Characterization of Hemolytic Aeromonas sp. MH-8 Responding to the Exposure of Green Tea Catechin, EGCG

녹차 카테킨 EGCG의 노출에 따른 식중독 세균인 용혈성 Aeromonas sp. MH-8 의 특성조사

김동민, 오계헌*

Characterization of Hemolytic Aeromonas sp. MH-8 Responding to the Exposure of Green Tea Catechin, EGCG

Dong-Min Kim and Kye-Heon Oh*

Received: 5 September 2016 / Revised: 24 November 2016 / Accepted: 25 November 2016

© 2016 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract: The aim of this study was to characterize the hemo- lytic Aeromonas sp. MH-8 exposed to green tea catechin, epi- gallocatechin gallate (EGCG). Initially, the hemolytic Aero- monas sp. MH-8 was enriched and isolated from stale fish.

Bactericidal effects of MH-8 exposed to EGCG ranging from 1 mg/mL to 4 mg/mL were monitored, and complete bacteri- cidal effects were achieved within 3 h at 3 mg/mL and higher concentrations. SDS-PAGE with silver staining revealed that the amount of lipopolysaccharides increased or decreased in the strain MH-8 treated to different concentrations and expos- ing periods of EGCG in exponentially growing cultures. The stress shock proteins (70-kDa DnaK and 60-kDa GroEL), which might contribute to enhancing the cellular resistance to the cytotoxic effect of EGCG, were induced at different con- centrations of EGCG exposed to cell culture of MH-8. Scan- ning electron microscopic analysis demonstrated the presence of irregular rod shapes with umbilicated surfaces for cells treated with EGCG. 2-DE of soluble protein fractions from MH-8 cultures showed 18 protein spots changed by EGCG exposure. These proteins involved in chaperons (e.g., DnaK, GroEL and trigger factor), enterotoxins (e.g., aerolysin and phospholipase C precursor), LPS synthesis (e.g., LPS biosyn- thesis protein and outer membrane protein A precursor), and

various biosynthesis and energy metabolism were identified by peptide mass fingerprinting using MALDI-TOF. In conse- quence, EGCG was found to have substantial antibacterial effects against food-poisoning causing bacterium, hemolytic Aeromonas sp. MH-8. Also the results provide clues for under- standing the mechanism of EGCG-induced stress and cyto- toxicity on Aeromonas sp. MH-8.

Keywords: Aeromonas sp. MH-8, Hemolysis, Green tea cate- chin, EGCG

1. INTRODUCTION

녹차는 우리나라뿐만 아니라 일본, 중국 등을 포함하는 전 세 계적으로 음용되어지는 가장 대중적인 차의 한 종류로서, 폴 리페놀, 카페인, 아미노산, 비타민, 무기질 등의 여러 성분으 로 구성되어있다 [1]. 최근 연구를 통해 녹차에 포함된 카테 킨의 항산화 효과, 혈당감소 효과, 노화방지 효과, 살균효과 등의 다양한 효과가 있는 것으로 알려지고 있어 음료로서의 녹차뿐만 아니라 다양한 기능성에 대하여 주목받고 있다 [2- 4]. 녹차에 포함된 주요 카테킨에는 epigallocatechin gallate (EGCG), epigallocatechin (EGC), epicatechin gallate (ECG), epicatechin (EC), gallocatechin gallate (GCG) 등이 있다. 특히 이들 가운데 EGCG는 카테킨의 40% 이상을 차지하며, 강한 생리활성이 있는 것으로 알려져 있다 [4]. EGCG는 E. coli, B.

cereus, S. mutans, MRSA 등의 식중독 및 구강미생물, 항생제

Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang Univ- ersity, Asan 31538, Korea

Tel: +82-41-530-1353, Fax: +82-41-530-1493 e-mail: kyeheon@sch.ac.kr

연구논문

내성균주 등에 대하여 강력한 살균효과에 대하여 보고된 바 있어 이에 대한 활용에 관심이 집중되고 있다 [4-7].

Aeromonas 는 그람음성의 간균으로 자연계에 널리 분포되 어있으며, 의학 및 수의학적 병원체로 관심 받고 있는 세균이 다. Bacillus, Clostridium, Escherichia, Listeria, Salmonella, Sta- phylococcus, Vibrio 등과 함께 식중독을 유발하는 세균으로 알려져 있으나, 다른 세균과는 달리 Aeromonas에 의한 식중 독 발생 기작은 충분히 규명되지 않아서 예방 및 관리에 있어 서 문제가 되고 있다. 최근 연구에 따르면 Aeromonas 속의 일 부 균주가 장독소 (enterotoxin), 세포독소 (cytotoxin), 용혈독 소 (hemolysin) 등을 생성하여 위장관 등을 감염시킬 수 있으 며, 상피세포에 침입할 수 있는 능력을 지니고 있는 것으로 보고되어 중요한 장병원체 (enteropathogen)로 인식되고 있다 [8]. Aeromonas는 국내의 양식장에서 주로 발견되며 어류의 양식에 있어서 수온, 고밀도 사육, 수중 유기물 등의 여러 환 경적 요인에 의해 손상된 조직에 감염되어 어류의 집단 폐사 를 일으키는 것으로 보고되었으며 [9], 경제적 손실을 비롯한 많은 문제점이 발생되어 이를 해결하기 위한 방안 및 대안의 필요성이 제시되고 있다 [10]. 이를 해결하기 위하여 양식업 에서는 합성 항생물질이나 소독제를 사용하여, Aeromonas의 감염 예방을 위하여 노력하고 있으나 항생제의 과다사용으 로 인하여 Aeromonas 뿐만 아니라, Vibrio, Enterobacter, Citro- bacter 등의 세균에서도 여러 항생제에 대하여 다재내성 발생 이 보고되고 있는 실정이다 [11]. 또한 항생제 사용으로 인한 추가적인 환경오염이나 항생제 내성 균주에 오염된 생선을 섭취함으로서 건강상의 문제를 일으킬 수 있는 등의 2차 피 해가 우려되고 있다.

본 연구에서는 상한 생선에서 Aeromonas sp. MH-8을 분리 하고, 분리세균이 EGCG에 노출되었을 때 일어나는 여러 가 지 세포반응 및 프로테옴 분석을 실시하였다. 먼저 EGCG에 노출되었을 때의 분리세균의 생존율을 조사하였으며, SDS- PAGE와 silver staning을 통해 LPS의 변화를 관찰하였다.

SDS-PAGE와 Western blot을 이용하여 분리세균이 아치사량 의 EGCG에 노출되었을 때 유도 발현되는 스트레스충격 단 백질 (SSPs)의 변화와 주사전자 현미경을 이용하여 노출에 따 른 세포외부 형태의 변화를 관찰하였다. 또한 EGCG에 노출 되었을 때 일어나는 다양한 프로테옴 변화를 2-DE와 MALDI- TOF 분석을 통하여 확인하였다.

2. MATERIALS AND METHOD

2.1. 균주의 확보 및 배양조건

본 연구에 사용된 균주는 상한 생선에서 농화 배양기법을 이 용하여 분리하였다. 시료 약 5 g을 채취하여 100 mL의 생리 식염수가 담긴 플라스크에 넣고 교반시킨 후, 상등액 100 µL 를 취하여 5% sheep blood agar (Difco Co, Sparks, USA)배지 에 평판 도말하고, 30

C에서 24시간 배양하였다. 용혈능을 가 지는 세균을 분리하기 위하여 배양 과정에서 집락 주변에 투

명대 (clear zone)을 생성하는 균주를 선별하였으며, 선별된 균주를 혈액평판배지에 3회에 걸친 도말평판법을 이용한 순 수배양기법으로 세균을 분리하였다.

2.2. EGCG 노출에 대한 분리세균의 생존율 조사

분리세균의 EGCG 노출에 의한 생존율을 알아보기 위하여 분리세균을 LB 액체 배지에 배양하여, 파장 660 nm에서 혼 탁도가 1.0일 때, 배양액을 4

C 를 유지하며 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리 하였다. 얻어진 균체를 PBS (pH 7.4)로 3회 세 척하고, 다시 원심분리를 실시하여 얻어진 균체에 다양한 농 도의 EGCG에 노출시켰다. 30분 간격으로 LB 고체 평판 배 지에 100 µL씩 평판 도말하여 30

C 에서 24시간 배양한 후, 형 성된 집락을 계수하여 EGCG의 농도와 노출 시간에 따른 분 리세균의 생존율을 조사하였다.

2.3. 분리세균의 LPS의 추출

EGCG의 농도와 노출 시간에 따른 분리세균의 LPS 변화를 관찰하기 위하여 EGCG를 농도별 (0~4 mg/mL)로 3시간 동 안 노출시킨 균체와 3 mg/mL의 동일한 농도에서 30분 간격 으로 노출 시간의 변화를 주어 최대 180분까지 노출시킨 균 체를 원심분리하여 (4

C, 13,000 rpm) 얻었다. 얻어진 모든 균 체를 각각 PBS로 3회 세척하여 phenol-water 추출법 [13]에 근거한 LPS Extraction kit (Intron, Korea)를 사용하여 분리세 균의 LPS를 추출하였다. 균체에 lysis buffer를 넣어 완전히 현탁시킨 후, chloroform을 첨가하여 10~20초간 교반하고 실 온에서 5분간 반응시켰다. 반응시킨 균체를 13,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 새로운 튜브에 옮기고, puri- fication buffer 를 넣고 혼합하여 -20

C 에서 10분간 반응시켰 다. 반응시킨 혼합액을 4

C를 유지하면서 15분간 원심분리하 여 균체를 회수하고 70% ethanol을 첨가하여 균체를 세척한 후 완전히 건조시켰다. 건조시킨 균체에 10 mM Tris-HCl buf- fer (pH 8.0)를 넣고 45분간 반응시켜 LPS를 추출하였다. 고 순도의 LPS를 얻기 위해 추출한 LPS에 proteinase K를 첨가 하여 60

C에서 1시간 반응시켜 LPS를 정제하였다.

2.4. SDS-PAGE 와 silver staining

LPS의 변화를 Fomsgaard의 방법 [14]에 따라 SDS-PAGE 및 변형된 silver staining을 통하여 확인하였다. SDS-PAGE의 se- parating gel은 12% acrylamide gel을 사용하였으며, stacking gel은 5% acrylamide gel을 사용하였다 [15]. 전기영동한 gel 은 고정 용액 (25% isopropyl alcohol, 7% acetic acid)으로 4

C 에서 1시간 동안 처리하였다. 처리한 gel을 증류수로 세척한 후 산화 용액 (0.7% periodic acid, 3% ethanol, 0.1% acetic acid)을 첨가하여 5분간 반응시킨 후, 증류수로 30분씩 3회 세 척하였다. Silver stain 용액 (1.3% ammonium hydroxide, 18.6%

0.1 N NaOH, 0.67% silver nitrate) 에 10분간 반응시키고, 증류 수로 5분씩 3회 세척하였다. 현상액 (0.1% citric acid, 0.05%

formaldehyde)에서 밴드가 뚜렷하게 나타날 때까지 반응시키

고, 정지 용액 (0.8% acetic acid)을 넣어 반응을 정지시킨 후

증류수로 세척하여 EGCG에 노출시킨 분리세균의 LPS 변화 를 관찰하였다.

2.5. 주사전자현미경을 이용한 세포 외부 형태 관찰 EGCG 에 노출된 분리세균의 세포 외부 형태 변화를 주사전 자현미경으로 정상세포와 비교, 관찰하였다. 분리세균을 24 시간 동안 배양시킨 후, 원심분리하여 얻어진 균체를 PBS로 3 회 세척하여 준비하였다. 이 균체를 3 mg/mL 농도의 EGCG 에 각각 90분, 180분 동안 노출시킨 후, 배양액을 원심분리하 여 균체를 회수하고, 여과지에 부착하여 2.5% glutaraldehyde (Sigma, St. Louis, MO, USA)와 1% osmium tetroxide (Sigma, USA)로 각각 2시간 처리하여 고정을 실시하였다. 다양한 농 도의 ethanol (50, 60, 70, 80, 95, 100%)을 준비하여, 저 농도 로부터 점차 농도를 높여가면서 각 농도별로 10분씩 연속적 으로 탈수시켰다. 마지막으로 100% ethanol에 30분씩 2회 탈 수하고, hexamethyldisilazane (EMS, Fort Washington, PA, USA)에 20분간 반응시켜 공기 중에서 건조시켰다. 건조된 membrane filter 를 slide glass 상에 부착시키고, sputter coater (IB-3, Giko Engineering Co., Japan)를 사용하여, 2 mA로 3분 간 gold coating하여 주사전자현미경 (LEO 1455VP, ZEISS, Germany)으로 관찰하였다.

2.6. 분리세균의 단백질 획득 및 정량

분리세균 MH-8을 EGCG에 노출시킨 후, 4

C를 유지하면서 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻어진 균체를 10 mM PBS로 3회 세척하여 시료를 준비하였다. 이후 PRO-PREP

Protein extraction solution (Intron, Korea)에 균체를 현탁하여 4

C 에서 30분간 반응시켜 단백질을 추출하였다. 현탁된 세포 는 30분간 원심분리 (4

C, 13,000 rpm)한 후 단백질을 포함하 고 있는 상등액을 취하여 SMART

BCA Protein assay kit (Intron, Korea) 을 사용하여 단백질을 정량하였다.

2.7. SDS-PAGE 및 Western blotting 분석

분리세균이 EGCG에 노출이 되었을 때 스트레스 충격단백질 의 변화를 조사하기 위하여 SDS-PAGE와 Western blot을 실 시하였다. SDS-PAGE는 Bollag 등 [15]의 방법에 따라 수행하 였으며, Separating gel은 12% acrylamide gel을 사용하였으며, stacking gel은 4% acrylamide gel을 사용하였다. 전기영동 후 gel은 2.5% Coomassie brilliant blue staining solution (Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA) 1시간 동안 염색하였고, destaining solution (30% methanol, 7% acetic acid) 로 1시간 동안 탈색하 였다. EGCG에 의한 스트레스 충격단백질 (stress shock pro- teins, SSPs)을 분석하기 위하여 Sambrook 등 [16]의 방법에 따라 Western blot을 실시하였다. 1차 항체는 anti-DnaK와 anti- GroEL (StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, Canada)을 사용하였으며, 2차 항체는 anti-mouse IgG HRP conjugate (Pro- mega, Madison, USA)를 사용하였다. 항원 항체 반응을 검출 하기 위해 ECL kit (Amersham internation plc. Buckingham- shire, England)를 사용하여 X-선 필름 (AGFA, Belgium)에 현

상한 후, SSPs의 발현을 분석하였다.

2.8. 2- 차원 전기영동(2-DE)

분리세균이 EGCG에 노출되었을 때 발현되는 단백질 변화를 분석하기 위하여 대상 균주를 3 mg/mL 농도의 EGCG에 2시 간 동안 배양한 후 획득한 단백질 시료와 대조군으로서 EGCG 에 노출되지 않은 균주에서 얻은 단백질 시료를 각각 준비하 였다. 단백질 시료는 각각 180 µg/mL의 농도로 준비하여, TCA 침전법으로 시료를 정제한 후, 기존에 기술된 방법으로 이차원 젤 전기영동 (2-DE)을 수행하였다 [17]. 전기영동이 완료된 gel은 silver stain하기 위하여 고정용액 (10% acetic acid, 40% ethanol)으로 1시간 동안 고정시키고, 감광용액 (30% ethanol, 6.8% sodium acetate, 0.02% sodium thiosulfate) 에 30분 동안 gel을 반응시켰다. 반응시킨 gel을 증류수로 5분 간 3회 세척한 후, sliver stain solution (0.25% sliver nitrate, 0.04% formaldegyde)에 30분 반응시키고, 증류수로 1분씩 2회 세척하였다. 현상용액 (2.5% sodium carbonate, 0.04% formal- dehyde) 에서 단백질 spot이 관찰되면 정지용액 (1.4% EDTA) 으로 반응을 정지시켰다.

2.9. MALDI-TOF/MS 를 이용한 peptide sequencing Peptide sequencing을 위한 gel digestion은 이전에 기술된 방 법에 따라 실시되었다 [18]. 농축된 peptide시료를 Matrix buf- fer (50% ACN, 0.1% TFA) 1 mL에 녹인 후, 0.01 g의 CHCA (α-cyano-4-hydroxyciannamic acid)를 첨가하여 분석용 시료 를 만들었다. 준비된 시료를 PTFE (polytetrafluoroethylene) 필름으로 코팅된 96 well plate (Applied Biosystems Inc., Ger- many) 에 1 µL씩 주입하여 peptide를 분석하였다. MALDI- TOF/MS로 분석된 단백질의 분자량을 Mascot (http://www.

matrixscience.com)의 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)와 MS-FIT (www.prospector.ucsf.edu) database 에 근거하여 단백 질을 동정하였다.

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. EGCG 노출에 따른 분리세균의 생존율 조사

MH-8 균주의 EGCG의 농도와 노출 시간에 따른 생존율을 알 아보기 위한 실험을 실시하였다. EGCG에 노출된 세균은 노 출 농도와 시간이 증가함에 따라 점차 생존율이 감소하였다.

4 mg/mL 의 농도의 EGCG에 노출된 세균은 빠르게 집락의 수

가 감소되어 150분에 집락이 발견되지 않았으며, 3 mg/mL의

농도에서는 180분에 집락이 관찰되지 않았다 (Fig. 1). EGCG

의 살균효과는 여러 연구결과들을 통해 보고된 바 있다. Hara

등 [19]은 Aeromonas, Vibrio, E. coli, B, cereus, Plesiomonas

shigelloides 등 식중독-원인세균에 대하여 MIC 시험을 진행하

여 EGCG의 최소억제농도를 측정한 결과, Aeromonas 및 대

부분의 세균에서 1 mg/mL의 농도에서 24시간 배양시 균주의

생장이 억제됨을 확인하였다. Yu 등 [6]은 구강세균인 Strep-

tococcus 속 (S. mutans, S. sobrinus)과 Lactobacillus 속 (L. aci- dophilus, L. plantarum) 대하여 EGCG의 살균력 실험을 실시 하였으며, Streptococcus 속은 8시간 이내, 그리고 Lactobacil- lus 속은 4시간 이내 완전히 제거되는 것을 관찰하였다. 선행 연구 및 본 연구결과에서 보는 바와 같이 EGCG는 다양한 세 균에서 뛰어난 살균효과를 가지고 있어 식중독 세균을 예방, 제어하거나 산업적으로 응용가치가 있을 것으로 판단된다.

본 연구에서는 생존율 조사실험에 근거하여 분리세균이 아 치사 조건의 EGCG에 노출되었을 때 일어나는 다양한 세포 반응을 조사하기 위하여 3 mg/mL 농도의 EGCG에서 다양한 실험들을 수행하였다.

3.2. EGCG 에 노출된 분리세균의 LPS 변화 관찰

분리세균인 MH-8에 EGCG를 노출농도와 시간을 달리하여, EGCG 노출에 따른 LPS의 변화를 SDS-PAGE와 silver stain- ing을 통해 조사하였다. 추출된 LPS의 크기를 확인하기 위하 여 마커를 사용하였으며, gel 상에서 나타난 약 24 kDa의 밴 드가 LPS인 것으로 확인되었다. 분리세균에 다양한 농도의 EGCG를 노출시켜 LPS의 변화를 관찰한 결과, LPS의 양적 변화는 노출 농도가 증가함에 따라 상대적으로 증가하였으 나, 3 mg/mL의 농도에서는 LPS가 현저히 감소하였으며, 4 mg/mL의 농도에서는 완전히 사라지는 것이 관찰되었다 (Fig.

2A). 분리세균을 3 mg/mL 농도의 EGCG에서 180분 동안 노 출시켜 LPS의 변화를 확인한 결과, 노출 90분 이후부터 LPS 가 점차 감소하였으며, 180분 경과 후, EGCG에 노출되지 않 은 세균보다 LPS의 양이 적게 관찰되었다 (Fig. 2B). 살균효 과 조사 실험 결과에 따르면 3 mg/mL의 EGCG에서 180분 동 안 노출되었을 때, 세균이 완전히 사멸되는 것이 관찰되었는 데, 동일 조건 하에서 LPS의 양적변화를 관찰한 결과 분리세 균의 세포 사멸이 발생되어 LPS의 양이 감소한 것으로 사료 된다. EGCG 노출에 따른 Aeromonas 속의 LPS합성 억제에 대한 기작에 관한 연구는 보고된 바 없으나, Hajime 등 [20]은 EGCG가 E. coli와 S. aureus에서 세포벽의 지질 이중층에 손 상을 주어 세균의 생존에 영향을 준다는 결과를 보고하였다.

이들 연구에 따르면, EGCG에 노출된 그람음성 세균의 경우 그람양성 세균에 비해 낮은 세포 사멸률을 보이는데, 이는 그 람음성 세균의 LPS에 의해 EGCG와 같은 외부 살균물질의 유입을 억제하기 때문이라고 제시하였다. 본 연구의 결과와 비교하여 볼 때, MH-8 균주가 치사량 이상의 EGCG에 노출 되어 세포 내로 EGCG가 침투되어 세포 손상이 발생한 결과 LPS합성이 억제되어 결국 세포가 사멸되는 것이라고 사료된 다.

Fig. 1. Bactercidal rate of hemolytic Aeromonas sp. MH-8 follow- ing exposure to EGCG. MH-8 cells were maintained at the concen- trations of 0 mg/mL (○), 1 mg/mL (●), 2 mg/mL (■), 3 mg/mL (▲), and 4 mg/mL (◆) EGCG. At intervals, the numbers of colonies (CFU/mL) were measured. Error bars represent standard deviations based on three independent replicates.

Fig. 2. Silver stained SDS-PAGE gel profiles of LPS extracted from hemolytic Aeromonas sp. MH-8, (A) cells treated with different con- centrations of EGCG for 2 h; 0 mg/mL (lane 1), 1 mg/mL (lane 2), 2 mg/mL (lane 3), 3 mg/mL (lane 4), 4 mg/mL (lane 5), (B) cells treated with 3 mg/mL EGCG for different exposure times.

3.3. 주사전자현미경을 이용한 EGCG에 노출된 세균의 외부형태 관찰

살균효과 실험에 근거한 아치사농도의 EGCG를 처리하였을 때 일어나는 MH-8의 세포 외부형태의 변화를 주사전자현미 경으로 관찰하였다. EGCG에 노출되지 않은 MH-8 세포는 정 상적인 모습의 세포표면이 매끄러운 간균의 형태를 나타내 었다 (Fig. 3A). 그러나 3 mg/mL의 EGCG에 노출된 세균에서 는 노출되지 않은 세균과 비교하여 볼 때, 세포의 크기가 비 대해지고 정상적인 간균의 형태를 잃어버렸으며, 외형의 변 화가 관찰되었다 (Fig. 3B). 동일조건 하에서 LPS 및 SSPs의 발현이 증가한 점과 결부시켜볼 때, 세포생존을 위하여 LPS 의 증가로 세포외부의 형태와 표면의 변화가 발생한 것으로 판단된다. 동일 농도에서 180분 동안 처리된 세포들은 세포 의 표면이 거칠어지고 심각한 찌그러짐과 구멍, 움푹 패인형 태가 관찰되었다 (Fig. 3C). EGCG 노출에 따른 세포 외부형 태의 변화는 균주의 종류에 따라 다양하게 관찰되는 것으로 보고되었다. Shigemune 등 [21]은 EGCG에 노출된 B. cereus JCM2152 의 세포표면이 심하게 주름이 지고, 찌그러지는 모 습을 관찰하였으며, Cho 등 [7]은 EGCG에 노출된 imipenem- 저항성인 Klebsiella pneumonia의 세포 표면의 천공과 뭉그러 짐을 관찰하였다. 본 연구의 여러 실험에서 얻어진 결과에 근 거하여 볼 때, MH-8이 EGCG에 단시간 노출되었을 때, EGCG 의 유입을 억제하기 위하여 LPS의 양이 증가되어 세포의 표 면이 변화되었으나, 장시간에 노출이 되었을 때는 세포 외막 의 LPS가 파괴되어 EGCG가 세포 내로 유입되어 세포 사멸 에 영향을 미치는 것으로 판단된다. EGCG 노출에 의해 세포 사멸이 일어나는 기작에 대하여, Hajime 등 [20]은 녹차 카테 킨의 주성분인 EGCG가 지질 이중층에 손상을 주어 세균의 생존에 영향을 준다는 결과를 발표하였으며, Shimamura 등 [22]은 카테킨의 주성분인 EGCG가 직접적으로 펩티도글리 칸에 결합하여 세포벽을 손상시키고, 세포벽의 생합성을 방 해한다고 보고하였다. 그러나 EGCG 노출에 따른 세포 외부 형태의 변화와 세포사멸이 LPS 손상에 의한 것인지, 세포막 의 손상에 의한 것인지에 대한 보다 명확하고 구체적인 기작

에 대한 연구가 있어야 할 것으로 사료된다.

3.4. SDS-PAGE 및 Western blotting 분석

SDS-PAGE와 Western blotting은 분리세균의 EGCG 노출에 따른 스트레스 충격단백질 (SSPs)인 Dnak와 GroEL 분석을 위해 수행되었다. 다양한 농도의 EGCG (1~4 mg/mL)에 노출 된 분리세균의 SSPs의 발현은 노출농도가 증가함에 따라 감 소하는 것으로 관찰되었다 (Fig. 4A). 또한 EGCG 노출 시간 에 따른 SSPs의 발현을 조사한 결과, Dnak와 GroEL은 노출 후 초기부터 60분까지 점차 발현이 증가하였으나, 그 후로는 점차 감소하였으며, 120분이 경과한 후에는 노출이 되지 않 은 세균보다도 발현 양이 현저히 감소한 것을 확인하였다 (Fig. 4B). SSPs 인 DnaK와 GroEL은 그람음성세균인 E. coli에 서 처음 발견되어 가장 널리 연구되어 왔으며, 손상된 단백질 의 구조를 정상적으로 회복시키는 역할을 하는 것으로 보고 되었다 [23]. 또한, E. coli 뿐만 아니라 Pseudomonas, salmon- ella, B. cereus 등 다양한 균주에서도 발현이 되며 온도, H

O

, NaCl, pH 등 세포 외부 환경변화에 의해 발현이 유도되는 것 으로 보고되었다 [23,24]. 따라서 분리세균에서 EGCG에 의 해 발현의 증감을 보인 SSPs의 변화는 EGCG가 세포 사멸을 유도한 결과 분리세균이 생존을 위해 발현의 변화를 보인 것 으로 판단되며, 세균의 종류와 특성에 따라 SSPs의 발현정도 에 차이가 있는 것으로 사료된다.

3.5. 2-DE와 peptide sequencing

분리세균 MH-8의 EGCG 노출에 의해 나타난 다양한 단백질 의 변화를 이차원전기영동 (2-DE)을 통하여 비교 관찰하였 다. 3 mg/mL의 EGCG에서 2시간 동안 배양된 MH-8 균주의 프로테옴 발현 변화 양상을 관찰한 결과, pH 4~7 범위에서 약 18개의 프로테옴 스팟 (spots)의 증감이 관찰되었다 (Fig. 5).

확인된 프로테옴 스팟의 동정은 MALDI-TOF에 의한 pep- tide fingerprinting을 이용하여 동정되었으며, 그 분석 결과는 Table 1에 요약되었다. 이들 프로테옴은 세포에서 다양한 기 능을 수행하는 단백질임이 확인되었다. 특히 Chaperon (DnaK,

Fig. 3. Scanning electron micrographs of hemolytic Aeromonas sp. MH-8. (A) untreated cells, (B) cells treated with 3 mg/mL EGCG for 90 min, and (C) cells treated with 3 mg/mL EGCG for 180 min.

GroEL, trigger factor)의 증가가 확인되었는데, 이들 단백질은 세포가 온도, pH, NaCl, 독성 화학물질 등 다양한 형태의 스트

레스에 대한 반응기작으로 신속히 유도 및 합성되어 손상된 단백질의 구조를 정상적으로 회복시키는 기능을 한다 [23,

Fig. 5. Two-dimensional gel electrophoresis pattern of total hemolytic Aeromonas sp. MH-8 proteins in Luria-Bertani broth without broth EGCG (A) or in the presence of 3 mg/mL EGCG for 2 h (B). The number associated with MALDI-TOF/MS identified spots is listed in Table 1.

24]. 본 연구의 결과, EGCG 노출에 의해 증가된 이들 단백질 은 외부 화학물질에 대하여 세포를 방어하거나 생존을 돕는 데 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.

EGCG 노출을 통해서 나타난 또 다른 중요한 발견은 장독 소 (enterotoxin) 및 물질대사에 관여하는 aerolysin (AerA), phospholipase C precursor 등의 프로테옴의 감소이다. AerA 는 Aeromonas에서 관찰되는 독특한 독소로 알려져 있는데, Howard 등 [25]은 Aeromonas로 인한 설사 및 상처 감염에 있 어서 주요 독소라는 것을 보고하였다. 또한 본 연구에 확인된 phospholipase C precursor는 Aeromonas 뿐만 아니라, 용혈성 을 지닌 E. coli O157, B. cereus 등에서도 발견되며 용혈현상 (hemolysis)에 관여하는 주독소라고 보고된 바 있다 [26,27].

Flores 등 [28]은 Clostridium perfringens에 의해 발병되는 가 스괴저 (gas gangrene)에 phospholipase C precursor가 필요한 독성요소로 작용하는 것을 보고하였다. EGCG에 의해 본 독 소들이 억제되는 기작에 대한 연구 결과는 아직 보고된 바 없 다. 따라서 EGCG에 의해 Aeromonas에서 생성되는 독소의 발현이 억제되는 것이 관찰된 것은 흥미로운 내용이며, 향후 EGCG에 의한 독소억제 기작을 밝히는 연구가 수행되어야 할 것이다.

또한 세포 외막인 LPS 합성에 관여하는 프로테옴들이 증가 하는 것으로 확인되었다. 특히 lipopolysaccharide biosynthesis protein (RfbH) 은 LPS의 핵심 다당류 합성에 관여하는 단백 질로 알려져 있다. 따라서 EGCG 노출에 의해 분리세균에서

LPS 합성에 관여하는 단백질의 증가는 LPS를 생합성하여 세 포막의 안정화를 돕고, 외부 유해 물질의 유입을 막아 세포를 보호하는 장벽역할을 할 수 있도록 발현이 증가한 것으로 사 료된다.

Aeromonas는 담수, 오염된물, 양식장, 어패류 등에서 주로 발견되며, 특히 Aeromonas로 인한 식중독은 그 기작이 알려 지지 않아 국민건강에 큰 위협이 되고 있다. 또한 양식업에서 Aeromonas 감염 인한 어패류의 대량폐사 발생으로 심각한 경 제적 손실을 일으킬 수 있기 때문에, 이를 해결하기 위한 대 안이 필요한 상황이다. 따라서 이를 극복하기 위한 몇 가지 대안이 제기되고 있으나, 화학물질이나 항생제 등의 사용은 환경오염 및 생물농축 등의 우려가 제기되고 있다. 이를 해결 하기 위하여 최근 천연물이 다양한 기능적 측면에 대하여 관 심을 받게 되었으며, EGCG가 이를 위한 새로운 대체물질로 서 제시되고 있다.

녹차 및 녹차추출물을 다양한 분야에서 이용하려는 노력이 많이 이루어지고 있으나, 식중독 및 병원성 원인 세균 등을 제어하거나 산업적으로 응용하려는 연구는 여전히 미진한 편 이다. 따라서 본 연구에서는 용혈활성을 가진 Aeromonas에 대한 녹차 카테킨인 ECGC 노출에 따른 다양한 특성조사를 실시하였다. 향후 이들 결과를 바탕으로 Aeromonas의 식중 독 기작과 EGCG에 의해 억제되는 독성 단백질의 저해 기작 을 규명하는 방향으로 연구가 진행되어야 할 것이다.

Table 1. Proteins identified by MALDI-TOF/MS fingerprinting

Spot No. Identified protein Accession Sequence

coverage (%)

Fold change Chaperone

1 Chaperone protein, DnaK WP_043125071 47 ↑

2 Chaperone protein, GroEL EZH83780 52 ↑

3 Trigger factor WP_060389204 32 ↑

Enterotoxins

4 Aerolysin, AerA WP_060390531 69 ↓

5 Phospholipase C precursor AGM42437 29 ↓

Energy metabolism, pathway factors

6 2,3-Bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase WP_026080439 38 ↓

7 Histidine kinase WP_025202170 71 ↓

8 Polyamine ABC transporter substrate-binding protein, PotA WP_043850629 38 ↓

Cell envelope

9 Lipopolysaccharide biosynthesis protein, RfbH KHA55667 46 ↑

10 Outer membrane protein A precursor ADA57643 49 ↑

11 Signal transduction protein ALQ62075 55 ↑

Biosynthesis

12 30S ribosomal protein S1 KWR68570 92 ↓

13 NAD⁺ synthase WP_060390400 42 ↓

14 Sulfatase WP_011704465 54 ↓

15 Methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase AJQ54388 52 ↑

16 Thioredoxin ALQ64408 36 ↓

DNA, RNA metabolism

17 DNA polymerase WP_043168615 48 ↓

18 DNA-directed RNA polymerase subunit omega EZH80716 70 ↓

4. CONCLUSION

본 연구는 녹차 카테킨인 epigallocatechin gallate (EGCG)에 노출된 용혈성 Aeromonas sp. MH-8의 특성을 조사하기 위하 여 실시하였다. 먼저 용혈성의 Aeromonas sp. MH-8을 상한 물고기로부터 농화, 분리하였다. 1~4 mg/mL 범위의 EGCG 에 노출된 MH-8 균주의 생존율을 조사하였으며, EGCG에 노 출된 분리세균은 3 mg/mL 이상의 농도에서 3시간 이내에 완 전히 살균되었다. EGCG의 노출 농도와 시간에 따라 분리세 균 MH-8의 LPS의 양적변화를 SDS-PAGE와 silver staining을 통하여 관찰하였으며, EGCG에 노출된 세균의 LPS는 EGCG 에 노출되지 않은 세균의 LPS (대조군)보다 상대적으로 그 양이 증가하였으나, 일정농도 이상의 EGCG에 노출된 분리 세균의 LPS는 현저히 감소하거나 사라지는 것이 관찰되었다.

EGCG의 세포독성 효과에 저항성을 증진시키는데 기여하는 스트레스 충격단백질 (70-kDa DnaK and 60-kDa GroEL)이 MH-8의 세포 배양에 다양한 농도의 EGCG에 노출됨으로서 유도되었다. 주사전자현미경을 이용하여 EGCG에 노출시킨 세균의 외부 형태를 분석한 결과, 움푹 패이고 불규칙적인 형 태가 관찰되었다. EGCG에 노출된 MH-8 배양의 수용성 단백 질 부분에 대한 2-DE에서 18개의 단백질 스팟이 EGCG 노출 에 의해 크게 변화하는 것이 확인되었다. Chaperon (예, DnaK, GroEL), 장독소 (예, aerolysin, phospholipase C precursor), LPS 합성 (예, LPS biosynthesis protein, outer membrane protein A precursor), 생합성 및 에너지 대사 등에 수반되는 이들 단백 질은 MALDI-TOF를 사용한 peptide mass fingerprinting에 의 해 동정되었다. 결론적으로 EGCG는 식중독 원인세균인 Aero- monas sp. MH-8 에 대하여 상당한 항세균 효과를 가지는 것으 로 밝혀졌다. 또한 얻어진 결과들은 Aeromonas sp. MH-8 대 한 EGCG-유도 스트레스와 세포독성의 기작을 이해하는데 중요한 단서를 제공하게 될 것이다.

Acknowledgements

본 연구는 순천향대학교 학술연구비지원사업의 일부 지원으 로 수행되었습니다.

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