돼지 간세포를 이용한 체외 순환형 생인공간 개발
경북대학교 의과대학 외과학교실,
1신경 외과학교실
황
황윤윤진진,, 김김종종열열,, 장장수수근근,, 김김상상걸걸,, 김
김양양일일,, 황황정정현현11
Purpose: Acute fulminant hepatic failure (FHF) is associated with high mortality. Recent studies have shown that a liver support system based on viable hepatocytes can prolong life in animal models of FHF and also in some FHF patients who were successfully bridged to liver transplantation. To be applied in humans, the bioartificial liver (BAL) system should have sufficient liver cell mass to provide adequate bioactive support. The most widely investigated bioreactor at present is based on hollow fiber membrane. However, it is difficult to build a scaled- up module of this model. We devised a fluidized-bed bioreactor that is packed with isolated porcine hepatocytes, and these hepatcytes are immobilized in Ca-alginate hydrogel.
Methods: We isolated fresh porcine hepatocytes using a 2-step collagenase perfusion method, and they were suspended in 1.5% alginate solution. Through a drop-generator, this mixture was gelled in 135mM Cacl
2. The resulting spherical beads (mean size: 500 m) were embedded in a module. An average of 2x10
10hepatocytes were present in the module. The efficacy of our design was tested in pigs that had undergone total hepatic devascularization and portocaval shunt.
Results: The BAL-treated group showed a significantly lower ammonium build-up rate compared to the control group (598.6 344.2 g/dl vs 1937.6±744.1 g/dl, respectively, at 8 hours after connecting to BAL). In addition, the intracranial pressure was well controlled in the BAL-treated group, whereas the control group showed a progressive increase of the intracranial pressure (16.9 1mmH
2O vs 21.9±2.6mmH
2O, respectively, at 8 hours after connecting to BAL).
Conclusion: Our bioartificial liver system is a fluidized-bed bioreactor packed with immobilized porcine hepatocytes, and it seems to be a more effective scaled-up module.
Bioartificial Liver System using a Fluidized-Bed Bioreactor
Department of Surgery &
1Neurosurgery, Kyungpook National University, College of Medicine, Daegu, Korea
Key Words: Artificial Liver, Acute Liver Failure, Fluidized-bed 중심 단어: 인공간, 급성 간부전, 유동층 반응기
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11책임저자 황윤진
경북대학교 의과대학 외과학교실
대구광역시 중구 삼덕동 2가 50 경북대학교 병원 외과학교실
전화: 053-420-5618 FAX: 053-421-0510 E-mail: [email protected]
서 론
상실한 간 기능의 치료를 위해서 많은 연구가 진행되고 있 다. 심장, 폐, 신장 등의 장기가 단일한 기능을 수행하는 것 과는 달리 간은 탄수화물의 대사, 단백질과 요소의 합성, 아 미노산과 지방의 대사 및 약물의 생 변환, 노폐물의 제거 등 매우 다양한 기능을 수행하는 장기이다.@ 바이러스 감염이나 약물 중독에 따르는 전격성 간 질환 환자의 경우 발병으로 부터 10일 이내에 사망하는 것으로 보고되었으며 회복되어 생존하는 경우는 전체의 10-15%미만으로 알려져 있다.
현대 의학에서 가장 효과적인 간 부전 환자의 치료법으로는 간 이식수술을 들 수 있다1,2. 그러나 간 이식수술은 공여 장 기가 태부족이며 수술 대기 기간 동안 환자의 간 기능 유지 가 필수적인 점, 그리고 이식 수술 후의 면역 억제제 투여 등
의 문제를 수반하고 있다. 급성 간 부전 환자에 대한 간 이식 은 공여 장기가 즉시 필요한 경우가 많으며, 만성 간질환의 치료에 비해서 환자의 사망률이 상대적으로 높은 편이다. 또 한 간이식 수술을 위해 환자의 간 조직 전체를 절제하는 것 은 환자의 간 조직이 재생하여 회복되는 기회를 상실하게 된다. 따라서 언급된 간이식 수술 시 발생 가능한 여러 문제 들을 해결 가능한 보조 수단의 개발이 요구되었다. 이를 통 해 손상된 간 조직이 재생될 수 있는 회복기간을 환자에게 제공하거나, 간이식 수술 대기 중인 환자의 간 기능을 외부 에서 보조하는“bridge”의 역할을 수행하는 치료 수단을 개 발된다면 장기 이식 수술의 제약을 극복하는 한편, 급 만성 간 질환 환자의 생존율을 향상시킬 것으로 기대할 수 있다.
또한 전격성 간 부전과 같은 응급처치가 필수적인 질환들에 대한 대체 수단으로 간 기능 보조 기구의 개발은 현대 의학
※ 본 연구는 2004년도 경북대학교
신임교수 정착 연구비 도움으로 이루어
졌습니다.
의 중요한 과제로 대두되었다.
현재 세계적으로 가장 많이 연구 되는 인공간의 형태는 분 리한 간세포를 미립담체에 부착시키거나, 콜라젠 젤로 고정 화하여 중공사모듈 속에서 체외 배양 한 것을 이용한 것이 다. 이러한 방법은 단위 부피당 사용되는 간 세포의 수가 적 어서 집적도가 높은 간 세포 배양기 개발은 어려운 것으로 알려져 있으며 또한 간 세포와 환자의 혈장이 직접 접촉하 는 형태를 취하여 간 세포의 활성 및 생존률이 빠르게 감소 하는 것으로 알려져 있다.
이에 저자들은 간 세포와 혈장 간의 직접 접촉을 방지하여 면역 반응에 의한 인공 간의 효율 저하를 억제할 수 있고, 간 세포와 혈장 간의 물질 교환이 이루어지는 단위 부피 당 표 면적이 넓힐 수 있는 Ca-alginate hydrogel microcapsule 로 간 세포를 고정하여 충진식 반응기에 충진한 형식의 인 공간을 이용하여 간 부전을 유발한 돼지를 이용하여 그 효 용성을 알아 보았다.
실험 대상 및 방법
1
1.. 간간 세세포포의의 분분리리
평균 10kg(8.5-12kg)의 체중을 가진 암컷 돼지를 이용하 여 Seglen법을 응용한 collagenase perfusion법으로@간 세 포를 분리하였다.3전신 마취 하에서 적출된 간의 문맥으로 1mM EDTA를 첨가한 Krebs-Ringer's buffer (KRB, 154mM NaCl, 5.6@mM KCl, 25mM Na2HCO3, 5.5mM glucose, 20mM HEPES, pH 7.4) 를 간 정맥으로부터 배출 되는 용액이 맑아질 때까지 관류 후, 5mM CaCl2가 첨가된 0.05% collagenase (Type IV, Sigma) 용액을 간이 담황색 으로 부풀 때까지 관류하였다. 모든 관류 용액은 silicon tubing을 사용하여 5% CO2와 90% O2로 포화시킨 후, 열 교 환기를 통과시켜 37℃로 유지한 상태로 관류하였다.
충분히 분해된 간은 4℃로 냉각된 KRB에 담근 후 smooth cell scraper로 간 조직을 해체하여 세포 현탁액으로 만들었 다. 125μm 나일론 망으로 체 조직과 분해되지 않은 간 조 직을 걸러내어 단일 세포로만 구성된 세포 현탁액을 얻었다.
세포 현탁액은 20g로 5분 간 2회 원심 분리하여 세척하였 다.
정제된 간 세포는 KRB로 2회@세척한 후 배양액에 분산시켜 trypan blue exclusion법으로 세포의 생존도를 확인하였다.
본 연구에서는 평균 85-90%정도의 생존도를 보였다.
2
2.. 간간 세세포포의의 고고정정화화
회수된 간 세포는 별도의 배양 기간 없이 alginate 용액 1 ml당 9x106 개의 농도로 10x DMEM이 혼합된 1.5%
alginate 용액에 혼합하였다. 간 세포가 혼합된 alginate용액 을 hand-made drop generator (air flow rate 2.5l/min, needle 22G)를 이용하여 135mM CaCl2용액에 분사하여 구 형의 젤 (평균 지름 500μm)을 만들었다. 가교결합이 형성 되도록 20분간 방치 후 CaCl2용액을 제거하고 0.9% NaCl, 0.1% HEPES 용액으로 세척하였다. 만들어진 Ca-alginate 수용성 젤은 0.05% poly-L-lysine 용액으로 30분간 코팅 하였다. 다시 0.9% NaCl, 0.1% HEPES 용액으로 세척 후 0.15% alginate 용액에 5분간 담가 둔 후 용액을 제거하고 DMEM으로 세척하였다.
3
3.. 간간 부부전전 모모델델 돼돼지지
평균 30kg(28-32kg)의 체중을 가진 암컷 돼지 10마리를 대상으로 하였다. 구입한 돼지는 본 대학 의학 연구소 내 사 육실에서 1주일간 적응시킨 뒤 사용하였다. 적응 기간 내 식 이는 자유롭게 허용하였으며 실험 24시간 전부터는 금식시 켰다.
돼지에게 간 부전을 유발시키기 위해 30kg정도의 암퇘지에 ketamine 10mg/kg 근주 후 귓바퀴의 정맥으로@ thiopental 10mg/kg을 주사하고 내경 5.0-6.0mm의 기관 내 튜브를 삽관 하였다. Isoflurane(1%)-air-O2(FIO2=0.5)로 마취 유지하고 norcuron으로 근 이완을 시켰다.@ 전신 마취 하에 서 외경 정맥을 확보하여 수술 중 수액 투여(5% D/S, 10ml/kg/hour)와 채혈에 사용하였다. 수술 방법은 정중 절 개를 한 후 총수담관과 간동맥을 결찰 후 절단하고 간 문맥 을 잘 유리한 다음 상부에서 절단하고 자른 원위부는 결찰 한 후 근위부는 하대정맥과 5-0 prolene을 사용하여 단측 문합하였다. 문합 중 간문맥 차단으로 인한 위장관의 충혈을 방지하기 위해 일시적으로 상장간막 동맥을 혈관 겸자로 차 단하였다. 간으로의 측부 혈행을 차단하기 위해 모든 간 인 대를 절단하고 복강 내 출혈을 확인한 다음 복벽을 닫고 수 술을 마쳤다. 그 중 6마리에서는 두개 내 뇌압(intracranial pressure, ICP)을 측정 하기 위해 측두골에 구멍을 낸 뒤 뇌 실 내로 실리콘 튜브(7.5 F ventricular catheter, Sewoon Medical Company, Seoul, Korea)를 삽입하였다. 술 후 수 액요법은 사망할 때까지 5% D/S를 5ml/kg/hour의 속도로 계속 주입하였다.
4
4.. 체체외외순순환환계계 연연결결
돼지의 경 정맥으로 삽입된 삽입관(dual lumen catheter) 을 통해 혈액을 체외 순환계와 연결, 순환시켰다. 혈액은 50 ml/min의 속도로 혈장 분리기(plasauto 2500, Asahi medical Co.)로 유입되었다. 혈장 분리기로부터 분리된 혈 장은 혈구와 분리되어 17ml/min의 속도로 reservoir bag에 저장되었다. 실험군(n=5)에서는 고정화된 간세포를 0.9%
NaCl로 세척 후 인공간 모듈(내경 100mm, 높이 250mm,
F
Fiig gu urre e 1 1.. Design of fluidized bed bioreactor connected with extracorporeal circuit system through plasma separator.
F
Fiig gu urre e 2 2.. The serum ammonia level of control group increased progressively after hepatic devascularization. However, the increase of serum ammonia in BAL-connected group was arrested.
F
Fiig gu urre e 3 3.. The increase of the ICP in control group was progressing, while the increase of ICP in BAL-connected group was arrested.
결 과
1
1.. 생생존존 시시간간
간 유입 차단 후 실험군에서는 평균 18.3±7.52시간(7.5- 26시간) 생존 하였으며 대조군에서는 16.4±8.5시간(6.2- 24.4시간)으로 양 군간 차이가 없었다.
2
2.. 혈혈 중중 암암모모니니아아 수수치치의의 변변화화
혈 중 암모니아 수치는 대조군에서는 체외 순환계에 연결 working volume 1.5L)내에 충진 하였으며 대조군(n=5)에 서는 간세포가 포함되어 있지 않은 alginate 구상체를 같은 양 충진 하였다. 인공간 모듈은 heating tape로 감싸 37℃로 유지하였다. 유입되는 혈장은 oxygenator를 거쳐 90% O2, 5% CO2로 포화시켰다. plasma reservoir bag으로부터 관 류되는 혈장의 관류 속도는 90ml/min으로 조정하였다.
2x1010개의 간세포가 충진된 인공간 모듈에서 반응한 혈장 은 혈구와 혼합되어 돼지의 경 정맥으로 주입시켰다.(Fig.
1) 5
5.. 간간부부전전 지지표표의의 측측정정
인공간 모듈의 효용성을 알아 보기 위해 간부전 모델을 만 든 지 2시간 후에 실험군에서는 간 세포가 포함된 인공간 모 듈이 있는 체외 순환계와, 그리고 대조군에서는 간세포가 포 함되어 있지 않은 모듈을 포함한 체외 순환계와 연결하였으 며 연결 후 2시간 마다 혈중 암모니아 수치와 ICP의 변화를 측정하여 기록하였다.
6 6.. 통통계계
실험군과 대조군의 혈중 암모니아 수치와 ICP를 평균값과 표준편차로 표시하였으며 결과의 차이를 SPSS (version 14.0, SPSS, Chicago, Illinois, USA) 통계 프로그램을 이용 하여 Mann-Whitney 검정을 시행하여 비교하였다.
한 뒤에도 계속적인 상승을 보였으나 인공간 모듈이 연결된 실험군에서는 유의하게 증가 속도가 완만 하였다(598.6±
344.2μg/dl vs 1937.6±744.1μg/dl at 8 hours after connecting to BAL, p=0.009) (Fig.2).
3
3.. IICCPP의의 변변화화
ICP는 대조군에서는 체외 순환계에 연결한 뒤에도 계속적 인 상승을 보였으나 인공간 모듈이 연결된 실험군에서는 유 의하게 증가 속도가 완만하였다.(16.9±1mmH2O vs 21.9
± 2.6mmH2O at 8 hours after connecting to BAL,p=0.05) (Fig.3)
고 찰
복잡한 간 기능을 대체하기 위하여서는 단순한 기계적 장 치 만으로는 부족하고 간 세포가 포함된 반응기가 필요한 것으로 의견이 모아지고 있다. 현재까지 연구 중인 인공간
장치는 전형적으로 환자의 혈액을 체외로 유도하여 heparin 혹은 citrate 등으로 항 응고 처리를 한 다음 혈액 그대로 혹 은 혈장 분리기를 이용하여 분리된 혈장을 다양한 cell line 에서 획득된 간 세포가 포함된 여러@design의 bioreactor에 통과 시켜 처리한 다음 환자에 되돌려 주는 형식을 취하고 있다. 여기서 연구자 간의 쟁점이 되는 것들은 어떠한 cell이 적합할지, 얼마만큼의 cell mass가 있어야 될지, bioreactor 내의 간 세포가 고유의 기능을 어떻게 안정적으로 오래 유 지 시킬지, 그리고 어떠한 bioreactor의 디자인이 효과적일 지 등이다.
이상적인 인공간에 필요한 간 세포는 인간에서 유래된 세 포로 암세포 등에서 transform 되지 않은 정상적인 phenotype를 가지고, 쉽고 빨리 고농도로 배양될 수 있으며 오래 동안 간 세포 고유의 기능을 유지할 수 있는 것이나 현 재까지 이러한 것을 모두 만족시키는 간 세포는 존재하지 않는다.
돼지 간세포는 비교적 인간과 비슷한 생리적 기능을 보이며 면역 반응도 비교적 적고 쉽고 값싸게 많은 양의 간 세포를 구득할 수 있어 현재까지 가장 많이 연구되고 있다. 그러나 이것은 virus 전파와 인간과 다른 면역 체계가 문제가 되고 있다. 인간의 간 세포는 이론적으로 이상적이며 태아 조직, 외과적으로 절제된 간, 그리고 뇌사자의 간 등에서 획득할 수 있으나 그 양이 아주 제한적이며 오염되기 쉽고 신선한 상태로 오래 보관하는데 기술적으로 어려움이 많고 배양 중 그 고유의 기능을 빨리 상실하는 단점이 있어 아직까지 널 리 사 용 되 지 않 고 있 다 . 인 간 의 hepatoma 혹 은 hepatoblastoma에서 유래된 Hep G2와 C3A 등의 cell은 쉽 고 비교적 값싸게 구할 수 있고 배양도 잘 되는 장점이 있어 여러 연구자가 사용 중에 있으나 정상적인 간세포보다 간 고유의 기능이 떨어져 있고 악성 세포의 누출이 걱정되어 임상적으로 적용하기에는 풀어야 할 난점이 있다.4 향후 xenogenic antigen을 제거한 동물의 간세포나 인간의 blastocyst-derived, pluripotential embryonic stem cell 에서 유래된 간세포들이 또 하나의 해결책을 제시할 것으로 생각된다.
간 이식에 의한 간 질환의 치료는 상실한 간 기능의 가장 적 절한 대체로 공여 장기의 확보의 어려움과 이식 장기의 면 역 거부 반응, 수술 대기 기간 동안 환자의 생명 유지 등이 당면한 문제들이다. 생체에서 분리한 간세포를 생 촉매로 이 용하는 생물 반응기에 의한 체외 순환형 인공간은 간이식 수술 대기 중인 환자나 일시적인 간 손상에 대한 간 기능 보 조 기구로서 개발이 진행 중이다. 체외 순환형 기구는 궁극 적인 간 기능 대체 수단보다는 일시적인 보조 수단으로서 간 부전 환자의 생명 유지 장치로 개발되고 있으며, 생체고
분자와 간 세포를 이용한 간 조직의 체외 재구성은 연구 초 기 단계이며 체내 이식된 재구성 조직에 대한 면역 반응과 이식된 간 세포의 영양 및 노폐물 교환이 원활히 이루어지 도록 해야 하는 어려움이 있다. 체외 순환형 인공 간 보조 기 구에 대해서는 많은 연구가 이루어지고 있다. 현재 가장 많 이 연구 되어지고 있는 형태는 분리한 간 세포를 미립담체 에 부착시키거나, 콜라젠 젤로 고정화하여 중공사모듈 속에 서 체외 배양 한 것을 이용한 것이다.5-7이러한 방법은 단위 부피당 사용되는 간 세포의 수가 적어서 집적도가 높은 간 세포 배양기 개발은 어려운 것으로 알려져 있으며 또한 간 세포와 환자의 혈장이 직접 접촉하는 형태를 취하여 간 세 포의 활성 및 생존률이 빠르게 감소하는 것으로 알려져 있 다. 또한 중공사모듈 내의 반 투과막은 그 자체가 물질 이동 의 장애로 작용하게 되는 단점이 있다.
일부 연구자들은 인공 간 모듈 내의 간 세포가 혈장과 직접 접촉하면서 유발되는 면역 반응과 독성 물질에 대한 피해를 감소시키기 위하여 반투과성 막을 형성하는 고분자물질로 간 세포를 고정화하는 방법을 연구 하였다.8,9Fremond 등10 은 고분자로 고정화된 간 세포로 혈장을 관류하는 형식의 체외 순환형 인공간을 연구 중이며, Dixit 등11은 poly-L- lysine으로 코팅된 Ca-alginate hydrogel microcapsule로 간 세포를 고정하여 충진식 반응기에 충진한 형식의 인공간 을 간 부 전 동 물 모 델 에 적 용 하 여 alanine aminotransferase, bilirubin 이 정상치로 유지되는 것을 보 고하였다. 이러한 Hemoperfusion 방식의 인공 간 장치는 hemodialysis방식인 중공사 모듈을 이용한 인공 간 장치보 다 간세포와 혈장 간의 직접 접촉을 방지하여 면역 반응에 의한 인공 간의 효율 저하를 억제할 수 있고, 간 세포와 혈장 간의 물질 교환이 이루어지는 단위 부피 당 표면적이 넓다 는 장점이 있다. 단위 면적의 증가에 따른 물질 교환 증진은 간 세포의 배양을 원활하게 하여 효율적인 인공 간 모듈의 설계가 가능할 것으로 기대되고 있다.11
본 연구에서는 poly-L-lysine으로 코팅된 Ca-alginate hydrogel microcapsule로 돼지 간세포를 고정하여 충진식 반응기에 충진한 형식의 인공간을 돼지 간 부전 모델에 적 응해 보았다. alginate hydrogel로 고정화된 간 세포의 암모 니아 처리능과 요소의 생성능을 검토한 연구는 그 효능성을 발표한 바 있으며 다른 연구자들의 결과와 일치하였다.12,13,14 Ca-alginate hydrogel microcapsule 표면의 구멍의 크기 는 10nm에서 200nm 사이로서 분자량이 큰 면역 세포는 통 과하지 않는 반면 산소 및 대사 물질의 교환에는 지장이 없 는 것으로 알려져 있다. 또한 microcapsule의 크기를 평균 지름 300μm로 하고 유동층 반응기 형태로 만들어 혈장과 의 접촉 면적을 최대화 하였다. 이러한 인공간을 이용한 본
실험 결과 대조군에 비해 혈 중 암모니아 수치의 증가와 두 개 내 뇌압의 증가 속도가 현저하게 떨어진다는 결과를 얻 어 효과적인 인공간으로 생각된다.
결론
본 연구에서 poly-L-lysine으로 코팅된 Ca-alginate hydrogel microcapsule로 돼지 간세포를 고정하여 충진식 반응기에 충진한 형식의 인공간을 돼지 간 부전 모델에 적 응해본 바 대조군에 비해 혈 중 암모니아 수치의 증가와 두 개 내 뇌압의 증가 속도가 현저하게 떨어진다는 결과를 얻 었다. 따라서 이러한 형태의 인공간은 세포의 집적도가 높고 환자의 혈장과 면역적으로 격리된 효율적인 인공간을 만드 는데 기대가 된다.
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참 고 문 헌
