제 9장 소수성 멤브레인 크로마토그래피

제 9장 소수성 멤브레인 크로마토그래피

항체는 종양, 자가면역 질환, 심혈관 및 뇌혈관 질환의 치료에서 높은 특이성과 우 수한 치료 효과를 갖는 생체분자로서, 2015년부터 2018년 7월까지 바이오 의약품 승 인의 절반 이상을 차지함으로써 글로벌 제약 산업에서 매우 중요한 위치를 차지하고 있다.

전형적인 항체 생산 공정은 바이알 해동 및 접종물 확장, 생물반응기에서의 생성물 의 발현과 같은 업스트림 공정과 분리, 정제 공정을 포함하는 다운스트림 공정으로 이루어져 있다. 지난 30년 동안 생명 공학의 급속한 발전으로 특정 포유류 세포에서 발현되는 항체 수준은 5-10g/L까지 비약적으로 발전하였으나, 다운스트림 정제 공정 의 발전이 상대적으로 느려 항체의 대량 생산이 여전히 제한되고 있으며 항체 생산 비용 절감도 어려운 실정이다. 일반적으로 항체 정제 공정에는 다양한 기본 단위 공 정들로 구성되어 있는데, [그림 9.1]에 일반화된 항체 분리 및 정제 공정을 나타내었 다.

[그림 9.1] 전형적인 단일클론항체 회수공정

일반적인 다운스트림 플랫폼은 Protein A 크로마토그래피에 의한 항체 포획으로 시작하여 연마 단계(polishing)에서 음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용 크로 마토그래피 등을 사용하거나 이들 중 일부를 사용한다. 오늘날, Protein A 친화성 크 로마토그래피는 높은 선택성과 효율성으로 인해 여전히 항체 포획을 위해 지배적으로 사용한다. 그러나 높은 비용, 리간드 누출, 가혹한 용출 조건과 같은 Protein A 친화 성 크로마토그래피의 한계로 인해 학계나 산업계의 연구자들은 이를 대체할 새로운 기술을 개발하고 있다.

1998년 Burton과 Harding¹⁾은 소수성 전하 유도 크로마토그래피(hydrophobic charge-induction chromatography: HCIC)라는 새로운 크로마토그래피 기술을 개 발하였다. HCIC는 혼합 모드 크로마토그래피의 일종으로 온화한 용출 조건, 고용량 및 내염성의 장점을 가지고 있다. HCIC 수지와 표적 단백질의 결합은 중성 pH에서 소수성 상호작용을 통해 이루어지고, 이 표적 단백질은 산성 조건에서 단백질과 전하 를 띤 리간드 사이의 정전기적 반발에 의해 용리된다. Protein A 친화성 크로마토그 래피 및 기타 연마 단계의 대안으로 HCIC는 항체와 같은 생물학적 제제의 정제에 큰 잠재력을 가지고 있다. 본 검토에서는 생물 분리 응용 분야를 위한 HCIC 리간드 및 지지체로서 멤브레인을 포함한 수지의 최근 개발을 개괄하였으며, 영향 요인 및 최적 화 전략, 향후 발전을 제시하였다.

9.1. HCIC 리간드

특정 구조의 리간드는 HCIC 수지의 흡착 특성을 결정한다. 일반적으로 HCIC 리간 드는 하나 이상의 소수성 부분과 하나의 이온성 부분으로 이루어진다. 피리딜 (pyridyl) 및 이미다졸릴(imidazolyl)과 같은 일부 헤테로사이클릭 그룹은 생리학적 조건에서 소수성 상호작용에 의해 단백질을 흡착하는 HCIC 리간드로 작용할 수 있 다. 이러한 리간드의 설계 목적은 단백질 흡착을 위한 중성 조건에서 HCIC 리간드를 전하가 없는 상태로 만드는 것이며 정전기 상호작용은 산성 조건에서 흡착된 단백질 의 용리를 용이하게 한다. 이러한 기능적 부분의 조합으로 예상하지 못한 단백질의 분리 성능 효과를 볼 수 있다. MEP(4-mercaptoethyl-pyridine) HyperCel을 포함한 일반적인 HCIC 리간드의 구조 및 항체 정제 성능과 특정 결합 특성을 가진 신규 개

1) S.C. Burton, D.R.K. Harding, Hydrophobic charge induction chromatography: salt independent protein adsorption and facile elution with aqueous buffers, J. Chromatogr. A., 814 (1998), pp. 71-81

발된 HCIC 리간드에 대해 개략적으로 논의하였다.

9.1.1. MEP HyperCel

현재 MEP HyperCel은 Pall(Danaher)에서 상용화한 가장 널리 사용되는 HCIC 레 진이다. MEP HyperCel의 기능적 리간드는 황 원자가 있는 소수성 장쇄와 피리딘 구 조를 포함하는 4-mercaptoethyl-pyridine(MEP)으로 중성 pH에서 흡착을 가능하게 하는 4.8의 pKa를 가지고 있는데, 이의 구조를 [그림 9.2]에 나타내었다

[그림 9.2] MEP 리간드의 구조

MEP HyperCel은 다양한 항체 및 단백질 정제에 사용되고 있는데, [표 9.1]에는 문 헌에 보고된 몇 가지 사례를 나타내었다. Wu 등²⁾은 MEP HyperCel을 이용하여 소 초유 유청에서 면역글로불린 G(IgG)를 분리했다. 정제 과정의 최적화에 따라 용리 조 건에 대한 pH와 이온 강도는 각각 pH 4.5 및 0.5 M NaCl로 하였으며, 93.9%의 IgG 순도 및 90.0% 이상의 회수율을 달성하였다. Schwartz 등³⁾은 단백질이 없는 세 포 배양 상층액에서 항체를 정제하기 위해 MEP HyperCel을 적용하여, 95%의 순도 를 얻었고 회수율은 약 92%를 달성하였다. 이러한 방법으로 형질전환 염소 우유에서 항체를 정제하는 데도 적용하였는데, IgG_의 순도가 95%이상이었는데, 이는 Protein A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 얻은 것과 필적하였다. HCIC를 활용하여 정제 된 항체의 균질성은 친화성 크로마토그래피를 활용한 정제 제품의 균질성을 초과하기 도 하였다. 이 밖에 MEP HyperCel은 인슐린 유사 성장 인자-II 및 귀밑샘 타액의 타액 단백질과 같은 특정 단백질의 정제에도 사용되었는데, 이 때에도 우수한 정제 성능을 나타내었는데, 이는 Thiophilic 및 heterocycle 시스템을 통한 penicillin

2) M. Wu, F. Zhang, Y. Liang, R. Wang, Z. Chen, J. Lin, L. Yang, Isolation and purification of immunoglobulin G from bovine colostrums by hydrophobic charge-induction chromatography, J. Dairy Sci., 98 (2015), pp. 2973-2981

3) W. Schwartz, D. Judd, M. Wysocki, L. Guerrier, E. Birck-Wilson, E. Boschetti, Comparison of hydrophobic charge induction chromatography with affinity chromatography on protein A for harvest and purification of antibodies, J. Chromatogr. A., 908 (2001), pp. 251-263

acylase의 소수성 상호작용이 가능하며, 효소 기질에 황 원자가 존재함으로써 이 상 호작용을 강화할 수 있기 때문인 것으로 판단된다.

[표 9.1] 문헌에서 연구된 MEP HyperCel의 적용

n.a.: Not available.

Coulon 등⁴⁾은 MEP HyperCel을 사용하여 페니실린 아실라제 정제에 사용하였는데, 4.5 정제 배수로 회수율 90% 이상을 얻었다. 이러한 방법은 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 및 기존 공정에서 나타날 수 있는 중금속 작업을 회피할 수 있다.

분자 도킹 및 분자 동역학 시뮬레이션과 같은 컴퓨터 시뮬레이션의 발달로 분자 상 호 작용에 대한 메커니즘 연구를 리간드와 단백질 간의 상호 작용에 대한 이론적 분 석에 많은 활용이 있었다. Zhang 등⁵⁾ 은 매트릭스 및 MEP 리간드로 구성된 다공성

4) D. Coulon, C. Cabanne, V. Fitton, A.M. Noubhani, E. Saint-Christophe, X. Santarelli, Penicillin acylase purification with the aid of hydrophobic charge induction chromatography, J. Chromatogr. B., 808 (2004), pp. 111-115

5) L. Zhang, G. Zhao, Y. Sun, Molecular insight into protein conformational transition in hydrophobic charge induction chromatography: A molecular dynamics simulation, J. Phys.

Chem. B., 113 (2009), pp. 6873-6880

Adsorbent Target Substance Feedstock %Purity %Recovery/Yield

MEP HyperCel

mAb Transgenic goat milk ≥95 ~83–98

rBoNTA(Hc);

rBoNTB(Hc)

Pichiapastoriscell extracts 84.3;

91

n.a.

Ig Antiserum 68–88 n.a.

Penicillin acylase Escherichia colicell extract n.a. >90

Lactoferrin Bovine colostrum whey n.a. 91

IgG Bovine colostrums 93.9 91.5

Antibody A;

Antibody B

CHO cell culture supernatants

n.a. 93.5;

92.5

IgG Crude

feedstocks; protein-free cell culture supernatant

70–99 n.a.

mAb;

Fc-fusion protein

CHO cell culture supernatants

n.a. >89

Insulin-like growth factor-II

Escherichia colicell extract n.a. n.a.

salivary proteins Parotid saliva n.a. n.a.

mAb Protein extraction fromNicotiana benthamiana

n.a. 35.5±11.6

HSA Protein mixture n.a. n.a.

흡착제에 대한 구조적 모델을 확립하였다. 표적 단백질과 리간드 사이의 소수성 상호 작용의 효과를 분자 역학 시뮬레이션으로 분석하였는데, 강한 소수성 상호작용이 단 백질 흡착 과정을 가속화할 수 있지만 또한 높은 리오트로픽 염 농도 하에서 단백질 언폴딩을 야기하는 반면, 낮은 리오트로픽 염 농도는 단백질의 본래 형태를 보존할 수 있음을 증명하였다. Linet 등⁶⁾은 분자 역학 시뮬레이션과 등온 적정 열량계를 활 용하여 고정된 MEP 리간드와 IgG 간의 상호 작용을 분석하였다. MEP 리간드는 중 성 pH에서 IgG의 CH2 도메인 상의 TYR319 및 LEU309 주변의 결합 포켓에서 Fc-A를 포획할 수 있음이 밝혀졌다. 그리고 소수성 상호 작용은 반 데르 발스 상호 작용 및 수소 결합을 동반하는 주요 추진력임을 제시하였다. Yu 등⁷⁾은 pH 조절에 의한 단백질 정제를 위한 HCIC의 계면 메커니즘을 조사하기 위해 중간경 (mesoscopic)의 거친 입자 시뮬레이션 방법을 개발하였다. 라이소자임은 "상단(top)"

및 "하단(bottom)" 방향으로 주로 소수성 표면에 흡착되었는데, "하단" 리소자임과 리 간드 표면 사이의 소수성 상호작용이 더 약하기 때문에 "상단" 방향으로부터의 탈착이

"하단"으로부터의 탈착보다 훨씬 더 어렵다는 것을 발견하였다. Tong 등⁸⁾은 분자 역 학 시뮬레이션을 통해 MEP 리간드의 잠재적인 결합 구조를 분석한 결과, 다중 부위 결합 및 자가 적응 구조 조정이 Fc와 MEP 리간드 사이의 상호 작용의 주요 원동력 임을 발견하였다.

9.1.2. 기타 HCIC 리간드

상업용 수지 외에도 최근 몇 년 동안 여러가지 HCIC 리간드가 문헌에 보고되었으 며 [표 9.2]에 일부 HCIC 기능적 리간드의 구조를 나타내었다. Luet 등⁹⁾¹⁰⁾ 은 IgG/BSA 단백질 혼합물로부터 IgG를 분리하기 위해 다양한 기공 크기 및 리간드 밀

6) D.-Q. Lin, H.-F. Tong, H.-Y. Wang, S. Shao, S.-J. Yao, Molecular mechanism of hydrophobic charge-induction chromatography: Interactions between the immobilized 4-mercaptoethyl-pyridine ligand and IgG, J. Chromatogr. A., 1260 (2012), pp. 143-153 7) G. Yu, J. Liu, J. Zhou, Mesoscopic coarse-grained simulations of hydrophobic charge

induction chromatography (HCIC) for protein purification, AICHE J., 61 (2015), pp.

2035-2047

8) H.-F. Tong, C. Cavallotti, S.-J. Yao, D.-Q. Lin, Molecular insight into protein binding orientations and interaction modes on hydrophobic charge-induction resin, J.

Chromatogr. A., 1512 (2017), pp. 34-42

9) H.-L. Lu, D.-Q. Lin, Q.-L. Zhang, S.-J. Yao, Evaluation on adsorption selectivity of immunoglobulin G with 2-mercapto-1-methyl-imidazole-based hydrophobic charge-induction resins, Biochem. Eng. J., 119 (2017), pp. 34-41

10) H.-L. Lu, D.-Q. Lin, D. Gao, S.-J. Yao, Evaluation of immunoglobulin adsorption on the hydrophobic charge-induction resins with different ligand densities and pore sizes, J.

Chromatogr. A., 1278 (2013), pp. 61-68

도를 갖는 일련의 2-mercapto-1-methylimidazole(MMI) 수지를 사용하였다.

[표 9.2] 문헌에 보고된 전형적인 HCIC 기능적 리간드

n.a.: Not available.

pH 7.0에서 로딩하고 pH 4.0에서 용리하는 조건하에서 IgG 단량체의 순도를 약 95% 얻은 반면 회수율은 90% 정도를 유지하였으며, 거위 혈액에서 IgY(ΔFc)를 분리 하는 데 사용한 경우, 최종 제품 순도는 98.6%, 수율은 85.0%를 얻었다. Xiaet 등¹¹⁾ 은 MEP, MMI 및 2-mercaptobenzimidazole(MBI)을 셀룰로오스 비드에 확장층 수 지로 결합하여 IgY/BSA 단백질 혼합물로부터 IgY 흡착을 위한 HCIC 흡착제로 사용 하였다.  pH 7.0에서 Q_m   mg IgYmL 흡착제를 갖는 MMI 수지는 pH 7.0에서 가장 높은 흡착 용량을 보였고, 높은 Q_m (10.2 mg BSA/mL 흡착제) 값을 나타내었 는데 이는 MMI 수지로 IgY 정제가 가능함을 의미한다. 5-aminoindole (AI)도 HCIC 리간드였으며 AI(고정 스페이서 포함) 상의 5-아미노기의 pKa는 3.9이다. AI는 BSA 및 리소자임 흡착에 대한 염 농도 및 pH의 영향을 연구하는 데 사용되었는데, pH 3.0에서 용리할 때 라이소자임의 회수율이 ~90%이고 순도가 ~90%임을 보여주었다.

Yanet 등¹²⁾ 은 5-aminobenzimidazol(ABI)을 기능성 리간드로 사용하여 HCIC 수지

11) H.-F. Xia, D.-Q. Lin, L.-P. Wang, Z.-J. Chen, S.-J. Yao, Preparation and evaluation of cellulose adsorbents for hydrophobic charge induction chromatography, Ind. Eng. Chem.

Res., 47 (2008), pp. 9566-9572

12) J. Yan, Q.L. Zhang, H.F. Tong, D.Q. Lin, S.J. Yao, Hydrophobic charge-induction resin with 5-aminobenzimidazol as the functional ligand: Preparation, protein adsorption and immunoglobulin G purification, J. Sep. Sci., 38 (2015), pp. 2387-2393

KB-ABI를 제조한 후, hIgG/BSA 단백질 혼합물로부터 hIgG를 정제하는데 사용하였 으며, hIgG 순도 99.7% 및 회수율 94.6%를 달성할 수 있음을 보여주었다. 수지는 CHO 세포 배양 상청액으로부터의 단클론 항체(mAb) 정제에 추가로 적용하였는데 항 체의 순도는 94.9%, 회수율은 92.5%로 나타났다. KB-ABI(pH 5.0)의 상대적으로 약 한 용리 조건은 항체 활성 보호에 유리한 것으로 보고하였다. Tong 등¹³⁾은 트립토판 과 ABI를 결합하여 ABI의 선택성을 더욱 향상시키기 위해 새로운 다중 모드 리간드 W-ABI를 설계하였으며, 더 온화한 조건(pH 4.5–5.0)에서 효율적인 용리를 달성할 수 있을 것으로 보았다. W-ABI 수지는 CHO 세포 배양 상청액으로부터 mAb를 정제하 는 데 사용되었으며, 생성물 순도 및 회수율은 각각 98.9%, 88.6%였다. Zou 등¹⁴⁾ 은 분자 시뮬레이션을 사용하여 페닐알라닌, 티로신, 글루타메이트 및 ABI로 구성된 하이브리드 생체모방 리간드를 설계하였다. 새로운 하이브리드 수지(FYE-ABI)는 인 간 혈청 알부민(HSA) 함유 용액으로부터 hIgG 분리에 사용될 때 우수한 성능을 나타 내었고 hIgG 순도는 99.0%, 회수율은 91.5%였다. FYE-ABI 레진은 Protein A에 비 해 훨씬 약한 pH 4.5 용리하에 인간 혈청에서 hIgG를 분리하기 위해 추가로 적용되 었으며, [그림 9.3]에서 SEC-HPLC 분석 결과를 나타내었는데, hIgG 순도는 93.9%, 회수율은 88.9%였다. Phottraithip 등¹⁵⁾은 돼지 혈장에서 IgG 분리를 위한 HCIC 리 간드 2-mercaptoimidazole(MI)을 개발하였다. 인산나트륨 완충액(pH 7.0)을 사용하 여 컬럼을 평형화시켰으며 pH 3.6에서 용리된 IgG의 순도는 최대 89.4%에 도달하였 다. Luo 등¹⁶⁾은 MEP HyperCel, ABI-4FF, MMI-4FF 및 W-ABI-4FF를 포함한 4가 지 다른 HCIC 수지의 흡착 거동을 조사한 결과 ABI-4FF 및 MMI-4FF가 pH 5.0에 서 IgM에 대해 높은 선택성을 나타냄을 발견하였다. ABI-4FF를 사용하여 하이브리도 마(hybridoma) 세포 배양 상층액에서 단클론 IgM을 포획하고 고순도(~99%) 및 우수 한 회수율(80.8%)을 얻었다. Shi와 그의 공동 연구자들¹⁷⁾ 은 새로운 HCIC 수지를 준 비하기 위해 Sepharose CL-6B에 히스타민을 고정화하고 리소자임에 대한 흡착 거

13) H.-F. Tong, D.-Q. Lin, W.-N. Chu, Q.-L. Zhang, D. Gao, R.-Z. Wang, S.-J. Yao, Multimodal charge-induction chromatography for antibody purification, J. Chromatogr. A., 1429 (2016), pp. 258-264

14) X. Zou, Q. Zhang, H. Lu, D. Lin, S. Yao, Development of a hybrid biomimetic ligand with high selectivity and mild elution for antibody purification, Chem. Eng. J., 368 (2019), pp.

678-686

15) W. Phottraithip, D.-Q. Lin, F. Shi, S.-J. Yao, New hydrophobic charge-induction resin with 2-mercaptoimidazole as the ligand and its separation characteristics for porcine IgG, Biotechnol. Bioprocess Eng., 18 (2013), pp. 1169-1175

16) Y.D. Luo, Q.L. Zhang, S.J. Yao, D.Q. Lin, Evaluation of adsorption selectivity of immunoglobulins M, A and G and purification of immunoglobulin M with mixed-mode resins, J. Chromatogr. A., 1533 (2018), pp. 77-86

17) Q.H. Shi, F.F. Shen, S. Sun, Studies of lysozyme binding to histamine as a ligand for hydrophobic charge induction chromatography, Biotechnol. Prog., 26 (2010), pp. 134-141

동을 연구하였는데, 단백질과 흡착제의 탈수가 HCIC 수지에 대한 라이소자임 흡착을 촉진하고 라이소자임 분자가 단백질 흡착 동안 상당한 구조적 변화를 겪는다는 것을 발견하였다. 본 연구는 새로운 HCIC 리간드 개발을 위한 이론적 기초를 제공하였는 데, 이 새로운 HCIC 리간드는 생물학적 분리 연구자들에게 다양한 옵션을 제공하였 다. 그러나 여전히 대부분의 리간드는 특정한 제한 사항이 있으며 대규모의 산업 응 용으로까지 발전하지는 못하고 있지만, 다양한 HCIC 리간드에 대한 개발과 메커니즘 연구는 다운스트림 분리 공정의 개발에 기여할 수 있을 것으로 본다.

[그림 9.3] pH 4.0, 4.5 및 5.0에서 FYE-ABI 수지를 사용한 혈청 공급원료, 파과 및 용리 분획의 SEC-HPLC 결과

9.2. HCIC 흡착 거동에 영향을 미치는 요인

생물학적 분리는 기능적 리간드에 의한 표적의 포획 및 방출에 의존하는 반면, 흡

착 메커니즘은 리간드와 단백질 간의 상호작용이 pH, 이온 강도 및 첨가제와 같은 매개변수를 조정함으로써 제어 가능하다. 따라서 다양한 영향 요인을 조절하여 공정 을 강화함으로써 제품의 순도와 수율을 더욱 향상시킬 수 있다. 이 장에서는 리간드 밀도, 준비 방법 및 HCIC 흡착 거동에 대한 첨가제를 포함한 요인에 대해 개괄하였 다.

9.2.1. 리간드 밀도의 영향

리간드 밀도는 단백질 흡착에 중요한 역할을 한다. 일반적으로 리간드 밀도가 높을 수록 흡착에 유리하긴 하나 리간드 밀도가 증가함에 따라 입체 장애도 동시에 고려해 야 한다. Luet 등¹⁸⁾은 MMI 리간드를 3개의 아가로스 매트릭스에 결합하여 리간드 밀도가 다른 수지를 제조하였다. 밀도를 증가시킴으로써 흡착제에 접근 가능한 결합 부위의 수는 리간드 밀도 범위에서 증가할 수 있었으며, 이를 통해 소 IgG에 대한 흡 착 용량을 상당히 증가시킬 수 있었다. Zhang 등¹⁹⁾²⁰⁾은 반응공학적 시뮬레이션 (kinetic simulation)에 의한 HCIC 수지의 흡착 거동에 대한 리간드 밀도의 영향을 연구하기 위해 거친 기공 모델(coarse-grained pore model)을 사용하였다. 소수성 하전 비드와 2개의 소수성 비드로 구성된 자기회피 사슬을 HCIC 리간드의 모델로 사 용하였다. Ren 등²¹⁾은 MEP-Sepharose를 사용하여 anti-double-stranded DNA 항 체와 류마티스 인자를 제거하였다. 그들은 고정된 MEP의 밀도를 높이면 항 이중 가 닥 DNA 항체의 제거율이 증가할 수 있고 MEP 밀도가 98.8μmol/mL인 수지가 인간 혈청에서 항 이중 가닥 DNA 항체의 80%를 제거할 수 있음을 발견했다. 그러나 MEP 밀도의 추가 증가에 따른 제거율의 유의한 증가를 얻지 못했는데, 류마티스 인 자의 경우, 이중 가닥 DNA 항체에 비해 훨씬 낮은 MEP 밀도(46.3μmol/mL)에서 효 과적인 흡착을 달성할 수 있었기 때문이다.

18) H.-L. Lu, D.-Q. Lin, D. Gao, S.-J. Yao, Evaluation of immunoglobulin adsorption on the hydrophobic charge-induction resins with different ligand densities and pore sizes, J.

Chromatogr. A., 1278 (2013), pp. 61-68

19) L. Zhang, G. Zhao, Y. Sun, Effects of ligand density on hydrophobie charge induction chromatography: Molecular dynamics simulation, J. Phys. Chem. B., 114 (2010), pp.

2203-2211

20) L. Zhang, S. Bai, Y. Sun, Molecular dynamics simulation of the effect of ligand homogeneity on protein behavior in hydrophobic charge induction chromatography, J.

Mol. Graph. Model., 28 (2010), pp. 863-869

21) J. Ren, L. Jia, L. Xu, X. Lin, Z. Pi, J. Xie, Removal of autoantibodies by 4-mercaptoethylpyridine-based adsorbent, J. Chromatogr. B., 877 (2009), pp. 1200-1204

9.2.2. 제조 방법의 효과

수지 제조 시 결합 방법에 따라 리간드 성능에 영향을 미친다. 연구자들은 allyl bromide(AB)를 사용하여 agarose 젤을 활성화했다. 알칼리성 조건에서 agarose는 활성화를 갖기 위해 AB에서 -Br과 치환 반응을 한다. AB의 농도가 증가함에 따라 AB 활성화 수준이 점차 증가하여 리간드 밀도를 제어하는 ​​데 사용할 수 있다. Xiaet 등¹¹⁾은 Divinyl sulfone(DVS) 활성화와 알릴 브롬 활성화의 두 가지 방법으로 HCIC 수지를 합성하였다. 셀룰로오스 비드는 AB 또는 DVS에 의해 활성화된 다음 기능기 를 갖는 리간드와 결합되었다. AB 활성화 반응 동안, 적절한 양의 NaOH는 친핵성 치환을 유도할 수 있는 반면, 과도하면 효율을 감소시키고 AB의 가수분해를 악화시킨 다. 또한 매트릭스에 대한 AB의 질량 비율도 활성화 효율에 영향을 미치는 필수 요 소이다. 특정 범위 내에서 알릴 밀도는 AB가 증가함에 따라 증가한다. DVS와의 활성 화 반응은 빠르게 평형을 달성할 수 있다. 비닐술폰기의 밀도는 pH가 증가함에 따라 증가하지만, 알칼리가 과도할 경우 비닐설폰과 셀룰로오스 사이의 가교 결합과 같은 심각한 부반응을 일으킬 수 있다. DVS의 양이 증가함에 따라 비닐술폰기의 밀도가 증가하지만 이러한 증가 경향은 동시에 더 많은 부반응을 유발할 수 있다. Cheng 등²²⁾은 HCIC 수지를 보다 효율적으로 제조할 수 있는 새로운 활성화 방법을 설계하 였다.

9.2.3. 첨가제의 효과

첨가제는 공급원료 시스템에 대한 다양한 수지의 분리 성능을 개선하기 위해 크로 마토그래피 정제 공정에서 널리 사용된다. 카프릴산은 단백질 불순물을 침전시키고 혈장, 혈청 및 복수(ascites)에서 Ig를 분리하는 데 일반적으로 사용되는 포화 지방산 이다. Tong 등²³⁾은 MEP HyperCel의 흡착 선택성을 향상시키기 위해 알부민 선택적 첨가제로 caprylate를 사용하였다. 로딩 완충액에 50mM 카프릴산나트륨(NaCA)을 첨가하고 세척 완충액에 75mM NaCA를 첨가하면 BSA/IgG 혼합물로부터 분리할 때

22) F. Cheng, M. Li, W. He, B. Sun, J. Qin, J. Qu, Activation of resin with controllable ligand density via catalytic oxa-Michael addition and application in antibody purification, J.

Chromatogr. A., 1570 (2018), pp. 1-9

23) H.F. Tong, D.Q. Lin, D. Gao, X.M. Yuan, S.J. Yao, Caprylate as the albumin-selective modifier to improve IgG purification with hydrophobic charge-induction chromatography, J. Chromatogr. A., 1285 (2013), pp. 88-96

IgG 순도가 약 98%로, NaCA가 없는 경우 순도 63.2% 대비 크게 증가한 것을 볼 수 있다. [그림 9.4]에 BSA 흡착에 대한 카프릴레이트 효과의 메커니즘에 대한 개략적인 과정을 나타내었다.

[그림 9.4] IgG 및 BSA의 흡착에 대한 카프릴레이트 효과의 개략도

카프릴레이트 분자는 낮은 NaCA 농도에서 알부민에 결합할 수 있으며, 이는 HCIC 리간드와의 결합 부위에 대한 경쟁을 초래하는 것으로 나타났다. 높은 NaCA 농도에 서 용액의 분자는 높은 이온 강도를 유발하고 표적 단백질 주변의 수화 층이 손상되 어 알부민과 HCIC 리간드 사이의 소수성 상호 작용을 강화하고 BSA 흡착을 촉진할 수 있다. Arakawa 등²⁴⁾은 아르기닌을 첨가하면 중성 pH에서 MEP HyperCel로부터 항체와 Fc-융합 단백질 모두를 효과적으로 용리할 수 있다는 것을 발견하였다. 중성 용출 조건은 형태 변화를 최소화할 수 있으며 단백질 활성 보호에 유리한 측면이 있 다. 아르기닌은 대부분의 아미노산 측쇄와 호의적으로 상호작용을 하며 크로마토그래 피 적용을 위해 단백질 응집을 억제하는 다목적 용매 첨가제이다. 예를 들어, 아르기 닌 측쇄의 알킬 사슬은 소수성 상호작용을 통해 MEP HyperCel의 피리딘 고리와 상 호작용할 수 있으며, 이는 MEP와 항체 사이의 인력을 감소시키고 효율적인 항체 해 리를 유발한다. 또한 2-프로판올, 에틸렌 글리콜 및 요소를 사용하여 MEP HyperCel 컬럼 세척도 가능하다. Ren 등²⁵⁾은 사이클로덱스트린(CD)을 MEP 리간드와 결합하여 가역적인 비공유 내포 복합체를 형성하였다. 중성 pH에서 hIgG의 용출이 달성되었고 15mM β-CD로 87%의 평균 IgG 회수율이 얻어졌다.

24) T. Arakawa, Y. Kita, H. Sato, D. Ejima, MEP chromatography of antibody and Fc-fusion protein using aqueous arginine solution, Protein Expr. Purif., 63 (2009), pp. 158-163 25) J. Ren, P. Yao, Y. Cao, J. Cao, L. Zhang, Y. Wang, L. Jia, Application of

cyclodextrin-based eluents in hydrophobic charge-induction chromatography: Elution of antibody at neutral pH, J. Chromatogr. A., 1352 (2014), pp. 62-68

9.3. 향후 개발 및 응용

최근에는 고분자 그래프트 수지, 멤브레인 크로마토그래피 및 연속 크로마토그래피 와 같은 새로운 분리 기술이 생물 분리를 위해 HCIC와 결합되어 큰 잠재력을 보여주 고 있다.

9.3.1. 폴리머 그래프트 HCIC 수지

HCIC는 온화한 용출 조건, 우수한 흡착 선택성, 고용량 및 염 내성의 장점으로 인 해 대규모 단백질 정제를 위한 유망한 기술이라고 할 수 있다. 그러나 항체와 HCIC 리간드 간의 상대적으로 약한 소수성 상호작용으로 인해 HCIC 리간드의 동적 결합 능력을 다른 상업용 리간드와 단순 비교하긴 어렵다. 폴리머 그라프팅은 단백질 결합 능력을 증가시키는 효과적인 전략으로서 Capto S, Streamline Q XL 및 SP Sepharose XL과 같은 dextran-grafted agarose 수지가 성공적으로 사용화된 대표 적인 리간드이다. Liu 등²⁶⁾²⁷⁾은 기능성 리간드로 MMI를 사용하고 매트릭스로 덱스트 란 그래프트 아가로스 겔을 사용하여 HCIC 수지 MMI-B-XL을 제조하였으며, hIgG 를 모델 단백질로 사용하여 MMI-B-XL 수지의 흡착 등온선 및 동역학을 연구하였고, MMI-B-XL의 결과를 그래프트되지 않은 HCIC 수지 MMI-B-6FF와 비교하였다. 덱스 트란-그래프트된 층은 물질 수송 경로를 상당히 단축시키고, 리간드 밀도를 증가시키 며, 고속에서 동적 흡착 능력을 향상시킬 수 있다는 것을 밝혔다. 또한 dextran-grafted 층이 염을 첨가하지 않고 pH 8.0에서 더 확장되어 hIgG에 대한 더 접근 가능한 결합 부위를 제공할 수 있고 따라서 더 높은 흡착 용량을 유도할 수 있 다는 것을 발견하였다. 상대적으로 작은 입체 장애로 인해 덱스트란 그래프트 HCIC 수지에서 BSA 확산은 hIgG보다 빨랐으며, poly(glycidyl methacrylate)(GMA)를 그 라프팅 폴리머로, MMI를 기능성 리간드로 사용하여 G-MMI로 명명된 폴리머 그라프 트 HCIC 수지 시리즈도 개발되었다. GMA는 AGET ATRP(atom transfer radical

26) T. Liu, D.Q. Lin, H.L. Lu, S.J. Yao, Preparation and evaluation of dextran-grafted agarose resin for hydrophobic charge-induction chromatography, J. Chromatogr. A., 1369 (2014), pp. 116-124

27) T. Liu, D.-Q. Lin, Q.-L. Zhang, S.-J. Yao, Characterization of immunoglobulin adsorption on dextran-grafted hydrophobic charge-induction resins: Cross-effects of ligand density and pH/salt concentration, J. Chromatogr. A., 1396 (2015), pp. 45-53

polymerization)에 의해 생성된 표면 개시 활성화제에 의해 agarose gel에 그라프팅 되었고 poly(GMA) 그라프트된 HCIC 수지 G-MMI는 poly(GMA) 사슬의 에폭사이드 그룹과 반응하여 제조하였으며, 높은 단백질 흡착 능력을 위한 3차원 결합 스캐폴드 의 형성이 더 높은 그래프팅 밀도와 적절한 리간드 밀도를 요구함을 보여주었다.

G140-MMI-L445의 DBC값은 34.6mg/g으로 선속도 300cm/h에서 그래프트를 하지 않은 레진 MMI-L100, 덱스트란 그래프트 레진 MMI-B-XL-200과 비교하면 가장 높 은 수치이다. 새로운 HCIC 수지를 사용한 50-사이클 분리는 항체의 대규모 정제 적 용 가능성이 있는 hIgG의 고순도(98.5-99.8%) 및 회수(90.2-96.9%)를 얻을 수 있었 다.

9.3.2. HCIC를 사용한 멤브레인 크로마토그래피

높은 리간드 활용, 낮은 압력 강하, 높은 물질 전달 효율 및 저렴한 비용으로 인해 멤브레인 크로마토그래피는 생물학적 분리에서 대중적이고 효율적인 기술이 되었다.

따라서 멤브레인 크로마토그래피와 HCIC를 결합하여 새로운 기능성 멤브레인 재료를 제조하는 것은 큰 잠재력을 가지고 있다. Wang 등²⁸⁾²⁹⁾은 ATRP 공정을 통해 매우 큰 기공을 갖는 다공성 재생 셀룰로오스 멤브레인의 표면에 poly(GMA)를 그래프트하 였으며, 양이온 및 소수성 특성을 가진 4-mercaptobenzoic acid를 리간드로 사용하 였다. 개발된 다중모드 멤브레인은 IgG의 큰 정적 결합 능력을 보여주었다. 이를 바 탕으로 Ma 등³⁰⁾은 IgG 분리를 위해 HCIC 리간드가 있는 혼합 모드 멤브레인 크로마 토그래피를 표면 개질을 통해 제조하였으며 제조 경로를 [그림 9.5]에 나타내었다.

MBI, MMI, 2-머캅토피리딘(2MP) 및 4-머캅토피리딘(4MP) 등이 기능성 리간드로 활 용하였다. RC-g-MBI 멤브레인 크로마토그래피의 IgG 단량체 회수율은 96%였으며 순도는 90%로 추정되었다.

28) J. Wang, R.T. Sproul, L.S. Anderson, S.M. Husson, Development of multimodal membrane adsorbers for antibody purification using atom transfer radical polymerization, Polymer., 55 (2014), pp. 1404-1411

29) J. Wang, E.W. Jenkins, J.R. Robinson, A. Wilson, S.M. Husson, A new multimodal membrane adsorber for monoclonal antibody purifications, J. Membr. Sci., 492 (2015), pp.

137-146

30) N. Ma, D. Yao, H. Yang, J. Yin, H. Wang, Y. Zhang, J. Meng, Surface modification of cellulose membranes to prepare a high-capacity membrane adsorber for monoclonal antibody purification via hydrophobic charge-induction chromatography, Ind. Eng. Chem.

Res., 57 (2018), pp. 13235-13246

[그림 9.5] 혼합 모드 멤브레인 흡착기의 합성 경로

9.3.3. HCIC를 사용한 연속 크로마토그래피

지난 몇 년 동안 항체 역가의 빠른 증가는 다운스트림 공정에 상당한 문제를 야기 시켰다. 다운스트림 분리 공정의 효율성과 경제성은 점점 더 많은 주목을 받고 있다.

시뮬레이션 이동상(simulated moving bed: SMB)을 기반으로 연속 크로마토그래피 라고 하는 여러 연속 분리 기술이 개발되어 생물학적 거대분자의 분리에 적용되었다.

회분식 크로마토그래피에 비해 연속 작업은 수지 활용도를 높이고 생산 비용을 절감 할 수 있는 장점을 지니고 있다. Luo 등¹⁶⁾은 생물 분리를 위해 ABI-4FF와 MMI-4FF 수지를 결합한 2단계 크로마토그래피 분리 방법을 개발하였다. ABI-4FF 수지는 먼저 pH 4.5에서 IgA를 제거하는 데 사용되었으며 첫 번째 단계의 통과 분획 에는 IgM과 IgG가 포함되었다. IgM을 포획하기 위해 MMI-4FF 수지를 사용하여 pH 4.5에서 추가로 정제하였는데, 최적화 후, 65.2%의 IgM 순도 및 28.3의 정제 계수를 얻었다. Heidebrecht 등³¹⁾은 Capto^TM-MMC와 MEP HyperCel을 연결하여 초유 유 청에서 소 IgG를 분리하는 공정을 개발하였는데, 개략적인 공정을 [그림 9.6]에 나타 내었다. 8,800mL MEP HyperCel 및 3,000mL Capto^TM-MMC 컬럼 부피로 3단계에 걸쳐 확장되었으며, 이를 통해 컬럼 세척을 포함하여 5시간 이내에 3L의 초유에서 30-150g 순수 IgG를 정제할 수 있었는데, 이것은 우유 유청에서 많은 양의 IgG를 얻 기 위한 비용 효율적이고 산업적으로 적합한 전략으로 평가된다. 그러나 엄밀한 의미 에서 이러한 공정은 연속 크로마토그래피 공정은 아니다. 단위 작업을 연속 공정으로 일관되게 통합하는 것은 최근 몇 년 동안 가장 중요한 이슈 중의 하나가 되었다. 연

31) H.-J. Heidebrecht, B. Kainz, R. Schopf, K. Godl, Z. Karcier, U. Kulozik, B. Förster, Isolation of biofunctional bovine immunoglobulin G from milk- and colostral whey with mixed-mode chromatography at lab and pilot scale, J. Chromatogr. A., 1562 (2018), pp.

59-68

속 분리 공정은 회분식 분리 공정에 비해 상당한 비용 절감 효과를 제공할 것임이 분 명하고 HCIC 는 이러한 공정에서 잠재적인 응용을 보여줄 가능성이 높다. 아울러 이 러한 기술이 멤브레인과 결합되어 더욱 높은 시너지를 낼 것으로 기대된다.

[그림 9.6] 2개의 크로마토그래피 컬럼 연결에 대한 개략도

[참고] 본 자료는 M.Li, Q.Zhang, D.Lin, S.Yao, Development and application of hydrophobic charge-induction chromatography for bioseparation, Journal of Chromatography B, 1134–1135 (2019) pp. 1-8. 자료를 토대로 작성되었습니다.