Chapter 17

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Chapter 17

RNA Polymerase II:

Cotranscriptional and

Posttranscriptional Processes

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17.1 Pre-mRNA

Eukaryotic cells synthesize large heterogeneous RNA (hn RNA).

그림처럼 HeLa cell에서 배양한지 5분이 되어 RNA를 추출하면 크기가 큰 것을 발견함. 이를 hnRNA라고 하며 더 짧은 RNA로 trim 되는 것을 발견함

다음으로 polyribosome 혹은 polysome으로 부터 mRNA를 추출 한후 RNase T1 (guanylate residue의 phosphodister bond를 자름) 과

pancreatic RNase (pyrimidine nucleotide를 자름)로 자른 경우 어느 것으로 자르던 150-200개의 adenylate group이 나오는 것을 발견함.

이를 3’ poly A-tail이라 하며 hnRNA를 잘라도 동일한 결과가 나옴.

즉 hnRNA도 poly A tail을 갖으며 hnRNA가 mRNA로 convert된 것임.

Figure 17.03: Purification of mRNA and pre-mRNA from a mixture of RNA molecules by oligo(dT)

cellulose chromatography.

Oligo(dT) column을 이용하여 poly A가 결합하게 한 후 elution을 통하여 mRNA를 추출함.

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17.2 Cap Formation

Figure 17.5

messenger RNA molecules have 7-methylguanisone caps at their 5’-ends.

Figure 17.6 1974년 분리된 mRNA에 두개 혹은 세개의

methyl group이 있는 것이 발견되었고

methylated nucleotide가 5’ end에 집중됨을 발견함.

(그림 17.5) mRNA 5’-cap 구조.

두 개의 nucleotide에 methyl기가 있으며 하나는 guanosine의 N-7에 있고 다른 하나는 첫번째 nucleotide의 ribose의 C-2에 존재함.

또한 이곳에 N⁷-methylguanisine (m⁷G)이 결합 (그림 17.6) 앞의 그림은 cap1이며 다세포 생물의 mRNA에 존재함. cap0는 효모의 mRNA에 존재.

cap2는 일부 척추동물의 mRNA에 존재한다.

기능; mRNA processing 과정에서 5’-3’ exonuclease digestion으로부터 mRNA를 보호함

cap binding complex (CBC) 구조; CBC는 핵내에서 5’-m⁷G에 결합을 한다. CBC는 CBP20 subunit과 CBP80 subunit로 됨.

CBP20은 4개의 antiparrell β-strand로 되어 cap의 nucleotide 에 결합을 한다. CBP80은 CBP20과 interact함.

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The 5' cap is added shortly after transcription begins

Figure 17.8

5’-m⁷G cap이 언제 만들어 지는가를 조사함.

그림처럼 초파리의 hsp70 유전자의 전사를 이용하여 전사된 nucleotide의수와 cap된 RNA의 수를 조사 한 결과 pre mRNA가 만들어지고 20 -30 nucleotide가 만들어질 때 5’cap이 형성됨을 알 수 있다.

Three enzymes work together to add the 5' cap

RNA polymerase II exit channel로 RNA가 나오자 마자 RNA 5’-triphosphatase가 5’의 P를 제거함

Guanylyltransferase가 GTP로부터 GMP를 5’ 말단으로 이전시킴 N7G-methyltransferase가 methyl 기를 N-7 위치로 첨가함

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Capping enzyme is recruited by the CTD of RNA polymerase II

RNA polymerase II의 large subunit의 CTD (carboxyl terminal domain)가 capping에

중요한 역할을 함이 밝혀짐. CTD가 인산화 된 후 CE (capping enzyme; RNA triphospha- tase + guanylyltransferase)가 결합하여 새로 형성된 RNA에 guanosine을 첨가. 다음으로 MT (methyltransferase)가 methyl기를 guanosine cap에 methyl기를 전이시킴.

최종으로 CBC (capping binding complex)가 5’-m⁷G cap에 결합한다.

CTD must be phosphorylated on Ser-5 to target a transcript for capping

CTD 지역의 Tyr-ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser 로 이루어진 tandem repeat 지역이 중요.

이중 어느 곳이 인산화 부위인지를 조사함.

guanylyltransferase와 RNA triphosphatase domain을 박테리아에서 합성하고 tandem repeat 지역을 인위로 합성 후 반응을 조사.

RNA triphosphatase는 항상 결합을 하지 않으며 guanylyltransferase는 serine이 인산화 된 경우 결합한다. 그러나 ser-5가 인산화 된 경우에만 activation 된다

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Figure 17.11

17.3 Split genes

1977년 진핵세포 유전자의 DNA 서열이 mRNA와 비교해 볼 때 일부가 없어진 것을 발견. adenovirus coat protein을 발현하는 유전자와 해당 mRNA를 hybridization 시키면 mRNA에 존재 하지 않는 부위가 존재함을 알 수 있다.

A, B, C; RNA에 존재하지 않는 부위

푸른색은 DNA-RNA hybrid부위를 보여준다.

결론; Primary transcript로 부터 일부 서열이 제거되고 flanking 서열이 연결되어 mRNA를 만듬.

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Experimental demonstration of split genes

The ovalbumin gene contains eight exons and seven introns EcoRI은 cDNA를 자르지 않기 때문에 한 밴드를 예상했으나 여러 개의 band가 나옴

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Characteristics of human genes from the Human Genome Project

Human genome project는 intron과 exon에 대한 막대한 정보를 제공한다. 표 12.1은 cDNA와 genomic DNA를 비교하여 얻은 결과임. 이처럼 intron과 exon에 관한 정보등 막대한 정보를 수집 분석하는 biotechnology와 computer technology를 합친 분야를 bioinformatics라고 한다.

EST (expressed sequence tags); mRNA의 한쪽 혹은 양쪽 말단을 copy하여서 얻어진 cDNA 분절 (약 200-500 nucleotide)을 말하며 full cDNA를 대치하여 사용함.

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Intron size distributions vary between organisms

Exons tend to be more uniform in size between organisms

Intron 수는 유전자 별로 다양하다. 예로 histon은 intron이 없고 titin 유전자 (근육 단백질)는 363개의 intron이 있다. 그림처럼 intron 크기는 생명체 별로 다양하다. 사람의 intron은 c.

elegans나 초파리보다 길다. 사람의 intron은 60 – 30,000bp이나 가장 긴 것은 NRXN3에 존재하는 500,000bp intron이 있다.

Exon은 intron 보다는 크기가 일정하다.

평균 사람의 유전자는 9개의 exon을 갖고 있다. 크기는 50 – 200bp임. 사람의 평균 exon (145bp)은 평균 intron (3365bp)보다 짧다.

Orthologs; 한 조상 유전자로부터 진화를 통하여 다른 생명체로 분산된 유전자. 유사한 단백질을 만드나 길이가 다르며 이는 exon 보다는 intron의크기의 차이에서 유래된다.

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Pre-mRNAs can undergo alternative splicing to produce different mRNAs

Splicing은 (1) pre-mRNA의 모든 exon이 연결되어 하나의 성숙한 mRNA가 되는 경우

(2) 하나의 pre mRNA에서 한 종류의 exon의 조합이

하나의 mRNA가 되고 다른 조합이 다른 mRNA를 만든다 현재 사람의 전체 transcription unit의 약 42%가 (2)번의 splicing를 하며 이를 alternative splicing이라고 한다.

그러나 probe으로 사용된 EST가 특정 단계의 조직만을 조사하거나 mRNA의 일부만 감지하기 때문에 더 많은 유전자가 alternative splicing을 한다고 간주함.

Constitutive exon; 만들어진 모든 mRNA에 포함되는 것 Regulated exon; 어떤 mRNA에는 포함이 되고 다른 mRNA에는 포함되지 않는 exon을 의미함.

그림은 다양한 방법의 alternative splicing을 보여줌.

하나의 pre-mRNA에서 다른 splicing에 의하여 만들어진 단백질은 공통된 기능을 갖으나 일부 domain은 다른 기능을 갖는다. alternative splicing은 가끔 해독틀을 바꾸어 하나의 RNA에서 다른 해독틀을 갖기도 한다.

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Alternative splicing; 그림은 하나의 유전자가 다양한 splicing을 통하여 multiple mRNA를 만드는 것을 보여준다. WT1 유전자 (돌연변이가 생기면 kidney tumor를 나타냄)는 exon1의 3개의 개시 신호, exon5의 alternative splicing, exon9의 alternative splice site 그리고 다른 posttranscriptional modification을 통하여 24개의 isoform을 갖는다. 주로 transcription factor로 작용을 한다

초파리의 Dscam gene; neuron exon의 배치에 중요한 역할을 한다.

(좌) 노란색은 constitutive exon이고 보라색은 alternative splicing exon임. exon4는 12개.

exon6은 48개, exon9는 33개, exon17은 2개의 variants를 갖고 있다.

각각의 exon에서 하나의 variant만 mRNA를 만드는데 사용된다.

(우) Dscam 단백질은 axon guidance receptor로 작용하며 만들어진 후 각각 unique한 axon cue와 작용한다.

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Trans-splicing

Figure 17.19

cis-splicing; 여태까지 배운 것처럼 동일한 하나의 pre-mRNA 분자에서 유래한 exon이 합쳐져 mRNA를 만든 경우

trans-splicing;두 개의 다른 pre-mRNA로부터 유래한 exon이 모여서 하나의 mRNA를 만든 경우를 말함.

그림; 초파리의 mod (mdg4) locus는 28kb 길이이고 26 alternatively spliced mRNA를

암호화한다. 각 mRNA는 1-4 exon과 downstream에 위치한 exon 중의 하나와 만들어진다.

노란 exon은 동일한 DNA 가닥에서 만들어지는 exon이나 푸른색은 반대 DNA 가닥에서 만들어지는 exon이다. 그림은 exon1-4와 exon 5,6이 trans-splicing을 하는 것을 보여준다.

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Pre-mRNA requires specific sequences for precise splicing to occur

Figure 17.20

세포는 정확하게 intron을 excise 해야한다. intron의 시작부위인 exon/intron 경계부위를 5’-splice site라고 하며 intron/exon 경계 부위를 3’-splice site라고 한다.

그림처럼 효모는 5’-splice sequence (AG/GUAUGU) 3’-splice sequence (CAG/G)

branch point sequence (UACUAAC)를 갖고 있으며 A는 premRNA splicing에 참여하는 branching nucleotide를 의미한다. 많은 효모의 intron은 pyrimidine tract를 갖고 있다.

사람의 경우도 효모와 비슷한 경우가 많다.

(a) GU-AG intron을 나타내며 이 경우는 pyrimidine rich tract가 존재 (b) AU-AC intron도 일부 존재한다.

(a)

(b) Figure 17.21

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Two splicing intermediates resemble lariats

splicing intermediates를 분리하고 그 구조를 밝히고자 실험을 하였다.

실험; ³²p-labeled pre-mRNA (single exon-intron-exon)를 in vitro splicing system에 가하고 만들어지는 RNA를 다양한 시간에 분리하여 autoradiography를 시행하였다.

그림에서 130 nucleotide와 339 nucleotide product band가 intron을 포함한 intermediate product일 것으로 생각하여 연구를 함. (그 이유는 각 band는 ATP와 magnesium이 가해 졌을때만 생기고 5-end가 G가 아닌 경우는 생기지 않는다. 또한 intron-specific probe가 결합을 한다). 그러나 이들 밴드는 길이와는 다르게 이동을 하기 때문에 특수 구조일 것으로 생각함.

130과 339 nucleotide band가 그림처럼 단일 2’-5’ phosphodiester bond를 갖는 lariat model임을 주장함.

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The lariat model is supported experimentally

(a)

(b) (c)

lariat 구조를 증명하는 실험.

(a) A-G가 2’-5’ phosphodiester bond로 연결

A-C가 3’-5’ phosphodiester bond로 연결

(b) intron의 3’ end에 primer를 결합 시킨 후 reverse transcriptase를 이용하면 2’-5’ branch가 진행을

방해한다.

(c) intron의 3’ end에 primer를 결합 시키고 DNA-RNA hybrid를

절단하는 RNaseH를 이용하여 절단하며 circular RNA와 short linear fragment가 남는다.

Splicing requires two coordinated transesterification steps

first step; branching nucleotide A의 2’-hydroxyl이 5’-splice site를 공격

second step; exon1의 3’-end에 있는 3’-hydroxyl이 3’-splice site의 phosphodiester bond를 공격하여 두가지 transesteri- fication이 일어남.

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17.4 Spliceosomes

splicing에 관여하는 효소들을 찾고자 노력하는 과정에서 autoimmune disease에 관여하는 항체가 핵내의 small ribonucleoprotein particle에 결합하는 것을 발견하고 pre-mRNA의 processing에 관여한다고 생각.

항체를 이용하여 분리 한 후 100 – 200 nucleotide의 RNA 분자가 관여 함을 밝힘. uridine이 많은 small nuclear RNA 분자라 U1 snRNA, U2, U4, U5, U6 snRNA라고 명명함. (U3 snRNA는 rRNA의 형성에 관여) U1,U2,U4,U5는 5’-end에 2,2,7 trimethyl guanosine cap을 갖고 있고 (그림 a) U6는 γ-methyl phosphate cap을 갖고 있다 (그림 b).

(a)

(b)

γ-methyl phosphate cap

각각의 snRNA는 자신의 small nuclear ribonucleoprotein particle (snRNP)에 존재하며 이들을 U1 snRNP, U2 snRNP, U4 snRNP,

U5 snRNP,U6 snRNP라고 한다.

U4,U5,U6 snRNP는 U4와 U6 snRNA의 base pairing 을 통하여 U4/U6•U5 tri-snRNP particle을 만든다.

그림; U4 (붉은색)와 U6 (초록색)의 base pairing.

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U1, U2, U4, U5, U6 snRNP가 splicing에 관여한다는 증거가 발견됨.

1) U1 snRNP specific antibody가 splicing을 막음

2) U snRNP를 제거하면 pre-mRNA를 splice 하지 못한다.

3) U1 snRNA의 5’ 말단을 제거하면 splicing이 일어나지 못한다.

4) U2 snRNP는 branching site에 결합하고 U5 snRNP는 pre-mRNA의 3’-splice site에결합 5) U4와 U6는 필수적인 splicing component인 것이 밝혀짐.

더 많은 실험을 통하여 5개의 U snRNP는 spliceosome이라는 커다란 ribonucleoprotein splicing machine을 이루며 크기는 4.8X10⁶ Da (non-snRNP protein factor도 포함) 이다.

이들의 3차원적인 구조는 그림 17.28에 있으며 (교재 참조) large subunit (주로 5개의 snRNP로 됨)와 small subunit (non-snRNP protein factor로 됨)으로 구성되었으며 중간에 tunnel이 있어서 pre-mRNA가 맞게 되어있다.

(a) U1 snRNA (b) U1 snRNP

U1, U2, U4, U5 snRNP는 모두 유사한 Sm polypeptide를 갖고 있고 또한 각자 독특한 polypeptide를 갖고 있다. U6 snRNP는 Sm을 갖고 있지 않으며 이와 유사한 Lsm polypeptide를 갖음.

(그림) (a) U1 snRNA와 단백질이 결합된 (b) snRNP를 나타냄. U1-A와 70k는 U1의 독특한 단백질이며 B, D1, D2, D3, E, F,G 는 Sm polypeptide임. 중간에 ring 구조를 이룬다.

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Each U snRNP is formed in a multistep process

U snRNP가 형성되기 위하여 여러 단계를

거쳐야 한다. 그림은 U1 snRNP의 형성을 보여줌 1) pre-snRNA는 RNA polymerase II에 의하여 전사가 되고 m⁷G가 5’ 말단에 첨가됨.

2) CBC가 결합하고 RAN, Xpo1, PHAN이라는 export protein이 결합함.

3) 핵공을 통하여 이동하고 GTP hydrolysis 되면서 protein 들이 분리됨.

4) snRNA에 Sm 단백질이 결합하고 pre- snRNA의 3’ 말단이 trimm되고 m⁷G cap이 2,2,7 trimethyl cap으로 전환 된다.

5) Import protein과 결합하여 핵공을 통하여 핵내로 들어온다.

6) base modification이 일어나고 U1-specific protein이 결합하여 최종적인 U1 snRNP가 된다.

U6 snRNP의 형성은 다르다.

1) 우선 RNA polymerase III에 의하여 전사되고 2) γ-methyl phosphate cap을 갖는다.

3) Sm protein이 아니라 Lsm protein을 갖는다.

4) U6 snRNP biogenesis는 핵내에서 이루어진다.

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Spliceosome assembly

spliceosome의 assembly에는 몇 단계가 있다.

1) splicing factor 1(SF1)이 branch point sequence에 결합 2) 다른 non-snRNA 단백질인 U2AF (U2 snRNP auxiliary factor)의 large subunit인 U2AF⁶⁵가 polyprimidine tract 에 결합하고 small subunit인 U2AF³⁵는 3’-splice site인 AG에 결합한다. U1 snRNP가 5’-splice site에 결합하여 E (early) complex를 만듬.

3) U2 snRNP가 branch point sequence에 결합하여 A complex로 전환된다.

4) U4/U6•U5 tri-snRNP가 3’-splice site 근처에 결합하여 B complex가 된다.

5) B complex는 복잡한 rearrangement를 거쳐서 C

(catalytic) complex 로 바뀌어 첫번째 transesterification 을 촉매 한다.

B에서 C로 넘어가는 과정은 U6 snRNP가 U1 snRNP를 대치하고 U6와 U2가 interact하며 U5가 splice site를 연결 한다. 또한 U1, U4가 불안전하여 C complex에 약하게 결합을 한다.

다음 페이지에서 자세히 배운다.

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Rearrangements occur prior to the first transesterification reaction

그림; B complex에서 C complex로 바뀌는 과정에서의 rearrangement를 설명함.

red line; pre-mRNA, green line; snRNA a) 5’-splice site에서 U6 snRNA가 U1 snRNA를 대치함.

b) branching sequence에서 SF1이 방출되고 U2 snRNA가 결합한다.

c) U2 snRNA가 intramolecular rearrangement를 한다

d) U4와 U6 snRNA의 base pair이 끊어 지고 U6 snRNA 내에서 새로운 intra- molecular base pair이 생긴다.

e) U4와 U6 snRNA간의 다른 base pair가 분리되고 U2 snRNA 내에서 intramolecular base pair도 파괴된다.

그 결과 U2, U6간에 base pair가 형성.

f) U2와 U6 snRNA간에 conformational change가 일어나 U6 snRNA가 U2 sn RNA에 가까워져 염기 쌍을 형성.

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The U2/U6 snRNA complex may be responsible for catalysis in splicing

U2, U5, U6 snRNP가 first transesterification 반응이 일어날때 pre-mRNA에 강하게 결합하여 이들이

catalytic process에서 중요한 역할을 할 것으로 간주됨.

그림; 실험실에서 U2•U6 RNA complex를 만든 후 branch point sequence를 갖는 oligonucleotide에 작용하는가를 관찰함.

(a) 그 결과 bulged branching nucleotide 인 A의 2’- OH group이 U6 snRNA의 A와 G 사이의

phosphodiester bond에 nucleophilic attack를 하는 것을 발견함.

U2는 green, U6는 red, branchpoint nucleotide (Br)는 black.

(b) branching oligonucleotide와 U6 snRNA간의 phosphodiester 결합.

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Splicing regulatory (SR) proteins are important for ESE recognition

spliceosome은 정확한 splice site를 인식하여 intron을 제거하여야 한다. 다 세포

생명체에는 splice site를 인식하는 것을 도와주는 regulatory protein이 있다. 이들은 exon 혹은 intron의 특정 서열에 결합을 하고 exon recognition을 stimulating하거나

repressing한다.

splice site selection을 stimulation하는 서열을 exonic splicing enhancer (ESE) 혹은

intronic splicing enhancer (ISE)라고 하며 ESE에서 대표적인 것은 (GAR)n을 갖는 purine- rich 서열이 있다.

splicing regulatory protein (SR protein)은 ESE 인식에중요한 역할을 한다.

그림; SR protein의 구조.

N- terminal에 하나 혹은 두개의 RNA recognition motif (RRM)가 존재하고 C- terminal에 argine/serine rich domain (RS- domain)이 존재한다.

RRM은 sequence specific RNA binding site이며 RS는 protein-protein interaction을 한다.또한 serine이 인산화 되어야 반응이 일어난다. 이들이 어떻게 작용하는가는 다음 페이지에서 배운다.

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Splice site recognition by the splicing machinery

정확한 5’-(GU)와 3’-(AG)를 인식하기 위해서는 exonic splicing enhancer와 그곳에 결합 하는 SR protein이 필요하다.

그림; SR이 ESE에 결합하고 U1 snRNP를 5’-splice site로 불러드린다. 그리고 U2AF⁶⁵, U2AF³⁵를 pyrimidine tract과 3’-splice site의 AG로 불로 드린다. U2AF는 U2 snRNP를 branch point sequence (A)로 불러드린다. 또한 SR은 U1 snRNP와 U2 snRNP가 반응을 하게 한다.

Pre-mRNA 분자는 exon recognition을 repress하는 서열을 갖고 있다.

이를 exonic splicing silencer (ESS) 혹은 intronic splicing silencer (ISS)라고 한다.

예로 hnRNP 단백질은 ESS나 ISS에 결합하여 SR이 ESE에 결합하는 것을 막는다고 생각한다.

또한 splicing은 교과서 그림 17.39에서 보는 것처럼 전사가 되면서 동시에 splicing이 일어난다고 생각된다. 물론 전사 이후에 posttranscriptional process로도 진행 된다.