성물의 양 및 산화 유도 시스템 하에서의 MDA양이 PI 지수가 낮은 기름과 비교할 때 상대적으로 높은 것 으로 나타났다. 두 가지 방법으로 제조, 판매되고 있는 들기름과 참기름은 제조방법에 따라 서로 상 이한 산화안정도를 뚜렷하게 나타내었고, 이러한 현상은 측정된 hydroperoxides, MDA, induced MDA 모두에서 일관되게 관찰되었다. 반면 4-hydroxy-2-alkenals는 제조방법에 따른 산화안정성의 이러한 차이를 반영하지 못하는 것으로 해석되었다. 이는, 지방의 자동산화 과정을 고려하면, hydroperoxides 와 MDA는 n-3 지방산과 n-6 지방산의 구분 없이 모든 다가불포화지방산에서 생성 가능한 물질인 반면, HHE와 HNE는 각각 유도되는 전구체 지방산이 n-3와 n-6 지방산으로 구분되어 있다는 사실과 일부 관련 있을 것으로 보인다. 한편, hydroperoxides와 MDA의 생성을 촉진 혹은 억제시키는 인자와 4-hydroxy-2-alkenals의 생성 관련 인자가 서로 다를 가능성도 여전히 배제할 수 없다. 따라서 다음 단락에서는, 우선 (i) 다양한 식물성 유지류에서 측정된 산화지표들 사이의 상관성을 평가하고, (ii) 4-hydroxy-2-alkenals는 hydroperoxides, MDA와는 달리 지방산 조성에 근거한 산화가능지수(PI)와 상 관성이 낮았으므로, HHE와 HNE의 경우에는 전체 지방산 조성이 아닌 개별 지방산과의 상관성을 아 울러 평가하고자 하였다. 이는 HHE와 HNE가 각각 n-3 지방산과 n-6 지방산 고유의 산화물이므로, 전체적 불포화도를 고려한 산화가능지수(PI)보다는 개별지방산과의 관련성이 더 높을 것으로 사료되 었기 때문이다.

3.5 식물성 유지에서 산화지표 사이의 상관성 평가

다양한 식물성 유지에서 측정된 산화지표인, 수분, hydroperoxides, MDA, p-AV 지수 사이의 상관성 을 상업적 제조 기름과 전통적 제조 기름으로 구분하여 평가하였다(<Table 12～13>). 그 결과 상업 적 제조 기름에서, 지방산 산화의 초기 산화물인 hydroperoxides 수준과, 2차 산화산물이며