제 4장 멤브레인 크로마토그래피 제조기술
멤브레인 크로마토그래피 개발에서 가장 중요한 요소 중의 하나는 멤브레인 지지체 라고 할 수 있다. 멤브레인 지지체 및 미세 다공성 멤브레인과 리간드 사이의 공유결 합 커플링의 적절한 선정은 원하는 크로마토그래피 분리 성패의 기본 요소이다. 시장 에서 사용되는 멤브레인의 형태는 Pall사의 평막 시스템을 비롯하여 Sartorius의 멤 브레인 스택, 방사흐름 카트리지, 중공사형 모듈, 관형 모듈 등이 있다. 멤브레인 크 로마토그래피는 특정 리간드가 공유결합할 수 있는 화학적으로 반응성 사이트를 가지 고 있거나 제조업체에 의해서 리간드가 결합된 형태로 공급된다.
4.1. 특성
멤브레인 크로마토그래피에 적용하기 위한 이상적인 멤브레인 지지체는 다음과 같 은 특성을 가져야 한다. 먼저, 고분자량의 생체분자와 리간드간의 자유 상호작용을 가 능케하는 미세 다공성 구조로 이루어져야 한다. 다음으로 생체 분자가 멤브레인 자체 와 비특이적으로 상호작용하는 것을 방지하기 위하여 멤브레인은 친수성이고 중성이 어야 한다. 셋째, 광범위하고 다양한 반응에 의한 표면 활성화가 이루어질 수 있는 관능기를 가지고 있어야 한다. 넷째, 흡착, 용리 및 재생을 포함하는 화학세정과 같은 가혹한 조건에서도 견딜 수 있도록 화학적으로 안정하여야 하고, 다섯째, 운전압력에 견딜 수 있고, 오토클레이브에서 멸균할 경우에도 견딜 수 있도록 물리적으로 안정해 야 한다. 마지막으로 저가로 공급가능하도록 하여 산업적 이용이 용이하도록 하여야 한다. 크로마토그래피에 응용하기 위한 멤브레인 지지체에 대한 제약은 일반적으로 리간드 결합을 위한 멤브레인 매트릭스의 화학적인 활성 사이트의 필요성에 있다고 할 수 있다.
4.2. 멤브레인 소재
멤브레인 크로마토그래피에 사용되는 소재는 몇 가지 유형으로 구분할 수 있다. 먼 저, 가장 기본이 되는 소재는 cellulose이다[그림 1]. cellulose는 오래전부터 멤브레
인 소재로 사용되어 왔으며, 친화성 리간드 커플링을 위한 훌륭한 매트릭스이다.
(a) (b)
(c) (d)
[그림 1] cellulose 구조1) (a) cellulose, (b) cellulose acetate, (c) cellulose diacetate, (d) cellulose triacetate
그러나 기존에 시판되고 있는 cellulose 유도체 멤브레인은 상대적으로 기공크기가 작고, 적층 멤브레인을 통한 높은 압력강하로 인해 크로마토그래피에 적용하기는 쉽 지 않다. Guo 등2)은 이를 해결하기 위하여 새로운 타입의 cellulose 정밀여과막을 개발하여 친화성 매트릭스로 사용하였다. 거친 섬유사로 구성된 멤브레인은 더 높은 다공성과 더 큰 기공크기(1~2㎛)를 갖지만 구조의 균일성이 좋지 않다. Triazine 염 료[그림2]의 고정화 전 기계적 및 화학적 안정성을 향상시키기 위하여 epoxypropane chloride를 이용하여 가교화시키기도 한다.
1) wikipedia
2) Guo, W., Shang, Z., Yu, Y. & Zhou, L., Membrane affinity chromatography of alkaline phosphatase. J. Chromatogr. A, 685 (1994) 344-348.
[그림2] Triazine 염료의 구조3)
Polysulfone[그림3]은 우수한 필름 형성 특성과 열 및 생물학적 내성을 가지고 있 기 때문에 멤브레인 소재로 종종 사용되고 있다. Polysulfone은 화학적으로 상당히 안정적인 반면에, 고분자의 특성을 변경하지 않으면서 리간드를 도입하기 위한 활성 사이트를 부여하기 위해서는 일부 특정 반응을 요구한다. 이러한 반응의 한 종류로 N-butyllithium을 사용한 방향족 고리의 메틸화이다. 멤브레인은 금속 이온과 결합할 수 있는 킬레이트 그룹으로 대체될 수 있다. Polysulfone 멤브레인과의 다른 반응으 로는 triazine 염료의 고정화 전 아크릴화-아민화(acrylation-amination) 반응 및 클 로로메틸화-아민화(chloromethylation-amination)가 있다.
[그림3] Polysulfone 구조4)
미세다공성 polyamide[그림4] 멤브레인은 좁은 기공크기 분포와 기계적 강성을 제 공한다. 그러나 나일론 멤브레인은 말단의 아미노 그룹의 농도가 낮기 때문에 나일론 매트릭스의 직접적인 활성화는 금속 킬레이터 또는 트리아진 염료를 이용하여 리간드 의 밀도를 낮춘다. 나일론 멤브레인의 또 다른 문제는 단백질의 비특이적 흡착이다.
나일론 멤브레인에 hydroxyethyl cellulose(HEC)를 고정하는 것은 단백질의 낮은 비 특이적 결합과 친화성 리간드에 대한 적절한 결합 능력을 나타내기 위해서이다.
3) wikipedia
4) polymer database
[그림4] Polyamide 구조5)
다른 유형의 크로마토그래피 멤브레인은 공중합체를 불활성 미세 다공성 표면에 그 래프팅 한 다음 관능기를 도입하여 2단계의 절차로 이루어진다. 불활성 미세 다공성 멤브레인은 특정 기공 크기를 갖는 기계적 지지체 역할을 하며, 공중합체는 화학적 관능기 그룹의 운반체 역할을 한다.
단일 소재의 멤브레인뿐만 아니라 복합소재도 멤브레인으로 사용되는데, 대략 다음 과 같은 사례가 있다.
분산된 cellulose 섬유의 존재하의 glycidyl methacrylate 중합체[그림 5]를 개발하 여 그래프트된 아크릴 중합체와 cellulose의 복합 멤브레인을 제조하였는데, cellulose에 아크릴 고분자는 직접(in-situ) 공유결합을 시켰다. 이렇게 형성된 복합 멤브레인은 기계적 지지체로서 cellulose 코어를 가지며, 화학적 관능기 그룹의 운반 체로써 아크릴 외피를 가지게 된다. 형성된 복합 멤브레인은 sulphopropyl 또는 dicarboxyl 그룹 및 금속 킬레이트와 같은 관능기 그룹에 의해 추가적인 활성을 가 질 수 있다.
[그림5] glycidyl methacrylate 중합체6)
5) polymer database
스미토모 제약의 계열사인 Sunovion에서 생산하는 복합 멤브레인은 모든 표면에 hydroxyethylcellulose(HEC)[그림6]의 공유결합 층으로 코팅된 polyehtersulone(PES)과 polyethylene oxide(PEO)의 블렌딩으로 구성된다. PES 백 본은 물리적 강도를 제공하고, HEC 코팅은 리간드가 공유결합 될 수 있는 활성화 가 능한 표면 hydroxyl 그룹을 제공한다. PEO와 HEC는 모두 낮은 비특이적 단백질 결 합특성을 가지고 있다. 멤브레인 결합 HEC에 포함된 hydroxyl 그룹은 공유결합에 의해 단백질 A 의 고정화를 위해 추가로 활성화될 수 있다.
[그림6] hydroxyethylcellulose(HEC)의 구조7)
방사선 유도 그래프트 중합은 또한 고분자 물질에 고밀도 그래프트 사슬을 균일하 게 도입할 수 있기 때문에 크로마토그래피용 멤브레인을 제조하는데 활용되고 있다.
방사선 유도 그래프트 중합법을 적용하여 술폰산기 그룹 또는 dimethylamino 그룹 을 포함하는 고분자 사슬 그룹을 중공사 멤브레인 제조에 활용하고 있다. 이러한 고 분자 사슬 그룹은 단백질을 다층으로 잡을 수 있는 촉수 고분자 사슬로 기능하는 것 으로 알려져 있다.
크로마토그래피용 멤브레인은 가수분해된 polyglycidyl methacrylate(PGMA) -ethylene dimethacrylate(EDMA) 공중합체에 PGMA 올리고머를 그래프트시킨 소재 로 제조하기도 한다. PGMA-EDMA 멤브레인은 깨지기 쉽고 단백질의 비특이적 흡착 을 유발할 수 있다. 이러한 결함은 소수성 PGMA를 PGMA-EDMA 멤브레인에 그래 프트 시킴으로써 감소시킬 수 있다. 관능기는 유연한 올리고머 사슬에 추가로 도입할 수 있다.
6) polymer database 7) polymer database
4.3. 멤브레인 활성화
친화성 매트릭스의 제조는 화학적으로 불활성인 지지체의 활성화와 활성화된 매트 릭스에 리간드를 커플링 시키는 2단계 반응으로 이루어진다. 매트릭스 활성화에 사용 되는 화학은 대부분 매트릭스 자체의 특성과 안정성에 의해 결정된다. 매트릭스에 공 정화되는 리간드의 극도의 다양성은 매트릭스에 리간드를 결합시키는 방법이 결코 보 편적일 수 없음을 의미한다. 리간드를 지지체에 직접 결합시키거나 사실상 리간드를 매트릭스로부터 거리를 두는 스페이서에 고정화시키는 방법이 있다. 멤브레인 활성화 및 리간드 커플링 방법은 광범위하게 검토된 겔 비드의 패킹된 컬럼에 사용되는 방법 과 거의 동일하다. 미세 다공성 멤브레인에 고정화하는 방법은 다음과 같다.
4.3.1. 커플링 과정
Carbonyl diimidazole(CDI) 시약을 사용하여 hydroxyl이 함유된 매트릭스를 활성 화할 수 있다. 이렇게 매트릭스에 도입된 imidazoyl carbonate 그룹은 amino 그룹 리간드와 반응하여 carbamate를 생성한다. 활성화는 유기 용매에서 이루어진다. 리 간드 커플링은 높은 pH의 수성 시스템에서 수행한다. CDI를 사용한 멤브레인 활성화 의 예에는 Kugal 등8)의 개질된 나일론 섬유에 프로타민의 고정화 및 poly(ether- urethane-urea) 멤브레인에 단백질 A 및 인간 IgG의 고정이 포함된다.
2-fluoro-1-methyl pyridinium toluene-4-sulfonate(FMP) 시약은 약간 과량의 3차 아민이 존재하는 경우 hydroxyl 함유 매트릭스를 활성화하는데 사용된다. 활성 화된 그룹은 친핵성 그룹(예를 들면 1차 아민과 같은)과 반응한다. 약알칼리성 수용액 (pH=8-9)의 리간드에서 pyridinium 모이어티를 1-methyl-2-pyridone으로 치환하 여 안정한 비이온성 2차 아민을 형성한다. FMP 방법은 Unarka 등이 나일론 멤브레 인에 단백질 A를 고정화하기 위해 사용한 방법이다.
Cyanogen bromide(CNBr) 활성화는 모든 hydroxyl 함유 지지체 물질에 적합하 다. 매트릭스는 높은 pH (pH=11-12)에서 CNBr과 반응한다. 이로 인해 cyanate-ester 및 imidocarbonate 그룹이 매트릭스에 도입된다. Amino 함유 리 간드는 pH 7~8의 수성 매질에서 활성화된 매트릭스에 공유결합된다. 리간드와 맽매 트릭스 사이에 형성된 결합은 주로 isourea 타입이다. CNBr을 사용한 미세 다공성
8) Kugel, K., Moseley, A., Harding, G. B. & Klein, E., Microporous poly(caprolactam) hollow fibers for therapeutic affinity adsorption. J. Membr. Sci., 74 (1992) 115-129.
멤브레인 활성화의 예로는 poly(ethylene vinyl alcohol)-coated polyethylene, cellulose diacetate 및 Hemophan 중공사 멤브레인에 poly(L-lysine)을 고정화하는 것이 있다.
마지막 사례로서, 아민 또는 아미드를 함유한 지지체 재료와 함께 사용되는 glutaraldehyde 활성화이다. 본 시약의 실제 구조는 분명하지 않지만, 단량체, 알돌 축합의 고분자 생성물 또는 삼량체 생성물로 반응할수 있다. 따라서, 다른 반응 메커 니즘도 가능한데, 예를 들어 1차 아미드는 활성화된 이중 결합과 반응하거나 Schiff 염기9) 형성에 의해 반응할 수 있다. Glutaraldehyde 시약은 trypsin 억제제와 p-aminobenzamidine 및 재조합 단백질 A 및 단백질 G를 결합하기 전에 cellulose 와 acryl 복합 멤브레인을 활성화하는데 사용하였다.
4.3.2. 스페이서 암
어떤 경우에 리간드는 낮은 입체 가용성으로 인해 그 기능이 현저하게 떨어질 수 있다. 이것은 고분자량 리간드에서는 거의 발생하지 않지만 저분자량 리간드에서는 종종 발생하는 문제이다. 이러한 문제를 해결하기 위해 '스페이서 암[그림5]'이라는 것을 도입한다. 복합 멤브레인에 결합된 단백질 A 리간드에서 스페이서 암의 역할은 Hou 등에 의해 알려졌다. 12개의 원자보다 긴 스페이서는 높은 리간드 농도에서 유 리한 결과를 제공하는 것으로 보였지만 이러한 긴 스페이서를 사용하면 암이 접힐 가 능성이 있다. 이 경우 용량이 급격히 감소하므로 리게이트 정제 중에는 피해야 한다.
따라서, 고체 표면으로부터 리간드 연장을 위해 11개의 원자 스페이서 암 길이가 선 택되었다. Bueno 등10)은 또한 더 긴 스페이서 암이 리간드에 더 쉽게 접근할 수 있 게 하고 L- 히스티딘 친화성 막을 사용하여 인간 혈청으로부터 IgG를 분리하기 위한 흡착을 촉진 할 수 있다고 하였다. 오늘날, 그라프팅된 공중합체 사슬은 리간드 접근 성과 친수성 및 용량을 제공하기 위해 보다 더 일반적으로 사용된다.
9) 시프 염기(영어: Schiff base)는 일반 구조로 R1R2C=NR' (R' ≠ H)를 가지고 있는 화합물이다. 이름 은 화학자 휴고 시프(영어판)의 이름을 따서 명명되었다. 시프 염기는 구조에 따라 이민의 하위 부류 인 2차 케티민 또는 2차 알디민으로 간주될 수 있다. 시프 염기는 종종 2차 알디민(즉, R-CH=NR', 여기서 R' ≠ H)을 구체적으로 지칭하는 아조메틴과 동의어이다. 위키백과 자료 참조함.
10) Bueno, S. M. A., Haupt, K. & Vijayalashmi, M. A., Separation of immunoglobulin G from human serum by pseudobioaffinity chromatography using immobilized L-histidine in hollow fiber membranes. J. Chromatogr. B, 667 (1995) 57-67.
[그림7] MC 구조 및 스페이서
4.4. 상호작용 모드
미세 다공성 멤브레인의 크로마토그래피 상호 작용은 친화성 상호 작용 (예 : 항원 및 항체, 단백질 A 및 단백질 G, 염료, 히스티딘, 리간드로서의 금속 이온), 이온 교 환, 소수성 상호 작용 및 역상 상호 작용이 있으며 이는 기존 레진이 패킹된 컬럼 크 로마토그래피와 동일하다. 각각에 대해 간략히 살펴보면 다음과 같다.
4.4.1. 친화성 상호작용
면역 친화성 기술은 중공사 멤브레인 카트리지에서 주로 이루어졌다. 고정화된 항체, 예를 들어 3 가지 재조합 단백질 즉, 인간 인터페론-α2a, 인터루킨-2 및 인터루킨-2 수용체가 중공사 멤브레인 카트리지를 활용하여 산업적 규모의 생산이 이루어졌다.
이 멤브레인은 면역 친화성 멤브레인의 포화 근처에서 발생하는 항원 파과와 함께 단 지 몇 초의 체류 시간에 희석된 원료 공급 스트림에서 단백질을 처리하는 능력을 가 지고 있다. 단백질 A 및 단백질 G 면역 친화성 멤브레인은 희석된 하이브리도마 배 양 상층액 1 dm3을 처리한 실험에서 고속 처리가 가능함을 입증했다. 단일 통과, 150 cm3/min의 높은 유속 및 8.3x104 Pa의 낮은 압력 강하로 IgG는 단 10분 만에 정제되었다. 고정화된 단백질 A를 포함하는 미세 다공성 멤브레인으로 얻은 가장 높 은 결합 능력은 비드 매트릭스로 얻을 수 있는 것과 유사한 수준이다. 면역 친화성 멤브레인은 의료분야에의 응용 잠재성도 가지고 있다.
염료 및 히스티딘과 같은 유사 친화성 리간드는 기존의 레진 컬럼 크로마토그래피
기술에서 잘 정립되어 있으며 이러한 기술들을 여러 연구자들이 멤브레인 크로마토그 래피에 적용하였다. Cibacron Blue F3GA 염료 멤브레인은 높은 여과 유속에서 10 분 이내에 Saccharomyces cerevisiae에서 글루코스-6-포스페이트 탈수소 효소를 정제할 수 있으며, 이 때 효소 결합능은 레진 컬럼 크로마토그래피에서 얻을 수 있는 것과 유사한 수준임이 보고되었다. Cibacron Blue F3GA 멤브레인을 사용한 효소 정 제 (Candida bodinii의 formate 탈수소 효소 및 Zymomonas mobilis의 pyruvate decarboxylase) 및 회수 과정에 이들의 통합도 제시되었다. 표면이 135 ㎠ 인 멤브 레인 모듈은 시간당 4.8kU formate 탈수소 효소 및 480kU pyruvate decarboxylase의 정제가 가능하다. 모든 크로마토그래피 단계의 유속은 레진 컬럼을 사용하는 경우 5cm/min이었으며, 5분 미만의 사이클을 가져 왔다.
고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 또한 멤브레인 카트리지를 기반으로 연구되었 다. 복합 Cu2+ 이온에 대한 히스티딘과 트립토판의 친화성 때문에 이 두 아미노산은 다른 아미노산을 포함하는 용액에서 쉽게 분리될 수 있다. 금속 친화성 크로마토그래 피를 사용하면 단백질이 외부 구체에 히스티딘 또는 트립토판을 포함하는 경우 분리 가 가능하다. 이에 대한 응용연구로서 다량의 Sorghum bicolor로부터 S-oxynitrilase를 고정화된 IDA-Cu2+ 이온교환 멤브레인으로 정제하였다. IDA-Cu2+
이온 교환 멤브레인은 ㎠ 당 0.15 mg의 S-oxynitrilase 용량을 보였는데, 이는 젤 크로마토그래피보다 약간 낮은 수준에 불과하였다. 고정된 금속 멤브레인은 그러나 레진 컬럼 크로마토그래피에 비해 유속이 200 배 증가가 가능하다.
4.4.2. 이온교환
이온 교환막은 시판되는 미세여과 멤브레인을 유도체화하여 제조할 수 있다. 음이온 및 양이온 교환 멤브레인은 세포 배양 상청액으로부터 단일 클론 항체 및 인간 재조 합 안티트롬빈 III (rAT III) 정제에 활용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 단일 클론 항체의 경우 80%, rAT III의 경우 75%의 정도의 순도를 달성했다. 단일 클론 항체의 용량은 최대 96%의 회수율로 1mg/㎠이고, rAT III의 경우 회수율이 있는 경우 0.15mg/㎠으로 최대 91%의 회수율을 보였다. 이온 교환막은 또한 재조합 대장균에 의해 세포 외에서 생산된 재조합 면역 융합 단백질의 파일럿 규모의 분리를 위해 사 용된다. 정제된 희석 발효액의 1 dm3/min의 유속으로 200 dm3을 처리하기 위하여 평형화, 로딩, 용출 및 재생을 포함한 완전한 주기에서 1.12 ㎡의 멤브레인 표면적을 사용하여 6 시간 이내에 완료할 수 있다. 이온 교환 멤브레인은 또한 높은 유속 및 질량 부하 조건에서 단백질 혼합물의 효율적인 구배 용출에 잠재적으로 사용할 수 있
다. 고순도 혈장 분획은 몇 시간 만에 인간 혈장 1dm3에서 400 ㎤/min의 유속으로 얻어졌으며, 이는 대규모 단백질 분획을 위한 이온 교환막의 가능성을 보여준다고 할 수 있다.
4.4.3. 소수성 상호 작용 및 역상
소수성 상호 작용과 역상 기술 또한 멤브레인 크로마토그래피에 적용 가능하다.
단백질의 모델 혼합물 분리는 C4 및 C8 그룹으로 개질된 멤브레인에서 수행되었다.
분리 결과는 레진 컬럼 크로마토그래피에서 얻은 것과 유사한 수준인 것으로 보고되 고 있다. 크로마토그래피 멤브레인의 장점은 적용하는 압력이 레진 컬럼 크로마토그 래피에서 동일한 유속에 도달하는 데 필요한 압력보다 2배 더 낮았지만 결합력은 동 등 수준이라는 것이다. 연속적인 선형 구배로 얻은 분리는 단백질 분리에서 시간과 이동상을 감소시키는 단계적 구배 프로파일의 설계에 사용되고 있다.
4.4.4. 다중모드
더 높은 수준의 선택성을 얻기 위해 서로 다른 크로마토그래피 지지체의 조합이 활용 되고 있다. 일련의 양이온 교환기, 염료-리간드 및 음이온 교환기 멤브레인은 Candida boidinii에서 formate 탈수소 효소의 정제를 가능하게 하였다. 리간드의 서 열과 완충액 조건은 하나의 멤브레인에서 용출된 분획이 다음 멤브레인에 직접 로드 될 수 있는 방식으로 선택되었다. 일련의 한외여과, 정용여과, Cibacron Blue, 음이 온 교환기 및 헤파린-멤브레인 크로마토그래피를 사용하여 햄스터 세포 배양 상층액 으로부터 전기영동으로 순수한 재조합 인간 안티트롬빈 III도 얻었으며 순도는 94%에 도달했다.
