LPS로 유도된 RAW264.7 Cell과 마우스모델에 대한 잘피 에탄올 추출 물의 항염증 효과
김민지1, 배난영2, 김꽃봉우리1, 박지혜2, 박선희2, 조영제3, 안동현2*
Anti-inflammatory Effect of Zostera marina Ethanolic Extract on LPS- induced RAW264.7 Cells and Mouse Model
Min-Ji Kim1, Nan-Young Bae2, Koth-Bong-Woo-Ri Kim1, Ji-Hye Park2, Sun-Hee Park2, Young-Je Cho3, and Dong-Hyun Ahn2*
Received: 22 June 2015 / Revised: 19 August 2015 / Accepted: 21 August 2015
© 2015 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
Abstract: The Zostera marina ethanolic extract (ZMEE) was tested in this study to investigate the anti-inflammatory activ- ity in LPS-induced RAW 264.7 cells and mouse model. Nitric oxide production and inducible nitiric oxide synthase expres- sion in cells treated with ZMEE was reduced significantly in a dose-dependent manner. Similarly, the secretion of pro-inflam- matory cytokines such as interleukin (IL)-6, IL-1β, and TNF- α was inhibited markedly. In addition, the expression of nuc- lear factor kappa B (NF-κB) and the phosphorylation of JNK, ERK, and p38 MAPKs was suppressed by ZMEE as well. In vivo test, ZMEE attenuated the croton oil-induced mouse ear edema and there were no mortalities in mice administered 5,000 mg/kg body weight of ZMEE during the observation periods.
The results in photomicrograph of mice ear tissue showed the reduction of dermal thickness and the number of infiltrated mast cells. These results indicate that ZMEE inhibits the pro-
duction of LPS-induced pro-inflammatory mediators, sugge- sting that ZMEE may be a potential material for anti-inflam- matory therapies.
Keywords: Zostera marina, Anti-inflammation, Ear edema, Nuclear factor kappa B, MAPKs
1. INTRODUCTION
염증반응은 내독소, 조직손상, 세균 감염 등과 같은 자극에 대한 손상부위를 복구시키려는 방어 기능으로 손상된 조직 을 재생하기 위해 일어나는 필수적인 반응이다 [1]. 그러나 지속적인 염증반응은 통증, 발열, 부종 등과 같은 기능장애 및 점막손상을 유발하며 관절염 및 암 등의 발병을 초래하게 된다 [2]. 대식세포 (macrophage)는 다양한 숙주반응에 있어 항상성 유지에 관여하며, 염증반응 시에는 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-6, IL-1β 등의 pro-inflam- matory cytokine을 비롯하여 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2)와 같은 효소의 발현을 통해 nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2)를 생성함으 로써 염증반응을 유발하고 염증 부위로 면역세포의 이동을 촉진시킨다 [3]. NO는 높은 반응성을 가진 생체 생성분자로 써 활성화된 iNOS에 의해 L-arginine으로부터 생성된다 [4]. NO 의 발현과 pro-inflammatory cytokine의 생산은 주로 nuclear factor kappa B (NF-κB)와 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)를 통해 일어난다 [5,6]. NF-κB는 핵 안으로 들어가
1부경대학교 수산과학연구소
1Institute of Fisheries Sciences, Pukyong National University, Busan 619-911, Korea
2부경대학교 식품공학과/식품연구소
2Department of Food Science & Technology/Institute of Food Science, Pukyong National University, Busan 608-737, Korea
Tel: +82-51-629-5831, Fax: +82-51-629-5824 e-mail: [email protected]
3경북대학교 식품공학부
3School of Food Science of Biotechnology, Kyungpook National Uni- versity, Daegu 702-701, Korea
연구논문
전사인자로서 염증매개관련 효소 (iNOS, COX-2) 및 염증매 개성 cytokine을 합성하며, 일반적으로 세포질에서 IκBα와 결합함으로써 NF-κB의 활성이 억제된다 [7]. MAPKs는 주요 하게 3가지 인자로 extracellualr signal-regulated kinase (ERK), c-jun NH2-terminal kinase (JNK), p-38로 구성되며, MAPKs의 활성은 대식세포에서 NO의 생성과 pro-inflammatory cyto- kine의 발현을 초래한다 [8]. 따라서 NF-κB 및 MAPKs의 활 성을 억제하여 염증성 매개인자들의 생산 감소에 영향을 주 는 것은 염증반응을 조절하기 위한 핵심요소로서 이러한 활 성을 가지는 천연소재를 찾기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
여러 가지 천연소재 중에서 해조류는 현재 많은 연구들로 부터 항균 [9], 콜레스테롤 침착 방지 [10], 고지혈증 개선 [11]
등의 다양한 생리활성이 보고되고 있으며, 갈조류로부터 fu- coxantin, fucosterol, phlorotannin과 같은 저분자 생리활성 물 질이 보고되고 있다 [12,13]. 다양한 해조류 중 잘피 (Zostera marina)는 한국연안에서 가장 풍부한 해조류 중 하나로 제주 도를 포함한 전 연안에 고르게 분포하고 있다 [14]. 잘피에 대 한 연구로는 잘피속에 속하는 애기거머리말 (Zostera japon- ica)의 항산화활성, 항염증 및 암세포 증식 억제 효과 [15-17], 왕거머리말 (Zostera asiatica)의 인체 암세포에 대한 세포독 성 효과 [18]에 대한 것이 보고되고 있으나, 지금까지 우리나 라에 서식하는 잘피에 대한 생리활성에 대한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 잘피의 또 다른 생리활성인 항염증 효과를 확인하기 위해 대식세포주인 RAW264.7 cell 과 귀 부종을 유발한 마우스 모델을 이용했으며, 앞으로 항염 증제 개발의 새로운 천연원료로서의 활용 가능성을 탐색하 고자 했다.
2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 실험 재료
본 실험에 사용한 잘피 (Z. marina)는 2013년도 부산 연화리 에서 채취하였으며 이를 담수로 깨끗이 수세하고 동결 건조 한 후 분말화하고 진공 포장하여 -20oC에서 저장하며 사용하 였다.
2.2. 에탄올 추출물 제조
잘피 건조 분말에 10배의 95% 에탄올을 가하고, 교반기 (H- 0820, Dongwon Science CO., Busan, Korea)를 이용하여 24시 간 동안 상온에서 교반하여 추출하였다. 원심분리기 (UNION 32R, Hanil Co., Incheon, Korea)를 이용하여 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취하였고, 이후 남은 잔사를 이와 동일한 방법으로 2회 반복 추출하였다. 추출한 상층액 은 37oC에서 감압농축기 (RE200, Yamoto Co., Tokyo, Japan) 로 농축하였으며, 농축하여 건조된 시료는 -20oC에서 보관하 며 실험에 이용하였다.
2.3. 실험 동물
ICR 마우스 (생후 8주령, 수컷)을 오리엔트바이오 (Orient Co., Seongnam, Korea)로부터 구입하여 귀 부종 및 귀 조직 실험 에 사용하였으며, 단기 독성 평가 실험을 위해 Balb/c 마우스 (생후 10주령의 암컷)를 사용하였다. 마우스는 온도 20±2oC, 습도 50±10%, 12시간 명암주기가 유지되는 동물실에서 1주 일간 예비 사육한 후 실험에 사용하였다. 본 실험은 부경대학 교 동물실험윤리위원회로부터 동물실험 승인을 (승인번호 2014-01) 받아 수행하였다.
2.4. 세포배양
한국세포주은행으로부터 대식세포인 RAW264.7 (KCLB 40 071) 세포를 분양 받아 사용하였으며, DMEM (GIBCO, Grand Island, NY, USA)에 10% inactivated fetal bovine serum (Hy- Clone Laboratories, Inc., Logan, Utah, USA)과 1% penicillin- streptomycin (HyClone Laboratories, Inc.)을 첨가한 배지를 배 양액으로 37oC, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 실험과정의 모 든 세포는 80~90% 정도의 밀도로 자랐을 때 계대배양하였 고, 20 passages를 넘기지 않은 세포만 사용하였다.
2.5. 세포 독성 평가
추출물의 세포독성을 평가하기 위해 MTT assay를 실시하였 다. RAW264.7 cell (1×106 cells/mL)를 well plate에 분주하고 20시간 전 배양 후, 추출물을 농도별 (0.1, 1, 10, 50, 100 µg/
mL)로 첨가하여 37oC, 5% CO2 incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 22시간 배양하였다. 배양 후, 5 mg/mL 농 도의 MTT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 시약을 첨가하여 2시간 재배양하고 이를 4oC, 2,000 rpm에서 10분간 원심분리 (UNION 32R, Hanil Co.)하여 상층액을 제거하였다.
그 후, 각 well에 DMSO (Sigma Chemical Co.)를 첨가하고 이 를 microplate reader (Model 550, Bio-rad, Richmond, CA, USA) 를 이용하여 540 nm에서 흡광도 (optical density (O.D.))를 측 정하였다. 세포증식능은 다음 식에 의해 계산하였다.
Proliferation Index (%) = sample 흡광도 / control 흡광도 × 100
2.6. NO 생성량 측정
NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess 반응을 이용하 여 측정하였다 [19]. RAW264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하 여 2.5×105 cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고 5%
CO2 incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 20시간 전 배양하였다. 세포에 1 µg/mL의 lipopolysaccharide (LPS)와 0.1, 1, 10, 50, 100 µg/mL의 추출물을 처리하여 24시간 재배 양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후, 동량의 griess 시약 (1%
sulfanilamide + 0.1% naphthylendiamine dihydrochloride, 1:1)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시키고, microplate reader (Mo- del 550)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite (NaNO2)의 농도별 표
준곡선과 비교하여 산출하였다.
2.7. Pro-inflammatory cytokines 분비량 측정
세포배양액 내의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β cytokine의 분비량을 ELISA kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, San Diego, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 이를 위해 ELISA microplate 에 capture antibody로 anti-mouse TNF-α, IL-6 및 IL-1β를 분 주하여 4oC에서 하룻밤 동안 coating시켰다. 이를 0.05%
Tween 20이 포함된 PBST로 세척하고 10% FBS 용액으로 blocking 하였다. PBST로 세척한 뒤, 각 microplate에 NO를 측정 하였던 것과 동일한 배양 상층액을 분주하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 뒤 희석한 biotiny- lated anti-mouse TNF-α, IL-6 detection antibody와 streptavi- din-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 실온에서 1 시간 반응시켰다. IL-1β의 경우, biotinylated anti-mouse IL- 1β detection antibody를 첨가하고 1시간 반응 후, streptavidin- horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 30분 반응시켰 다. 그 후, 이를 다시 PBST로 세척한 다음, OPD 용액을 첨가 하여 실온에서 30분 동안 암반응시켰다. 2 N H2SO4로 반응 을 종료시킨 후, microplate reader (Model 550)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2.8. Western blot 분석에 의한 단백질 분석
배양이 끝난 세포를 수집하여 3회 PBS (phosphate buffered saline)로 세척한 후, lysis buffer [50 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoxycholate, 5 mM phenyl- methylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 µg/mL aprotinin, 1% Triton X-100, and 0.1% NP-40]를 첨가하여 30분간 4oC에서 lysis 시 킨 후, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 세포막 성분 등 을 제거하였다. 단백질 농도는 BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 정량하였으며, 30 µL의 lysate 를 10% SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질은 polyvi- nylidene difluoride membrane (PVDF, Bio-rad)에 70 mA에서 1시간 30분 동안 전사시킨 후, 5% skim milk가 포함된 TBSS (tris buf- fered saline; pH 7.5) 용액으로 상온에서 2시간 동안 blocking하였다. iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현 양을 검토하 기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS, COX-2 및 NF-κB (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA)를 사용하였으며, MAPKs의 발현량을 알아보기 위해 anti-mouse JNK, ERK 및 p38 (Cell Signalling Technology Inc., Denvers, MA, USA) 항 체를 사용하여 1:500으로 희석해서 사용하였다. 각각 상온에 서 2시간 반응시킨 후 TBSS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 horse radish peroxidase (HRP)가 결합된 anti-mouse IgG 및 anti-rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 1:2,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, TBSS로 3회 세정하 여 ECL (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 기질과 1~3분 간 반응한 후 각각의 단백질 밴드는 Gene tool (Syngene soft- ware, Synoptics Ltd, Cambridge, UK)를 이용하여 가시화 및 정량하였다.
2.9. 귀 부종 측정 및 조직 관찰
귀 부종 측정을 위해 ICR 마우스에 추출물을 10, 50 및 250 mg/kg · body weight 농도가 되도록 200 µL씩 단회 경구 투여 하고 한 시간 후, 오른쪽 귀에 2.5% croton oil (Tokyo Chem- ical Industry Co. LTD., Tokyo, Japan)을 20 µL/ear씩 도포하였 다. 귀 두께는 croton oil을 처리하고 5시간 후에 측정하였으 며 croton oil 처리한 후 두께의 증가를 부종의 형성으로 간주 하였다. 귀 조직 관찰은 ICR 마우스의 오른쪽 귀에 추출물을 100 mg/mL 농도로 20 µL씩 도포하고 15분 뒤, 5% croton oil 을 20 µL씩 도포하였다. 6시간 뒤, diethylether로 마취시키고, 귀 조직을 절제하여 10% formaldehyde에 72시간 고정하였 다. 고정 후 파라핀 블록을 만들어 박편을 제조하고 hemato- xylin-eosin 및 toluidine-blue 염색을 하여 조직을 관찰하였다.
2.10. 단기 독성 평가
Balb/c 마우스를 실험 시작 전에 4~6시간 정도 절식시킨 후에 추출물을 300, 2,000 및 5,000 mg/kg · body weight로 경구 투 여 하였다. 6시간 동안 비정상적인 행동 등의 경과를 관찰하 였고 2주까지 지속적으로 관찰하였다.
2.11. 통계처리
모든 실험 결과에 대한 유의차 검정은 SAS software (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA)에서 평균값을 분산분석한 후, Duncan's multiple range test법에 따라 p<0.05 수준에서 검정 하였다.
3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 세포 독성 평가
추출물이 대식세포에 미치는 독성을 평가하기 위해 RAW 264.7 세포 (1×106 cells/mL)에 추출물을 처리하여 24시간 배 양한 후 MTT assay를 수행하였다. 추출물을 0.1, 1, 10, 50 및 100 µg/mL의 농도로 첨가하여 배양한 결과, 세포의 생존율 은 모든 처리 농도에서 유의적인 차이를 보이지 않음을 관찰 하였다 (Fig. 1). 따라서 세포독성으로 인해 RAW264.7 세포 가 사멸되는 것이 아님을 확인 한 후 실험을 진행하였다.
3.2. NO 생성 억제 효과
NO는 피부손상 및 노화의 주요원인이 되며 매우 불안정한 화합물로서 LPS와 같은 염증유발물질에 의한 과도한 증가 는 염증을 유발하고 조직의 손상을 초래한다 [20]. 따라서 추 출물 처리에 의한 NO 생성 억제 효과를 측정하기 위해 RAW 264.7 세포를 LPS로 활성시킨 후, 추출물을 각 농도별로 (0.1, 1, 10, 50 및 100 µg/mL) 첨가하고 생성 된 NO를 griess 시약 을 이용하여 측정하였다. 그 결과 (Fig. 2), 추출물을 처리하였 을 경우, NO 생성량이 LPS 처리구 보다 농도의존적인 감소 를 보임을 확인하였다. 특히 50 µg/mL 이상의 농도로 추출물 을 처리하였을 때 그 분비량이 LPS 처리구보다 50% 이상 감
소함을 보여 탁월한 NO 생성 억제 효과를 확인하였다. 본 연 구결과는 김 등 [21]의 모자반 에탄올 추출물의 항염증 효과 에서 NO 생성량이 50 µg/mL 및 100 µg/mL에서 50% 이상 감 소한 연구결과와 유사하다. 또 다른 연구에서 강 등 [22]은 같 은 실험조건에서 다시마 뿌리 에탄올 추출물을 100 µg/mL 처 리 시 약 28%의 NO 생성 억제 효과를 보인다고 보고했으며, 이와 비교해보았을 때 본 연구에 사용된 잘피 에탄올 추출물 이 탁월히 높은 NO 생성 저해능을 가진다고 사료된다.
3.3. Pro-inflammatory cytokine 생성 억제 효과
Pro-inflammatory cytokine은 염증 면역 반응에서 필연적으로 동반되는 매개물로서 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병 리적인 조건 하에서 그 발현 정도가 증가되며, 피부염증 및 암 발생 등에서 중요한 역할을 한다. 대표적인 pro-inflamma- tory cytokine으로는 TNF-α, IL-6 및 IL-1β가 있다 [23]. LPS에 의해 자극된 RAW264.7 세포는 종양괴사 인자인 TNF-α를 생 성하며, 분비된 TNF-α 및 LPS는 IL-6와 IL-1β의 생성을 유도 Fig. 1. Effect of Zostera marina ethanolic extract on the prolifera-
tion of RAW264.7 cells. Proliferation index (%) = (sample O.D./
control O.D.)×100. ND : not significantly different.
Fig. 2. Inhibitory effect of Zostera marina ethanolic extract on the production of nitric oxide in LPS-induced RAW264.7 cells. a-fMeans with different superscript are significantly different (p<0.05).
Fig. 3. Inhibitory effect of Zostera marina ethanolic extract on the production of TNF-α (A), IL-6 (B), and IL-1β (C) in LPS-induced RAW 264.7 cells. a-gMeans with different superscript are significantly different (p<0.05).
하여 NO 생성과 국소염증을 발행시킴으로써 염증 반응을 지 속시키게 된다 [24,25]. 따라서 허 등 [26]은 초기 면역 반응과 염증단계에서 중요한 역할을 하는 pro-inflammatory cytokine 의 저해를 통해 염증반응을 조절할 가능성이 높다고 보고하 였다. 본 연구에서는 잘피 추출물이 pro-inflammatory cytok- ine의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 RAW264.7 세 포에 LPS처리 후 추출물을 농도별로 처리하여 ELISA 방법 으로 측정하였다. 그 결과 (Fig. 3A-C), LPS 자극에 의해 유도 되는 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성이 농도의존적으로 유의적 감소를 보였다. 특히, TNF-α의 경우 추출물을 1 µg/mL 이상 처리하였을 경우 LPS 단독 처리 비교 시 약 56% 분비량 감소 효과를 보였으며, IL-6 및 IL-1β의 경우에는 추출물을 각각 50 및 10 µg/mL 농도로 처리하였을 때 그 분비량이 50% 이 상 현저히 감소함을 나타냈다. 이는 잘피 에탄올 추출물이 RAW 264.7 세포에서 염증성 cytokine을 효과적으로 억제하 여 항염증 효과에 관여하는 것을 의미한다.
3.4. 잘피 에탄올 추출물의 iNOS, COX-2, NF-κB 발현 억 제 효과
체내에 염증반응이 일어나게 되면 관련 세포에서 iNOS의 발 현이 증가하여 다량의 NO가 생성되며 이는 유전자 변이, 신 경손상, 조직손상 등과 함께 혈관투과성을 증가시켜 부종 등 의 염증 반응을 촉진시킨다 [27]. 또한, COX-2는 염증 매개 물질인 PGE2의 형성에 관여하며 [28], NF-κB는 염증반응과 관련된 유전자의 promoter에 결합하며 cytokine 및 LPS 등에 의해 활성화되어 COX-2 및 iNOS 발현에 관여하는 것으로 알려져 있다 [29]. 따라서 이들 매개인자 (iNOS, COX-2 및
NF-κB)의 발현량에 미치는 추출물의 항염증 효과를 확인하 였다. RAW264.7 세포에 추출물을 0.1~100 µg/mL 농도로 처 리하고 각 단백질의 발현량을 측정한 결과 (Fig. 4), LPS 단독 처리구에 의해 각 단백질의 발현량이 현저히 증가하였으나, 추출물을 처리하였을 때 그 발현량이 농도 의존적으로 감소 하는 것을 확인할 수가 있었다. 특히 50 및 100 µg/mL 농도에 서 PBS 처리구와 유사한 발현량을 보여 우수한 항염증 효과 를 가짐을 확인하였다. 또한, iNOS의 단백질 발현 감소 결과 는 iNOS의 활성화로부터 생성되는 NO의 분비량 감소 결과 (Fig. 2)와도 관련이 있음을 나타냈다. 이러한 결과를 바탕으 로 볼 때, 잘피 추출물은 NF-κB의 활성 억제를 통해 COX-2 및 iNOS 발현을 억제함으로써 PGE2와 NO의 생성을 저해함 에 따라 항염증 효과를 나타낸다고 사료된다.
3.5. 잘피 에탄올 추출물의 MAPKs 발현 억제 효과 MAPKs (ERK, JNK, p-38)의 활성은 인산화에 의해서 나타나 며 대식세포에서 NF-κB의 활성화에 중요한 역할을 한다고 보고되어져 있다 [30]. 따라서 인산화된 MAPKs의 발현량을 western blot으로 분석한 결과 (Fig. 5), LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 p-ERK 및 p-p38의 발현이 잘피 에탄올 추출 물 처리에 의해 농도의존적으로 감소하였으며, 특히, p-p38 의 발현이 확연히 억제됨을 확인 하였다. p-JNK의 발현은 잘 피 추출물 50 및 100 µg/mL 농도에서 약간 감소하였다. LPS 는 MAPKs와 NF-κB를 활성화시켜 NO 및 pro-inflammatory cytokine을 생성시킴으로써 염증 반응에 관여한다. 따라서 본 연구의 결과를 종합해 볼 때, 잘피 추출물의 염증매개성 물질의 감소 효과는 NF-κB의 활성화 및 MAPKs 인산화 억제
Fig. 4. Effect of Zostera marina ethanolic extract (ZMEE) on LPS-induced iNOS, COX-2, and NF-κB p65 expression in LPS-induced RAW246.7 cells. The levels of iNOS, COX-2 in the cytosolic protein and the p65 subunit of NF-κB in nuclear protein were determined by a western blot analysis. RAW264.7 cells were treated with the indicated concentrations of ZMEE (0.1, 1, 10, 50, and 100 µg/mL) and LPS (1 µg/mL) for 18 h or 30 min and the proteins were detected using specific antibodies.
로 인한 항염증 효과로 사료된다.
3.6. 귀 부종 억제 효과 및 조직 관찰
피부 염증에서 일어나는 대표적인 반응으로 혈관확장, 부종 등의 생리 현상이 있으며, 이는 외부 환경에 의한 손상된 부 위를 복구시키려는 일련의 생체 과정이다 [31]. 또한, mast cell은 세포질 내 과립을 풍부하게 가진 면역세포로서 외부 자극으로부터 활성화된 mast cell은 프로테아제나 히스타민 등과 같은 혈관확장 물질들을 분비하며 다양한 pro-inflam- matory 매개물질들의 분비를 자극한다 [32]. 따라서 염증반응 의 하나인 부종에 대한 잘피 에탄올 추출물의 부종 완화 효과 및 조직 내의 mast cell 침윤 억제 효과를 확인하기 위해 동물 실험을 진행하였다. 먼저, 현재 사용되고 있는 합성 스테로이 드제인 prednisolone은 10 및 50 mg/kg · body weight로, 잘피 에탄올 추출물은 10, 50 및 250 mg/kg · body weight가 되도록 200 µL씩 단회 경구투여 한 후, croton oil로 염증을 유발하고 귀 두께를 측정하였다. 그 결과 (Fig. 6), control과 비교하여 모든 농도에서 유의적으로 귀 두께가 감소한 것을 확인하였 다. 특히, 추출물 250 mg/kg · body weight 처리구에서 positive control인 prednisolone 처리구와 비교하였을 때, prednisolone 10 mg/kg · body weight 처리구와 유사하게 감소함을 보였다.
추출물의 귀 부종 억제 효과는 조직 관찰 결과에서도 나타났 는데, croton oil로 부종을 유발한 마우스 귀 조직에서 croton oil만을 처리한 경우에 비해 추출물을 100 mg/mL 농도로 처 리한 경우 경피 및 진피 두께가 얇아진 것을 확인하였다 (Fig.
7A). 또한, toluidine-blue 염색을 통해 조직 내 mast cell 침윤 정도를 확인한 결과 (Fig. 7B), 추출물의 처리가 조직 내 mast cell 침윤을 현저히 억제함을 보였다. 본 연구 결과는 잔가시
에탄올 추출물의 항염증 효과에서 추출물 250 mg/kg · body weight 처리구에서 대조구인 prednisolone 50 mg/kg · body weight로 처리했을 때와 비슷한 귀 두께 감소 및 조직학적 변 화를 보인 연구결과와 유사하다 [33]. 또 다른 연구결과에서 김 등 [34]은 비틀대 모자반 에탄올 추출물의 항염증 효과에 서 추출물 250 mg/kg 처리구에서 약 46% 귀 부종 완화 효과 를 보고한 바 있으며, 정 등 [35]은 외톨개 메탄올 추출물이 미치는 귀 부종 완화 및 조직학적 변화 관찰 결과 추출물 250 mg/kg 처리구에서 약 24% 귀의 부종이 완화됨을 보였으며, 추출물로부터 분리된 mojabanchromanol b 라는 물질의 탁월 한 항염증 효과를 보고하였다. 따라서 이상의 결과들을 종합 Fig. 5. Effect of Zostera marina ethanolic extract (ZMEE) on MAPKs expression in LPS-induced RAW246.7 cells. The levels of p-p38, p-ERK, and p-JNK in the cytosolic protein were determined by western blot analysis. RAW264.7 cells were treated with the indicated concentrations of ZMEE (0.1, 1, 10, 50, and 100 µg/mL) and LPS (1 µg/mL) for 30 min, and the proteins were detected using specific antibodies.
Fig. 6. Inhibition of Zostera marina ethanolic extract against croton oil-induced mouse ear edema. a-fMeans with different superscript are significantly different (p<0.05).
해 볼 때, 잘피 에탄올 추출물은 귀부종을 효과적으로 완화 시킴으로써 염증을 예방하거나 치료하는 천연항염증제로 이용 가능함을 확인하였다.
3.7. 단기 독성 평가
기능성 식품 소재로써 이용 가능성을 알아보기 위해 World
Health Organization (WHO) [36]에 따라 추출물을 300, 2,000 및 5,000 mg/kg · body weight가 되도록 200 µL씩 경구투여하 고 2주간 행동변화 및 치사율을 관찰하였다 (Table 1). 경구투 여 후 4시간까지 행동 변화를 관찰하였을 때, 20분 정도 약간 흥분 상태를 보였으나 1시간 이후 진정하였으며, 2주간 치사 율은 0%로 나타났다. 따라서 동물실험을 통해 추출물이 인 체에도 무해할 것으로 사료되며 새로운 기능성 식품 소재로 이용이 가능할 것으로 사료된다.
4. CONCLUSION
대식세포에 대한 잘피 에탄올 추출물의 독성은 나타내지 않 았으며, LPS에 의해 유도된 NO와 pro-inflammatory cytokine 의 분비량은 잘피 에탄올 추출물에 의해 농도의존적으로 억 제됨을 확인하였다. 또한, 잘피 에탄올 추출물로 인한 염증 매개성 물질의 발현 억제력이 NF-κB와 MAPKs 신호전달 억 제에 기인한 것인지를 알아본 결과, LPS는 iNOS, COX-2, NF-κB 및 MAPKs의 발현을 증가시켰으나, 잘피 에탄올 추 출물 처리는 LPS에 의해 유도되는 각 단백질의 발현량을 억 제하였다. 따라서 잘피 에탄올 추출물은 염증 반응에 관여하 는 신호전달 체계인 NF-κB와 MAPKs의 활성을 억제함으로 써 염증매개인자들의 생성을 효과적으로 억제하였다. 마지 막으로, 추출물이 미치는 조직학적 변화를 알아본 결과, 대 조군은 진피와 경피의 두께가 확장되어 있었고 mast cell의 침윤이 정상군에 비하여 현저하게 증가함을 확인하였다. 그 러나 잘피 에탄올 추출물 처리군은 대조군에 비하여 진피와 경피의 두께가 상대적으로 줄어들었고 비만세포의 침윤이 현저하게 감소하는 것으로 관찰되어 조직 두께 및 mast cell 의 침윤 감소에 추출물 처리에 대한 효과가 있음을 확인하였 다. 본 연구 결과들을 종합해 볼 때 잘피 에탄올 추출물을 이 용한 새로운 항염증에 유용한 고부가가치 제품개발이 가능 한 소재로 판단된다.
Acknowledgements
이 논문은 2014년도 정부 (교육부)의 재원으로 한국연구재단 의 지원을 받아 수행된 기초연구사업입니다 (No. 2012R1A6 A1028677).
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Table 1. Mortality of mice treated orally with Zostera marina ethanolic extract
Days after treatment
0 2 4 6 8 10 12 14
Control 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 300 mg/kgbody weight 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 2,000 mg/kgbody weight 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 5,000 mg/kgbody weight 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
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