100
서 론
종양 발생에 있어서 세포의 증식이나 사멸은 세포의 항 상성을 유지하는 데 매우 중요하다. 이들은 세포 주기의 진 행과 매우 밀접한 관계를 가지고 있으며, 세포 주기 조절에 관련된 cyclin, cyclin dependent kinase (CDK) 및 CDK 억제 인자의 발견과 이들에 대한 활발한 연구가 분자생물학적 기전을 이해하는 데에 크게 기여하였다. 더구나 여러 종양 억제 유전자들이 이들 세포주기 조절인자들과 밀접한 관계 가 있고, 세포의 분열과 분화, 그리고 암의 발생과 연관이 있다는 것이 알려지면서 세포주기 조절기전에 대한 연구의 중요성이 강조되고 있다.
세포주기 조절에서 9번 염색체 9p21에 위치하는 INK4a/
ARF 유전자 자리는 p16INK4a와 p14ARF, 이 두 가지 세포조절 단백질을 암호화한다. p14ARF는 체내외 실험에서 강력한 암 억제 유전자로 규명되어 있고, p16INK4a도 암억제 유전자로 널리 알려져 있는데 이 두 가지는 p16INK4a-CDK4/6-pRb와 p14ARF-MDM2-p53의 두 경로를 이루고 있으며 이는 암의 생 성이나 진행에 중요한 역할을 한다.(1) 이 두 가지 경로 중 p14ARF-MDM2-p53 경로는 H. Pylori에 의해 손상된 위세포 의 사멸(apoptosis)을 억제하고, 췌장암, 방광암, 식도암 등의
위암에서의 p14ARF, p16INK4a, p53, pRb 단백 발현
가톨릭대학교 의과대학 외과학교실
채병주․송교영․김진조․진형민․김 욱․박조현․전해명․박승만․임근우․김응국․김승남
Expression of p14
ARF, p16
INK4a, p53, pRb in Gastric Cancer
Byung Joo Chae, M.D., Gyo Young Song, M.D., Jin Jo Kim, M.D., Hyung Min Chin, M.D., Wook Kim, M.D., Cho Hyun Park, M.D., Hae Myung Jeon, M.D., Seung Man Park, M.D., Keun Woo Lim, M.D., Eung Kook Kim, M.D.
and Seung Nam Kim, M.D.
Purpose: In this study, the level of expression of p14ARF, p16INK4a, p53 and pRb was immunohistochemically examined according to the stage of gastric cancer, lymph node metastasis, cell differentiation and Lauren's classification.
The effect on survival rate and the associations between the components were examined as well.
Methods: One hundred and fourteen patients who un- derwent surgery for gastric cancer were studied retro- spectively using their paraffin embedded tissue and medical records. Using antibodies of p14ARF, p16INK4a, p53 and pRb, immunohistochemical stain was applied and their level of expression examined.
Results: The level of p53 expression was high when the stage of gastric cancer was more progressed, the in- vasiveness higher, lymph node metastasis present and cell differentiation poorer. In contrast, the level of p14ARF ex- pression tended to be lower as the stage was more progressed, but this was not statistically significant. Ex- pression of p16 and pRb did not show any association with stage or other pathologic findings. Expression of p53 and p14ARF also had a significant association with survival rate.
Survival rate was lower in patients who expressed p53 than in those who did not, but it was higher in who expressed p14ARF than in those who did not. When these two were combined, patients with p14ARF(+)/p53(-) had the highest survival rate, whereas those with p14ARF(-)/
p53(+)had the lowest. This demonstrated that the ex- pressions of p14ART and p53 have value as prognostic indicators.
Conclusion: From these results, p53 seems closely related to stage and other pathologic findings. Furthermore, p14ARF and p53 showed a statistically significant relationship with survival rate, making them valuable as prognostic indicators after surgery. In combination, it would be possible to predict a more accurate prognosis. (J Korean Surg Soc 2004;
67:100-105)
Key Words: Gastric cancer, Immunohistochemical staining, p14ARF, p53, p16INK4a, pRb
중심 단어: 위암, 면역화학염색, p14ARF, p53, p16INK4a, pRb ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Department of Surgery, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea
책임저자：전해명, 서울시 영등포구 여의도동 62번지 ꂕ 150-713, 가톨릭대학교 의과대학 외과학교실 Tel: 02-3779-1175, Fax: 02-786-0802
E-mail: [email protected]
접수일：2004년 3월 22일, 게재승인일：2004년 5월 27일 본 논문은 가톨릭 의과대학 부속 성모병원 임상의학 연구비 지원 에 의하여 연구되었음.
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 발생과정에 기여하는 것으로 알려져 있으며,(2) p16INK4a-
CDK4/6-pRb경로의 이상은 사람에 발생하는 여러 양성, 악 성 종양의 발생을 유발시킬 수 있고 폐암의 발생과도 연관 이 있는데 특히 비소세포성 폐암에서의 연구 결과에서는 pRb의 불활성화가 p16INK4a의 결손과 역상관 관계를 가진다 는 보고가 있다.(3) 위암에서도 p53, pRb 등에 관한 많은 연 구가 있었고, 최근에는 p16INK4a에 대해서도 활발한 연구가 이루어지고 있지만, p14ARF의 발현과 위암의 관계에 대한 연구는 거의 보고되고 있지 않으며 위암에서의 p16INK4a- CDK4/6-pRb 경로와 p14ARF-MDM2-p53의 경로에 초점을 둔 연구 결과도 거의 없는 실정이다.
저자들은 위암에서의 p14ARF, p16INK4a, p53, pRb에 대한 면 역조직화학적 방법을 사용하여 위암의 병기, 림프절 전이 유무 및 세포 분화도, Lauren 분류 등에 따른 발현도를 조사 하고, 생존율과 각각의 발현도와의 관계, 더 나아가 각 인자 간의 상호 연관성 등을 분석하여 보고하는 바이다.
방 법
1) 대상
가톨릭대학교 의과대학 부속병원에서 1993년부터 1997 년까지 위선암종으로 진단 받고 위절제술을 시행한 환자의 파라핀 포매 위암종 조직 중에서 보관상태가 양호하고 추 적검사가 잘 이루어진 114예를 연구 대상으로 하였다. 위암 의 병기, 침윤도, 림프절 전이 여부, 세포의 분화도, Lauren 분류 및 생존 기간을 조사하였고, 대조군으로는 정상 위조 직을 이용하였다. 위암의 병기는 International Union Against Cancer (UICC, 1997)에 기준하여 분류하였다.
2) 면역조직화학 염색 검사(Immunohistochemical staining) 10% 포르말린 액에 고정한 후 파라핀에 포매한 종양 조 직을 사용하여 통상적인 면역조직화학 염색을 시행하였다.
일차 항체는 p14ARF (NeoMarkers Fremont, CA, USA), p16INK4a (Dakocytomation Denmark A/S), p53 (Dakocytomation
Fig. 1. Immunohistochemical staining of p14ARF (A), p16INK4a (B), p53 (C), pRb (D).
A
C
B
D
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Denmark A/S), pRb (NeoMarkers Fremont, CA, USA)를 사용
하였다.
파라핀 포매 조직으로부터 5μm 두께의 조직 절편을 제작 하여 규소로 처리된 슬라이드(prove on+slideⓇ Fisher Scientific Co., Pittsburgh, PA, USA) 위에서 시행하였다. Histo- clear (National diagnostics, Georgia, Atlanta)와 xylene의 3：1 혼합액에서 5분씩 4회 반복 접촉하여 파라핀을 제거하고, 무수알코올에서 15초간 2회, 75% 알코올로 세척하여, 잔여 xylene을 제거하고 함수시켰다. 특이 항원의 노출을 돕기 위하여 citrate buffer solution으로 121oC에서 15분간 가압 멸 균기(autoclave)를 실시한 다음 실온으로 식힌 후 Dulbecco's phosphate buffered saline으로 3회 세척하였다. 이후 비특이 반응을 억제하기 위하여 blocking solution (histostain sp for AEC, Zymed Co., South San Francisco, USA)으로 2분 처리한 후, 1：100, 1：50, 1：75로 각각 희석한 일차 항체를 40oC 에서 20분간 결합시킨 다음 수 회 세척 후 biotinylated anti- mouse immunoglobulin (histostain sp for AEC, Zymed Co.,
South San Francisco, USA)으로 40oC에서 7분간 처리하고, 수회 세척 후 avidin-alkaline phosphatase로 40oC에서 7분간 반응시킨 후 적색의 색소원(chromogen)으로 40oC에서 2∼5 분간 발색시켜서 세척 후 hematoxylin으로 20초간 대조 염색 을 시행하고, 세척하여 광학 현미경으로 관찰 판독하였다.
3) 염색의 평가
염색 후 단백 발현에 대한 양성 판정은 p14ARF, p16INK4a, p53, pRb 모두 먼저 종양 조직 전반에 걸쳐 확실한 핵염색 이 관찰되는지를 기준으로 하여, 400배율 시야에서 10% 미 만의 핵염색이 관찰되면 0점, 10∼25% 1점, 25∼50% 2점, 50% 이상을 3점으로 매겨 2점 이상을 양성으로 0∼1점을 음성으로 판정하였다. 전체 종양 세포에서 핵염색이 되지 않거나 세포질에서만 발현되는 경우는 모두 음성으로 간주 하였다. 판독은 두 명의 독립된 관찰자가 조직을 관찰하여 일치되는 결과를 채택하였고, 결과가 일치되지 않을 경우 그 평균치를 점수로 환산하였다(Fig. 1).
Table 1. Expression of p14ARF, p16INK4a, p53, pRb according to the pathologic stage, depth of invasion, lymph node metastasis, cell differentiation and Lauren's classification
ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ
Total p14 (+) p16 (+) p53 (+) pRb (+)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Stage
I 31 7 (22.5%) 8 (25.8%) 3 (9.7%) 8 (25.8%)
II 38 10 (26.3%) 3 (7.8%) 7 (18.4%) 7 (18.4%)
III 33 6 (18.2%) 8 (24.2%) 13 (39.4%) 9 (27.3%)
IV 12 2 (16.7%) 2 (16.6%) 9 (75%) 5 (41.7%)
P-value 0.8227 0.2344 0.006 0.4553
Depth of invasion
T1-T2 60 16 (26.7%) 11 (18.3%) 8 (13.3%) 12 (20%)
T3-T4 54 9 (16.7%) 10 (18.5%) 24 (44.4%) 17 (31.5%)
P-value 0.2010 0.9797 0.0004 0.1627
LNs metastasis
N0 62 16 (25.8%) 9 (14.5%) 9 (14.5%) 14 (22.6%)
N1-N3 52 9 (17.3%) 12 (23.1%) 23 (44.2%) 15 (28.9%)
P-value 0.2775 0.2437 0.0007 0.4451
Cell differentiation
Well 25 4 (16.0%) 3 (12.0%) 1 (4.0%) 10 (40.0%)
Moderate 25 5 (20.0%) 5 (20.0%) 1 (4.0%) 3 (12.0%)
Poor 64 16 (25.0%) 13 (20.3%) 30 (41.8%) 16 (25.0%)
P-value 0.6348 0 .6509 0.0003 0.0892
Lauren's classification
Diffuse 29 5 (17.2%) 7 (24.1%) 9 (31.0%) 8 (27.6%)
Intestinal 85 33 (38.8%) 14 (16.5%) 23 (27.0%) 21 (24.7%)
P-value 0.0188 0.3605 0.6810 0.7586
Sex
Male 72
Female 42
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
Total 114 25 (21.9%) 21 (18.4%) 32 (28.1%) 29 (25.4%)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
4) 통계적 분석
p14ARF, p16INK4a, p53, pRb의 발현 유무와 병기, 침윤도, 림 프절 전이 유무, 세포 분화도, Lauren분류의 관련성을 chi- square 검정법 혹은 Fisher 정밀 검정법을 이용하였고, 각 단 백 발현강도 간의 상호 관련성도 chi-square를 이용하였다.
생존율의 차이는 로그 순위 검정법(log-rank test)을 이용해 유의성을 검증하였고, P값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 통계처리는 가톨릭대학 교 의과대학 통계학교실에 의뢰하였다.
결 과
1) 일반적 특징
대상 환자 114명 중 남자는 72명, 여자는 42명이었고, 평균 연령은 57.6세였다. 병기별로는 I기가 31명(27.2%), II기가 38명(33.3%), III기가 33명(28.9%), IV기가 12명(10.5%)이었 다. 침윤도별로는 T1-2가 60명(52.6%), T3-4가 54명(47.4%) 이었으며 림프절 전이가 62명(54.4%)에서 있었고 52명 (45.6%)에서는 없었다. 분화도 별로는 고분화암이 25명 (21.9%), 중분화암이 25명(21.9%), 저분화암이 64명(56.2%) 이었으며, Lauren분류별로는 미만형이 29명(25.4%), 장형이
85명(74.5%)이었다(Table 1).
2) p14ARF, p16INK4a, p53, pRb의 발현
p14ARF, p16INK4a, p53, 및 pRb의 면역 화학 염색에서 병기, 침윤도, 림프절 전이유무, 세포 분화도, Lauren분류에 따른 발현 결과를 도표에 정리하였다(Table 1). 전체적으로 p14ARF의 양성발현율은 21.9%, p16INK4a의 양성발현율은 18.4%이었으며, p53은 28.1%, pRb는 25.4%의 양성발현율을 보였다. p53의 경우 병기가 진행할수록 발현율이 통계학적 으로 유의하게(P=0.006) 증가하였고, 침윤도가 높을수록 (P=0.0004), 림프절 전이가 있을 때(P=0.0007), 분화도가 좋 지 않을수록(P=0.0003) 발현율이 유의하게 증가하였다.
p14ARF의 경우 병기가 낮을수록 침윤도가 적을수록 발현율 이 높았으나 통계학적 유의성은 없었고, 미만형보다는 장 형에서 통계학적으로 유의하게 발현도가 높았다(P=0.0188).
p14ARF와 p16INK4a의 발현간의 상호 관계를 발현강도에 따라 비교한 결과 통계학적으로 유의한 상관관계가 있었다
Table 2. The relationship between p14ARF and p16INK4a expression ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ
p14 (-) p14 (+) p14 (++) p14 (+++) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
p16 (-) 18 10 8 2
p16 (+) 20 27 4 4
p16 (++) 0 8 0 4
p16 (+++) 4 2 2 1 P=0.0013
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
Fig. 2. Survival curve according to the expression of p14ARF.
Fig. 3. Survival curve according to the expression of p53.
Fig. 4. Survival curve according to the expression of p53 and/or p14ARF.
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ (Table 2) (P=0.0029). 한편 p16INK와 pRb는 병기, 침윤도, 림
프절 전이 유무, 분화도와 통계학적으로 유의한 상관 관계 는 보이지 않았다.
3) 생존율과의 관계
병기에 따른 생존율을 Kaplan-Meier법으로 분석해 본 결 과 병기가 높을수록 유의하게 생존율이 감소하였다(P＜
0.0001). p14ARF가 음성일수록 유의하게 생존율이 감소하였 으며(P=0.0230)(Fig. 2), p53은 양성일수록 생존율이 유의하 게 감소하였다(P＜0.001)(Fig. 3). 하지만, p16INK4a과 pRb의 발현 유무는 생존율과 유의한 연관성이 없었다(P＜0.9663, P＜0.7963). 발현 양성률과 생존율에 의미 있는 상관관계를 보인 p14ARF와 p53을 조합하여 생존율과의 관계를 조사해 본 바, p14ARF가 음성이고 p53이 양성일 때에 생존율이 가장 낮았고, p14ARF양성이고 p53음성일 때에 생존율이 가장 높 았다(P＜0.001)(Fig. 4).
고 찰
세포의 증식이나 사멸은 항상성을 유지하는 데 매우 중 요하며 이러한 항상성은 세포주기의 진행과 매우 밀접한 관계를 가지고 있다. G1기, S기, G2기, M기로 구성된 세포 주기는 각 단계를 넘어갈 때마다 제한 검사점(restriction check point)이라는 것이 존재하는데 이러한 검사점은 cyclin 과 CDK (cyclin dependent kinase)에 의해 조절되고 그중에서 도 G1 후기의 검사점은 세포의 또 다른 DNA 가닥을 복제 하는 S기의 바로 전 단계이므로 종양의 발생과 가장 밀접한 관계를 갖는 부분이다. 이 G1 후기의 검사점은 cyclin, CDK, CDKIs (cyclin dependent kinase inhibitor) 등의 복잡한 연계 망에 의해 조절되는데 CDKIs는 그 구조적 그리고 기능적 특징에 따라 크게 p14/ARF, p15/INKβ, p16/INKα, p18/INKν, p19/INKδ의 INK4 가계와 p27/Kip1, p57/Kip2 등의 p21Waf1 가계 두 그룹으로 분류된다. 이 중에서 9번 염색체 9p21 의 CDKN locus로부터 암호화(encode)되는 p14ARF와 p16은 p16INK4a-CDK4/6-pRb와 p14ARF-MDM2-p53의 암억제 경로를 이루는데 이 경로의 변이나, 억제, 결손 등의 변화로 인한 불활성화는 여러 종양의 발생에 중요한 원인이 된다는 보 고가 있다.(4-6)
Quelle 등(7)은 이 INK4/ARF locus는 서로 다른 조절 단백 질인 p14ARF와 p16INK4a을 암호화(encode)하는 과정에서 첫 번째 exon은 분리되어 전사되고, 두 번째 세 번째 exon은 서로 공유되지만 서로 다른 reading frame을 가져 두 단백질 사이에 amino acid 서열이 전혀 다르게 되는 특이한 유전자 라고 보고하였다. p14ARF와 p16INK4a의 작용경로를 비교해 보면, p16INK4a은 CDK4와 6을 억제함으로써, pRb의 phos- phorylation을 저하시키고, 따라서 G1기를 정지시키는 조절 기능을 하게 되며 이는 Sherr(8)가 pRb결손인 세포에서는
p16INK4a으로 인한 세포주기의 정지가 일어나지 않는다는
사실을 증명함으로써 밝혀졌다. 반면에 p14ARF는 5kDa 이하 의 크기를 가지며, 직접적으로 CDK를 억제하지는 않고, p53을 불안정화시키는 MDM2의 기능을 억제하여 세포 주 기를 정지시키는데, Quelle 등(7)은 p14ARF가 G1기뿐만 아니 라 G2기까지도 정지시킨다고 보고한 바 있다. 또한 p14ARF 는 MDM2뿐만 아니라 E2F도 억제하는 기능이 있어 p53-/MDM2-인 세포에서도 세포주기를 억제할 수 있다. 즉, p14ARF는 p53의존 경로와 비의존 경로를 동시에 가지고 있 다고 할 수 있다. 이러한 p14ARF의 불활성화는 두경부암, T 세포 급성 림프구성 백혈병, 유방암 등 많은 악성종양의 발 생과 연관이 있다.
그동안의 연구 결과들을 살펴보면 두 암억제 경로의 최 종을 담당하는 p53과 pRb에 대한 연구가 활발하게 이루어 져 왔으며, 최근에는 p16INK4a과 위암의 관계에 대해서도 많 은 보고가 있었다.(9,10) Toshiro 등(11)은 p53의 과발현이 위 암의 병기, 침윤도, 림프절 전이와 유의한 연관성이 있고, 과발현 그룹이 그렇지 않은 그룹에 비해 생존율이 유의하 게 낮아 예후인자로의 가치가 있다고 보고하였으며, Ogawa 등(12)은 pRb가 병기, 림프절 전이, 원격 전이 유무와 통계 적으로 유의한 연관성을 보이지는 않았지만, pRb 양성발현 위암의 예후가 음성인 그룹에 비해 좋기 때문에 예후인자 로서의 의미를 가질 수 있다고 보고하였다. 또한 Xiu-Sheng 등(13)은 p16INK4a의 양성률은 위암보다 암전구 병변에서 높 았고, 초기암일수록 높아 예후에 영향을 줄 수 있다고 보고 하였다. 한편 위암에서의 p14ARF에 관한 연구는 거의 없지 만, Satoru 등(14)이 위암에서 p14ARF의 불활성화는 p53 변이 와 역상관 관계에 있지 않으며, 이는 p14ARF의 불활성화는 p53 변이에 의한 p53경로의 붕괴와 기능적으로 동등하지 않기 때문일 것이라고 보고한 바 있다.
본 연구 결과를 분석해 보면, 그동안에 알려진 사실처럼 p53의 양성발현율이 병기가 높을수록, 침윤도가 높을수록, 림프절 전이가 있을 때, 세포분화가 좋지 않을수록 높게 나 타났으며, 또한 생존율에서도 p53 음성 그룹보다 유의하게 생존율이 낮았다. 따라서, 위암에서 p53의 발현 유무는 예 후인자로서의 가치가 있다고 판단되며, p14ARF는 병기가 낮 을수록 양성률이 증가하는 경향을 보였지만, 통계학적 유 의성은 없었다. 이는 Satoru 등(14)의 연구 결과처럼 p14ARF 가 p53경로에만 의존되지 않는다는 사실과 부합한다고 할 수 있다. 생존율에서는 p14ARF 발현 양성 그룹이 음성 그룹 보다 유의하게 높다는 사실이 본 연구에서 새롭게 발견되 었다. 이로써 p14ARF-MDM2-p53경로의 최종단계인 p53뿐만 아니라 그 시작점인 p14ARF도 p53과 무관하게 예후와 연관 성을 보인다고 말할 수 있으며, p14ARF/p53 조합의 생존율 곡선에서는 p14ARF(-)/p53(+) 그룹이 예후가 가장 좋지 않 았고, p14ARF(+)/p53(-)의 생존율이 가장 높다는 사실이 통 계적으로 유의하게 검증되었다. 따라서, p14ARF와 p53의 면
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 역조직화학 염색을 조합해서 시행할 경우 위암의 예후판단
에 더 많은 도움이 될 것이라고 판단된다.
p16INK4a과 pRb에 대해 본 연구에서는 두 단백질의 발현여 부가 병기 또는 생존율과 유의한 관계가 없었다. 또한 서로 같은 암억제 경로에 속해 있는 p14ARF와 p53의 조합 및
p16INK4a과 pRb의 조합과 병리학적 소견, 생존율과의 관련성
여부 및 상호 발현의 연관성도 조사해 보았으나 모두 통계 적 유의성은 보이지 않았다.
하지만, p14ARF와 p16INK4a의 발현이 그 강도별로 유의한 연관성이 있음으로 밝혀져 그동안에 알려진 사실처럼 같은 유전자의 locus에서 암호화(encode)된다는 사실을 뒷받침한 다고 할 수 있다.
결 론
위암에서 p53의 양성 발현은 병기와 유의한 관계가 있었 고, 병기가 진행할수록 그 양성 발현이 높아진다는 사실을 알 수 있었고, p53뿐만 아니라 p14ARF의 양성 발현 또한 생 존율에 유의한 영향을 미쳐 p53은 불량 예후인자로, p14ARF 는 우량 예후인자로의 가치가 있음을 알 수 있다. 또한, p14ARF의 발현 유무와 p53의 발현 유무를 조합해 본다면, 더 욱 신뢰도 높은 예후인자가 될 것이라고 생각한다.
아울러 본 p14ARF-MDM2-p53경로가 16INK4a-CDK4/6-pRb 경로보다 위암 발생 및 예후에 더 큰 역할을 한다는 가설을 제기할 수 있겠다.
REFERENCES
1) Tannapfel A, Sommerer F, Benicle M, Weinans L, Katalinic A, Geissler F, et al. Genetic and epigenetic alterations of the INK4a-ARF pathway in cholagiocarcinoma. J Pathol 2002;
197:624-31.
2) Mason SL, Loughran O, La Technique NB. p14ARF regulates E2F activity. Oncogene 2002:21:4220-30.
3) Enders GH, Koh J, Missero C, Rustgi AK, Harlow E. p16 inhibition of transformed and primary squamous epithelial
cells. Oncology 1996;12:1239-45.
4) Smeds J, Berggen P, Ma X, Xu Z, Hemmink K, Kumar R.
Genetic status of cell cycle regulatiors in squamous cell carcinoma of the oesophagus: the CDKN2A (p16INK4a and p14ARF) and p53 genes are major targets for inactivation.
Carcinogenesis 2002;23:645-55.
5) Mathew R, Arora S, Khanna R, Mathur M, Shukla NK, Ral- han R. Alterations in p53 and pRb pathways and their progno- stic siginificance in oesophageal cancer. Eur J Cancer 2002;38:
832-41.
6) Weber H Olover, Samuel T, Rauch P, Funk JO. Human p14/ARF-mediated cell cycle arrest strictly depends on intact p53 signaling pathway. Oncogene 2002;21:3207-12.
7) Quelle DE, Zindy F, Ashmun RA, Sherr CJ. Alternative reading frames of the INK4a tumor suppressor gene encode two unrelated proteins capable of inducing cell cycle arrest.
Cell 1995;83:993-1000.
8) Sherr CJ. Cancer cell cycles. Science 1995;274:1672-7.
9) Park CW, Lee DH, Kim JY, Seo SB, Joo HJ, Kim KH. The relationship of methylation of p16 oncogene and clinical fea- ture of gastric cancer. J Korean Gastroenterol 2002;39:402-8.
10) Tsujie M, Yamamoto H, Tomita N, Sugita Y. Expression of tumor suppressor gene p16INK4 products in primary gastric cancer. Oncology 2000;58:126-36.
11) Okuyama T, Maehara Y, Kabashima A, Takahashi I, Kakeji Y, Sugimachi K. Combined evaluation of expression of p53 and p21 proteins as prognostic factors for patients with gastric carcinoma. Oncology 2002;63:353-61.
12) Ogawa M, Maeda K, Chung YS, Onoda N, Kato Y, Nakata B, et al. Correlation between expression of rb protein and prognosis of gastric cancer. gan to kagaku ryoho 1996;23(2):
148-50.
13) He XS, Su Q, Chen ZC, He XT, Long ZF, Ling H. Expression, deletion and mutation of p16 gene in human gastric cancer.
World J Gastroenterol 2001;7:515-21.
14) Iida S, Akiyama Y, Nakajima T, Ichikawa W, Nihei Z, Sugihara K, et al. Alteration and hypermethylation of the p14/ARF gene in gastric cancer. Int J Cancer 2002;7:654-8.
