대한소화기학회지 1999;33:67 - 77
1)
접수: 1998년 4월 9일, 승인: 1998년 7월 16일
연락처: 김연수, 140-743, 서울시 용산구 한남동 657번지, 순천향의대부속병원 내과학교실, 소화기연구소 Tel: (02) 709-9863, Fax: (02) 749-1968
※ 본 논문의 요지는 1997년 제 49 차 대한내과학회 추계학술대회에서 발표되었음.
만성 B형 간질환에서 Hepatitis B Virus Core 유전자의 Missense 변이
순천향대학교 의과대학 내과학교실, 소화기연구소
김연수・김영석・조영덕・김진오・조주영 김홍수・이준성・이문성・황성규・심찬섭
Mi s s e n s e Mu t a t i o n s o f H e p a t i t i s B Vi r u s Co re G e n e i n Ch r o n i c H e p a t i t i s B Vi r u s Ca r r i e r s
Yu n S o o Ki m , M.D., Yo u n g S e o k Ki m , M.D., Yo u n g D e o k Ch o , M.D., J i n Oh Ki m , M.D., J o o Yo u n g Ch o , M.D., H o n g S o o Ki m , M.D.,
J o o n S e o n g L e e , M .D ., M o o n S u n g L e e , M .D ., Se on g Gyu Hw a ng , M.D. a nd Ch an Su p Sh im , M.D.
Institute for Digestive Research, College of Medicine, Soon Chun Hyang University, Seoul, Korea
Background/Aims: Missense mutations of HBV (hepatitis B virus) core gene have been reported to
occur frequently in the immune clearance phase of chronic HBV infection. The present study was carried out to identify whether the number of missense mutation might be related to the disease progression, presence of HBeAg or precore stop codon and to determine the locations where the missense mutations are concentrated. Methods: This study involved 41 patients with HBeAg and 10 HBeAg-negative patients whose serum ALT (alanine aminotransferase) were elevated. The 41 patients with HBeAg were consisted of 15 patients with asyptomatic HBV carriers (ASC), 14 patients with chronic hepatitis (CH) and 12 patients with liver cirrhosis (LC). The core gene sequences from al 51 patients were analysed by PCR-direct sequencing method. Results: Mean numbers(M±SD) of amino acid changes/patient were as follows; 0.2±0.4 in ASC, 2.0±1.4 in CH, 2.2±1.6 in LC and 4.5±2.3 in HBeAg-negative patients. In the cases with chronic liver diseases, mean numbers of amino acid changes/patient were 4.0±2.5 in the cases with precore stop codon and 2.0±1.1 in the cases without it (p=0.002). Missense mutations were most frequently found in codon 80-100 and 130-135 where 34 and 26 amino acid changes were observed, respectively. Conclusions: It is likely that the number of missense mutation in the core gene is more closely related to the presence of HBeAg o precore stop codon than the progression of liver diseases. (Kor J Gastroenterol 1999;33:67 - 77)Key Words: HBV core gene, Missense mutation, Chronic HBV carriers, HBeAg, Precore stop codon
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서 론
B형 간염 바이러스(hepatitis B virus; 이하 HBV) 감염시 체내에서는 바이러스를 제거하기 위해 바이 러스 항원에 대한 면역반응이 나타난다. 대부분의 급성 간염 환자에서는 바이러스의 여러 항원에 대한 (polyclonal) 다특이적(multispecific)인 세포 면역반 응이 왕성하게 일어나 바이러스가 제거된다고 알려 져 있다.1,2 반면 만성 HBV 보유자에서는 급성 악화 기를 제외하고는3 면역반응이 약하거나 제한적으로 일어나기 때문에 바이러스 혈증이 지속된다고 보고 되고 있다.1,2
세포 독성 T세포(cytotoxic T lymphocyte; 이하 CTL)를 비롯한 T세포 면역반응은 만성 B형 간질환 의 병인과 깊은 관련이 있다고 보고되고 있는데, 바 이러스 항원은 항원 결정기(epitope)를 통해 CTL에 인식되며 HBV의 core를 비롯한 envelope, polymer- ase 단백 등에 CTL 항원 결정기가 존재한다고 알려 져 있다.1 CTL 항원 결정기는 8개 정도의 아미노산 으로 구성된 peptide로 HLA 분자와 결합되어 감염 된 간세포 표면에 표현된다.4 따라서 아미노산 서열 변화가 동반되는 core 유전자의 missense 변이는 core 단백의 항원성 변화를 초래하여 간질환 활동도 에 영향을 미칠 수 있으리라 추측되고 있다.
Core 유전자의 missense 변이형은 면역 압력을 받 지 않는 면역 관용기(immune tolerance phase)보다는 간내 염증 반응이 활발한 면역 제거기(immune clea- rance phase)에 흔히 관찰된다고 보고되고 있다.5-7 이는 숙주의 면역 공격을 피하기 위하여 출현하는 면역학적 탈출 변이형이리라 생각되는데 missense
변이의 정도는 간질환 활동도의 차이8나 HBeAg의 존재 여부5,6 등에 따라 차이를 보일 수 있다고 보고 되고 있다. 특히 이 영역내의 missense 변이는 몇몇 유전자 부위에 집중적으로 나타나는 경향을 보이며 변이의 집중 부위는 지역적으로 다소 차이가 있다 고 알려져 있다.5,6,9
저자들은 만성 B형 간질환 환자에서 HBV core 유전자내 missense 변이의 정도가 간질환의 진행 정 도나 HBeAg 양성 여부 그리고 precore stop codon (precore codon 28)의 존재 여부 등에 관계되는지 알 아보고, core 유전자내에 missense 변이의 집중 부위 를 확인하고자 하였다.
대상 및 방법
1. 대 상
총 51예의 만성 HBV 보유자를 대상으로 하였다.
대상 환자는 임상 양상 및 HBeAg 양성 여부에 따라 네 군(I-Ⅳ군)으로 분류하였다. I군은 HBeAg 양성이 면서 혈청 ALT (alanine aminotransferase)치가 정상 인 15예로 혈청 ALT 치가 상승되었던 기왕력이 없 었던 무증상 HBV 보유자들이었다. Ⅱ군 14예는 HBeAg이 양성이면서 간조직 검사에서 만성 간염으 로 진단되었던 환자들이었으며, Ⅲ군 12예는 HBeAg 양성인 간경변증 환자들이었다. Ⅳ군 10예는 HBeAg 음성이면서 혈청 ALT 치가 상승된 예들로 이 중 2 예는 만성 간염 환자이었고 나머지 8예는 간경변증 환자이었다(Table 1). 간경변증 환자는 간조직 검사 로 진단되었거나 임상적으로 진단된 비보상성 간경 변증 환자들이었다.
Table 1. Profile of the Patients and Frequency of Precore Stop Codon
Groups Sex (M:F) Age (yr) ALT (IU/L) T. bil. (mg/dL) Precore stop codon*
Ⅰ (n=15)
Ⅱ (n=14)
Ⅲ (n=12)
Ⅳ (n=10)
10:5 10:4 7:5 8:2
25±6 30±10 46±11 47±9
21.7±9.1 202±137 201±292 113±136
0.9±0.1 1.1±0.3 16±15 3.8±5.3
0 3 (20%) 4 (33%) 7 (70%)
*, precore codon 28; ALT, alanine aminotransferase; T.bil., total bilirubin.
김연수 외 9인. 만성 B형 간질환에서 Hepatitis B Virus Core 유전자의 Missense 변이 69
2. 방 법 1) 혈청학적 검사
HBeAg은 상품화된 kit을 이용하여 방사면역법 (radioimmunoassay)으로 검사하였다.
2) H B V DN A 의 추출 및 중합효소 연쇄 반응(poly mera s e ch ain reaction ; P CR) 환자의 혈청 100 L와 SDS (sodium dodecyl sul fate) buffer 500 L (0.5% SDS, 10 mg/mL proteinase K, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0 150 mM NaCl)를 56℃에서 2시간 반응시킨 후 동일 부피의 phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) 처리하여 상층액을 취하고 isopropanol을 이용하여 DNA를 침전시켰다.
HBV DNA의 core 유전자(nt 1901-2450)를 증폭 시키기 위하여 primer는 HBV UP1 5' -CATAAGA- GGACTCTTGGACT-3' (sense; nt. 1653-1672), DN6 5' -TCTCCTGTTTTCATTTACTGTAA-3' (antisense;
nt. 2602-2624)를 사용하고 추출된 DNA에 primer set(각각 10 pmol), 2.0 mM MgCl2, 250 M dNTP 그리고 Taq polymerase (Ex Taq, 2.5 U, TaKaRa, Japan)를 첨가하고, thermal cycler (TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP3000, Japan)에서 95℃ 45초, 54℃ 30초 그리고 72℃ 60초간 40회 반응시키고 72
℃에서 10분간 연장시켰다. 2차 PCR은 1차 PCR 산 물 10 μL에 primer UP2 5' -AATGTCAACGACC- GACCTTG-3' (sense; nt. 1679-1698)와 DN6를 이용 하여 1차 PCR과 동일 조건으로 시행하였다. PCR 산물은 QIAX ⅡTMGel Extraction Kit (Qiagen, Ger- many)를 이용하여 elution하였다.
3) DN A s eque n c in g
Elution한 PCR 산물은 dideoxy-chain termination 방법으로 TopTM DNA sequencing kit (Bioneer, Korea)을 이용하여 sequencing 반응을 하였고 Silver Staining SystemTM(Bioneer, Korea)를 이용하여 염기 서열을 확인하였다(Fig. 1). HBV P3 5‘-TAGGAGG- CTGTAGGCATAAATTGGT-3' (sense; nt. 1774- 1798), S1 5' -CAAGCCTCCAAGCTGTGCCT-3' (sense;
nt. 1865-1884), S3 5' -GCACTCAGGCAAGCTAT- TCT-3' (sense; nt. 2060-2079) 그리고 C1 5' -GGA- GTGTGGATTCGCACTCCTCC-3' (sense; nt. 2267- 2289)을 이용하여 precore 영역을 포함한 core 유전 자를 분석하였다. 일부의 검체는 HBV DN4 5' - GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGG-3' (antisense;
nt. 2364-2388)와 DN5 5' -ATACTAACATTGAGA- TTCCC-3' (antisense; nt. 2436-2455)를 추가로 이용 하였다. Sequencing 반응은 thermal cycler를 이용하 여 95℃에서 45초, primer의 Tm 치에 따라 56℃ 내지
Fig. 1. Sequencing profile around codon 97 and 130. (Ile, isoleucine; Leu, leucine; Pro, proline;
thr, threonine).
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60℃로 30초 그리고 72℃에서 60초간 45회 반응시 킨 후 5% polyacrylamide sequencing gel에서 전기영 동하였다. 염기 서열은 Okamoto 등10이 보고한 HBV pIDW420의 서열과 비교 분석하였다.
4) 통계적 분석
각 군간의 다중 비교는 ANOVA (SPSS version 6.1.3)를 이용하였으며 양 군간의 비교는 Student t-test를 이용하였다.
결 과
1. 각 질환별 pr ec or e s t op codon 의 검출 빈도 Precore codon 28의 stop codon은 혈청 ALT 치가 정상인 HBeAg 양성자(I군)에서는 15예 모두에서 검 출되지 않았다. HBeAg 양성인 만성 간염예(Ⅱ군)에 서는 14예 중 3예(20%), 간경변증 예(Ⅲ군)는 12예 중 4예(33%) 그리고 혈청 ALT 치가 상승된 HBeAg 음성군(Ⅳ군)에서는 10예 중 7예(70%)에서 precore stop codon이 관찰되었다(Table 1).
2. 각 질환별 c or e 유전자의 m is s e n s e 변이 혈청 ALT 치가 정상인 HBeAg 양성자(I군)에서 는 15예 중 3예(20%)에서 각각 1개씩의 missense 변
이가 관찰되었으며 나머지 12예에서는 missense 변 이가 관찰되지 않아 환자 1인당 변화된 아미노산의 평균 개수는 0.2±0.4개이었다. 저자들이 missense 변이가 없다고 판단하였던 12예의 아미노산 서열은 Okamoto 등10이 보고한 HBV pIDW420의 아미노산 서열과 동일하였다. HBeAg 양성인 만성 간염 예(Ⅱ 군)에서는 14예 중 12예(86%)에서 최고 5개의 mis- sense 변이가 관찰되었으며 변화된 아미노산 수는 2.0±1.4개이었다. HBeAg 양성인 간경변증 예(Ⅲ군) 에서는 12예 중 10예(83%)에서 최고 6개의 missense 변이가 관찰되었고 평균 2.2±1.6개의 아미노산 변화 가 있었다. 혈청 ALT 치가 상승된 HBeAg 음성군(Ⅳ 군)에서는 10예 모두에서 missense 변이가 나타났는 데 최고 9개의 변이가 관찰되었으며 환자 1인당 아 미노산 변화는 4.5±2.3개로 네 군 중 missense 변이 가 가장 심하였다. Missense 변이의 정도는 Ⅱ군과
Ⅲ군간을 제외한 각 군간에 통계적으로 의미있는 차 이를 보였다(p<0.05 between group I and Ⅱ, I and
Ⅲ, I and Ⅳ, Ⅱ and Ⅳ, Ⅲ and Ⅳ)(Fig. 2).
3. P r e cor e s t op c odon 의 존재 여부에 따른 m is s e n s e 변이의 차이
혈청 ALT 치가 정상인 HBeAg 양성자(I군)를 제 외한 세 군(Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ군)의 환자를 precore stop
Fig. 2. Frequency of missense mutations according to the groups.
Kim et al. Missense Mutations of Hepatitis B Virus Core Gene in Chronic Hepatitis B Virus Carriers 71
codon의 존재 여부에 따라 두 군으로 재분류하여 missense 변이에 차이가 있는지 확인해 보았다. Pre- core stop codon이 존재하지 않았던 군에서는 22예 중 19예(86%)에서 missense 변이가 관찰되었으며 1 인당 평균 2.0±1.1개의 아미노산 변화가 관찰되었 다. 반면 precore stop codon이 존재하였던 군에서는
14예 중 13예(93%)에서 missense 변이가 확인되었 으며 평균 4.0±2.5개의 missense 변이가 나타나 precore stop codon이 존재하는 예에서 유의하게 변 이의 정도가 심하였다(p=0.002)(Fig. 3).
Fig. 3. Missense mutations according to the presence of precore stop codon in group Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ. Precore stop codon (－), the group of patients without precore stop codon; Precore stop codon (＋), the group of patients with precore stop codon.
Fig. 4. Missense mutations according to disease progres- sion in group Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ. CH, patients with chronic hepatitis regardless of HBeAg status; LC, patients with liver cirrhosis regardless of HBeAg status.
Fig. 5A. Deduced amino acid residues of core gene in group Ⅰ. Codons are numbered from the beginning of the core region. Changes of amino acid residues different from the prototype (10) are shown. Amino acid residues are expressed by single letters. Dashes indicate identity with the prototype. Pt., patient.
72 대한소화기학회지 : 제 33 권 제 1 호 1999
4. 만성 간염과 간경변증군에서 m is s en s e 변이의 차이
혈청 ALT 치가 정상인 HBeAg 양성자(I군)를 제 외한 세 군(Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ군)의 환자를 HBeAg의 존재
여부나 precore stop codon의 존재 여부와 관계 없이 만성 간염과 간경변증군으로 재분류하여 간질환의 진행에 따라 missense 변이에 차이가 있는지를 확인 해 보았다. 만성 간염군에서는 16예 중 14예(88%)에 서 missense 변이가 관찰되었으며 평균 2.3±1.4개의
Fig. 5B. Deduced amino acid residues of core gene in group Ⅱ.
Fig. 5C. Deduced amino acid residues of core gene in group Ⅲ.
Fig. 5D. Deduced amino acid residues of core gene in group Ⅳ.
김연수 외 9인. 만성 B형 간질환에서 Hepatitis B Virus Core 유전자의 Missense 변이 73
아미노산 변화가 있었다. 간경변증군에서는 20예 중 18예(90%)에서 변이를 확인할 수 있었으며 변화된 아미노산 개수는 평균 3.2±2.4개로 만성 간염군보 다 변이의 정도가 심한 편이었으나 통계적으로 의 미있는 차이는 관찰되지 않았다(p=0.169)(Fig. 4).
5. 각 질환별 cor e 유전자내 m is s e n s e 변이의 분포
Missense 변이가 일어난 3예의 HBeAg 양성인 무 증상 HBV 보유자(I군) 중 2예에서는 codon 130 proline이 threonine으로 전환되었고 나머지 1예는 codon 177 glutamic acid가 lysine으로 전환되었다 (Fig. 5A). HBeAg 양성인 만성 간염 예(Ⅱ군)에서는 codon 130 proline이 threonine 혹은 leucine으로 전환 된 예가 14예 중 7예로 가장 흔하였으며, codon 97 isoleucine의 leucine으로의 전환이 14예 중 5예에서 그리고 codon 35와 60의 전환은 각각 3예와 2예에서 관찰되었다(Fig. 5B). HBeAg 양성인 간경변증 예(Ⅲ 군)에서도 codon 97과 130의 전환이 12예 중 각각 8 예와 7예로 두 codon의 변화가 가장 빈번하였다(Fig.
5C). HBeAg 음성 예(Ⅳ군) 역시 missense 변이가 가 장 흔히 관찰되었던 codon은 codon 97과 130으로 각 각 10예 중 8예 그리고 7예에서 관찰되었다. HBeAg
이 음성인 10예 중 7예에서는 4개 이상의 아미노산 변화가 관찰되었는데, 특히 HBeAg 양성군에서는 1 예에서만 관찰되었던 codon 87 serine의 glycine으로 의 전환이 10예 중 5예에서 관찰되었다(Fig. 5D).
전체적으로 missense 변이가 일어난 부위를 비교하 여 보았을 때 codon 80-100은 23예에서 34개의 아미 노산 변화(I군 제외시 codon당 4.5×10-2개의 변이)가 있었고, codon 130-135은 23예에서 26개의 아미노산 변화(I군 제외시 24개 codon 변화로 codon당 11.1×
10-2개의 변이)가 관찰되어 이 두 부위가 core 유전자 내에 missense 변이가 가장 집중적으로 일어난 부위로 확인되었다. 이외에도 codon 27-35 와 codon 168-177 은 각각 6예에서 8개의 아미노산 변화가 있었고 codon 5-14와 codon 149-156은 6예와 4예에서 각각 7개씩 그리고 codon 50-60은 5예에서 6개의 아미노산 변화 가 관찰되어, 이 부위들이 다른 부위에 비하여 상대적 으로 missense 변이가 흔히 관찰된 부위였다(Fig. 6).
고 찰
만성 B형 간질환의 임상 경과 중 면역 압력을 받 는 면역 제거기에는 숙주의 면역 감시를 피하기 위 하여 변이형 바이러스가 출현할 수 있다. Core,5-7,11 Fig. 6. Distribution of missense mutations in the core gene. Vertical lines indicate codon sites where missense mutations occurred. Shaded areas indicate the regions where the missense mutations are concentrated. Gr., group.
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precore12,13 그리고 core promoter14,15 변이형 등이 이 에 해당되는데, 이 중 core 유전자의 missense 변이 형은 면역세포에 의해 인식되는 core 단백의 항원 결정기에 변화를 일으켜 면역 공격을 피할 수 있으 리라 추측되고 있다. 이러한 변이형이 면역 공격을 피할 수 있는 기전은 아직 확실치 않으나, 항원 결 정기를 구성하는 peptide가 변화되면 HLA class I 분자와 peptide의 결합이 저해될 뿐만 아니라 T세포 수용기의 인식 또한 감소되어 면역세포내로 충분한 자극 신호가 전달되지 않는 면역 결여(anergy) 상태 가 초래될 수 있다고 추정되고 있다.16
만성 B형 간질환에서 질환 활동도 차이에 따른 core 유전자의 missense 변이에 대하여 그 동안 많은 연구가 있었다.5-8,11 한 연구에서는 무증상 HBV 보 유자에서는 core 유전자의 missense 변이가 관찰되 지 않았던 반면, 만성 활동성 간염 환자에서는 전 예 에서 변이가 관찰되었다고 보고하였다.5 다른 연구 에서도 혈청 ALT 치가 정상인 HBeAg 양성자에서 는 24예 중 5예에서만 missense 변이가 관찰되었으 나 면역 관용기를 벗어난 대부분의 환자에서는 변이 형이 관찰되었다고 보고하였다.6 저자들도 이와 유 사한 결과를 얻었는데 혈청 ALT 치가 정상인 HBeAg 양성자에서는 변이의 빈도나 정도가 경미하 였던 반면 만성 간염과 간경변증 환자에서는 심한 변이가 일어난 점으로 미루어, 면역 제거기에 숙주 의 면역 압력을 피하기 위하여 변이형 바이러스가 출현하였을 가능성을 추측할 수 있었다. 역으로의 추측도 가능한 바 바이러스의 변이가 선행11되어 변 화된 항원 결정기가 야생형의 항원 결정기보다 강한 면역반응을 유발하여 간내 염증이 활성화되었을 가 능성도 배제할 수 없으리라 생각된다.
Core 유전자의 missense 변이형은 대부분 면역 제 거기에 출현하므로 변이의 양상은 간내 염증반응의 정도나 간질환의 진행에 따라 차이가 있을 가능성이 시사되고 있다. 국내 만성 B형 간염 환자를 대상으 로 한 연구에서 만성 지속성 간염 예들에서는 core 유전자의 missense 변이가 주로 codon 85-100에 집 중되어 있었던 반면, 만성 활동성 간염 예들에서는 만성 지속성 간염 예들에서 관찰되지 않았던 codon 21-34의 missense 변이가 빈번히 관찰되었다고 보고
하였다.8 이는 간질환의 진행이나 활동도의 변화에 따라 core 유전자 내에 새로운 변이가 추가적으로 발생할 가능성을 시사한다. 이러한 현상을 고려하여 저자들은 HBeAg 양성인 만성 간염과 간경변증 환 자군에서 변이에 차이가 있는지를 비교하여 본 바, 간경변증군에서는 만성 간염군에 비하여 missense 변이가 심한 경향이었지만 missense 변이가 일어난 아미노산 수나 변이가 일어난 부위에 의미있는 차 이를 보이지 않았다. 비교 대상이 충분치 않아 이러 한 현상이 나타났을 가능성이 있으나, 또 다른 가능 성으로는 간질환이 악화되었던 시기에 출현한 변이 형 바이러스가 면역세포에 인식되어 제거되었을 가 능성도 추측할 수 있다.11 이를 확인하기 위해서는 변이가 일어나는 codon 부위를 전향적으로 추적 비 교하여야 할 것이다. 한편 HBeAg 음성군에서는 HBeAg 양성군에서 드물게 나타났던 codon 87의 missense 변이가 빈번하여 HBeAg 존재 여부에 따 라서는 변이 부위의 차이를 관찰할 수 있었다.
Core 유전자의 missense 변이의 정도, 즉 변화된 아미노산의 수는 환자의 HBeAg 양성 여부와 관계 가 있다고 보고되고 있다. 혈청 ALT 치가 상승되어 있는 HBeAg 양성자에서는 평균 2.8개의 아미노산 변화가 관찰되었던 반면 HBeAg 음성자에서는 5.0개 가 변화되어 HBeAg 양성 여부가 core 유전자의 missense 변이 정도와 긴밀한 관계가 있다는 보고가 있으며6 다른 연구도 이와 유사한 결과를 보고하였 다.5 본 연구에서도 HBeAg 음성자에서는 평균 4.5 개의 많은 변이가 관찰되었던 반면, HBeAg 양성인 만성 간질환 환자에서는 2.0 내지 2.2개의 변이를 보 여 HBeAg 음성 예에서 양성 예보다 변이 정도가 심 함을 확인할 수 있었다. 또한 precore codon 28의 stop codon 존재 여부에 따라 비교하였을 때에도 stop codon이 존재하였던 예에서는 평균 4.0개의 아 미노산 변화가 나타나, 존재하지 않았던 예들의 2.0 개에 비하여 유의하게 많은 변이를 나타내었다. 이 처럼 HBeAg이 음성이거나 precore stop codon이 존 재하는 환자에서 그렇지 않은 예들에 비해 missense 변이가 많았던 현상에 대해서는 두 가지의 해석이 가능하리라 생각된다. 즉 HBeAg이 소실된 후 HBeAg에 대한 면역 공격이 core 항원으로 이동되어
Kim et al. Missense Mutations of Hepatitis B Virus Core Gene in Chronic Hepatitis B Virus Carriers 75
core 유전자내에 missense 변이가 다발적으로 나타 났을 가능성이 있다. 역으로의 추측도 가능한 바 장 기간에 걸친 core 항원에 대한 면역 공격으로 인하 여 core의 여러 항원 결정기가 변화되어 core 항원 이 더 이상 면역반응을 유발시키지 못하는 상황을 가정할 수 있다. 이 경우 HBeAg이 면역압력을 받는 상태에 놓이게 되므로 이차적으로 HBeAg을 생성하 지 않는 precore 변이형이 출현하였을 가능성이 있 다.
만성 간질환 뿐만 아니라 급성 B형 간염 환자에 서도 core 유전자의 missense 변이형이 검출된다고 보고되고 있는데, 이 경우 변이의 정도는 간염의 중 증도(severity)와 관계가 깊다고 알려져 있다. 즉 자 연 회복되는(self-limited) 급성 간염 환자의 경우 missense 변이가 드물게 나타나며 그 정도 또한 미 미한 반면, 전격성 간염 환자에서는 다수의 아미노 산 변화를 동반한 변이형이 빈번히 검출된다고 보고 되고 있다.17-19 본 연구에서도 확인되었듯이 HBeAg 이 음성이거나 precore stop codon이 존재하는 대부 분의 예에서는 core 유전자 내에 missense 변이가 다 발적으로 존재하였는데, 이러한 변이형이 HBV 비 보유자에 전염되어 급성 간염을 일으킬 경우 야생형 바이러스에 비하여 더욱 심한 면역반응을 유발할 가 능성이 시사된다. 이는 전격성 간염 환자에서 pre- core 변이형 바이러스가 흔히 검출되는 점과 일맥상 통한다고 볼 수 있다.20,21
면역 제거기에 나타나는 core 유전자의 missense 변이는 몇몇 유전자 부위에 집중적으로 나타나는 경 향을 보인다고 보고되고 있다. Ehata 등9의 보고에서 는 codon 84-101만이 변이가 집중된 부위였던 반면, Chuang 등5은 codon 84-101 이외에 48-60과 147-155 에도 변이가 빈번히 나타났다고 보고하였다. 또한 Akarca와 Lok6은 상기 부위들 이외에 codon 125-135 에서도 변이가 집중적으로 관찰되었다고 하였다.
Ehata 등9의 보고는 연구 대상이 일본인이었으며 Chuang5 및 Akarca와 Lok6의 보고는 중국인이었던 점을 고려한다면 지역적 혹은 인종적 차이에 따라 변이의 집중 부위에 차이가 있을 가능성이 있다. 본 연구에서는 codon 80-100과 130-135가 가장 빈번히 변이가 일어난 부위로 관찰되어 Akarca와 Lok6의 보
고와 유사하였는데, 상기 보고들에서 변이가 흔하였 던 codon 48-60과 147-155 등에서는 비교적 다른 부 위에 비하여 변이가 흔히 관찰되긴 하였으나 변이 의 집중 부위로 해석하기에는 빈도가 낮았다. 이처 럼 동양인을 대상으로 한 대부분의 연구 결과는 다 소 차이는 있으나 변이의 집중 부위가 존재한다고 보고되는 반면, 유럽에서는 core 유전자 내에 missense 변이가 흔히 일어나는 특정 부위를 확인할 수 없었다고 하였다.22 이러한 차이는 지역적인 HBV 유전자형의 분포 차이나 인종간의 HLA 형의 차이에 기인23되었을 가능성이 있다고 추측된다.
한편 B형 간질환에서 감염된 간세포가 면역세포 에 의해 인식되어 파괴된다는 점을 고려한다면, core 유전자 내에 missense 변이가 집중적으로 일어나는 부위는 면역 체계에 의해 인식되는 항원 결정기에 해당되는 부위일 가능성이 높다. 본 연구에서 변이 가 흔히 관찰되었던 codon 130-135는 CD4+ (codon 117-131)24와 B세포(codon 130-138 HBc/e2)25 항원 결정기에 해당되는 부위이며 codon 80-100 중 일부 분은 B 세포 항원 결정기(codon 74-89 HBc/e1)25에 해당된다고 알려져 있다. 반면 CTL 항원 결정기에 해당되는 부위인 codon 18-27, 141-15126,27 내의 변 이는 드물게 관찰되었다. 대부분의 만성 간염 환자 에서 바이러스가 지속적으로 존재할 수 있는 이유는 CTL 항원 결정기가 변화된 변이형 바이러스가 존재 하기 때문이 아니라 바이러스가 제거될 정도의 충분 한 CTL 반응이 일어나지 않기 때문이란 주장을 일 부 뒷받침하는 결과로 생각된다.28
이상의 결과로 만성 HBV 보유자에서 core 유전자 의 missense 변이형은 면역 관용기보다는 간내 염증 반응이 활발한 면역 제거기에 흔히 출현함을 알 수 있었다. 아울러 missense 변이의 정도는 간질환의 진 행 정도보다는 HBeAg 양성 여부나 precore stop codon의 존재 여부와 더욱 긴밀히 관계되리라 추측 된다. 국내 만성 B형 간질환 환자에서 core 유전자내 에 missense 변이가 가장 흔히 일어나는 부위는 codon 80-100과 130-135일 것으로 생각된다.
감사의 글
76 대한소화기학회지 : 제 33 권 제 1 호 1999
본 논문의 통계 검증에 도움을 주신 순천향의대 신경외과학교실 김범태 교수께 감사드린다.
요 약
목적: Hepatitis B virus (HBV)의 core peptide는 면역세포의 주된 표적으로 인식된다고 알려져 있으 며 간내 염증반응이 활발한 면역 제거기에 core 유 전자의 missense 변이형이 흔히 출현한다고 보고되 고 있다. 저자들은 만성 HBV 보유자에서 core 유전 자의 missense 변이가 간질환의 진행 정도나 HBeAg 과 precore stop codon의 존재 여부 등에 따라 차이 가 있는지를 알아보고, core 유전자 내에 missense 변이의 분포 부위를 확인하고자 하였다. 대상 및 방 법: 51예의 만성 HBV 보유자(HBeAg 양성인 무증 상 보유자 15예, 만성 간염 14예, 간경변증 12예 그 리고 ALT 치가 상승된 HBeAg 음성자 10예)에서 혈 청 DNA를 추출하여 PCR-direct sequencing 방법으 로 core 유전자를 분석하였다. 결과: Core 유전자의 missense 변이는 무증상 보유자 3예(20%), HBeAg 양성인 만성 간염 12예(86%), 간경변증 10예(83%) 그리고 HBeAg 음성군은 10예(100%) 모두에서 관찰 되었다. 환자 1인당 missense 변이가 일어난 아미노 산 수(M±SD)는 무증상 보유자 0.2±0.4개, HBeAg 양성인 만성 간염 2.0±1.4개, 간경변증 2.2±1.6개 그리고 HBeAg 음성자는 4.5±2.3개로 HBeAg 양성 인 무증상 보유자에서 변이의 정도가 가장 경미하였 으며 ALT 치가 상승된 HBeAg 음성자에서 가장 변 이가 심하였다. 무증상 보유자를 제외한 만성 간질 환 환자 중 precore stop codon이 존재하였던 예에서 는 평균 4.0±2.5개의 missense 변이가 관찰되었고 존재하지 않았던 예에서는 2.0±1.1개가 관찰되어, precore stop codon이 존재하였던 예들에서 유의하게 변이가 심하였다. Missense 변이는 codon 80-100과 codon 130-135에서 각각 34개와 26개가 관찰되어 이 두 부위가 missense 변이가 가장 집중적으로 일 어난 부위였다. 결론: HBV core 유전자의 missense 변이는 만성 HBV 감염 경과 중 면역 제거기에 흔히 출현하며 변이의 정도는 간질환의 진행 정도보다는 HBeAg 양성 여부나 precore stop codon의 존재 여부
와 더욱 긴밀히 관계하리라 추측된다. 국내 만성 B 형 간질환 환자에서 core 유전자 내에 missense 변 이의 집중 부위는 codon 80-100과 130-135일 것으 로 생각된다.
색인단어: B형 간염 바이러스, Core 유전자, Mis- sense 변이, HBeAg, Precore stop codon
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