제 8장 친화성 멤브레인 크로마토그래피
단백질은 어떤 물질과 특이적으로 결합함으로써 생리적인 역할을 하고 있다. 친화 성 멤브레인 크로마토그래피(affinity membrane chromatography)는 이러한 단백 질과 특정 물질(리간드)과의 상호 작용 (친화성)을 이용한 대표적인 흡착공정이다. 예 를 들면 항체는 항원에, 사이토카인(cytokine)이나 호르몬(hormone)은 수용체에, 효 소는 기질이나 저해제에 특이적으로 결합한다. 이와 같은 특이적 상호작용의 하나를 리간드로서 멤브레인에 고정화하고 거기에 단백질 용액을 흘려보내면 상대의 단백질 이 리간드에 특이적으로 결합한다. 그 후 이 결합을 끊어 목적 단백질을 멤브레인 지 지체로부터 용출할 수 있다. [그림 8.1]은 저해제를 리간드로 사용하여 효소를 정제하 는 경우의 예이다. 리간드로 이용되는 저해제는 천연물질이나 합성물질이어도 좋다.
물론 효소를 고정화시켜 저해제를 정제할 수도 있다.
[그림 8.1] 친화성 (멤브레인) 크로마토그래피의 원리1)
친화성 멤브레인 크로마토그래피는 다른 멤브레인 크로마토그래피에 비해 높은 정 제 효율과 회수율을 가지며 한 번에 많은 양의 시료를 처리하는 것이 가능하기 때문 에 비교적 초기 정제 단계에서 사용하는 것이 좋다. 물론 단백질과 리간드의 상호작 용 특이성이 높으면 높을수록 정제효율이 높아진다. 많은 경우 이러한 친화성 담체가 판매되지 않기 때문에 연구자가 직접 준비해야 된다. 또한 친화성은 다소 떨어지지만 특정의 아미노산, DNA, 색소, 렉틴 등을 리간드로 사용하고 이러한 리간드에 친화성
1) 岡田雅人, 안봉애, 이용호 역, 단백질 실험노트(상), 4판, 바이오사이언스출판
을 가진 단백질 그룹을 분리하는 그룹 특이적 친화성 멤브레인 크로마토그래피도 자 주 이용되고 있다. 이들 그룹 특이적 친화성 멤브레인 크로마토그래피는 Danaher(Pall), Sartorius, Merck(Millipore) 등에서 판매하고 있다.
8.1. 친화성 크로마토그래피의 기원
고정된 생물학적 제제를 활용하여 특정 표적 물질을 분리한다는 개념은 E.
Starkenstein에 의해 1910년 처음 사용되었다.2) Starkenstein은 불용성 전분을 고 정상과 분리 지지체로 사용하여 α-아밀라아제를 정제할 때 효소와 기질 사이에 발생 하는 결합을 응용하였다. 1920년대부터 1940년대까지 아밀라아제 및 관련 효소를 분 리하기 위해 이러한 접근 방식을 활용하여 추가 연구가 다양하게 수행되었으며, 스테 아르산 분말을 이용한 리파아제 농축, 결정성 단백질인 에데스틴을 이용한 펩신 정제, 엘라스틴 분말을 이용한 돼지 엘라스타제 분리 등 효소 정제를 위해 고정된 기질을 사용하는 것과 동일한 원리를 적용하였다.3)
같은 시기에 생물학적 상호작용을 기반으로 한 크로마토그래피 분리가 항체 정제로 확장되었으며4), 1930년대 중반의 초기 연구에서는 항체 정제를 위해 흡착된 항원과 함께 목탄 및 카올린과 같은 지지체를 사용하였고, 디아조 커플링 방법(diazo coupling method)은 1936년 Landsteiner와 van der Scheer에 의해 합텐(hapten) 을 닭 적혈구 기질에 연결하는 데 사용되었으며, 이 합텐에 결합할 수 있는 항체를 분리하는 데 사용되었다. Campbell 등은 1951년 공유 고정화 기술을 다른 지지체로 확장하였는데, diazotized p-aminobenzyl-cellulose에 결합된 BSA를 사용하여 소 혈청 알부민(BSA)에 대한 토끼 항체를 분리하였다. 이 기술의 변형은 항체 정제를 위 해 고정된 합텐이나 효소 정제를 위한 고정된 기질 유사체 또는 저해제와 함께 사용 되었다. 저해제와 함께 사용한 예로서는 p-아조페놀 치환 셀룰로오스 (p-azophenol-substituted cellulose)에 대한 버섯 티로시나아제(tyrosinase)의 정제 와 플라빈 치환 셀룰로오스(flavin-substituted celluloses)에 대한 간 플라보키나아 제(liver flavokinase) 또는 기타 플라빈 모노뉴클레오티드(flavin mononucleotide:
2) A.C.A. Roque, C.R. Lowe, Affinity chromatography: history, perspectives, limitations and prospects, Methods Mol. Biol., 421 (2008), pp. 1-21
3) E. L.Rodriguez, S.Poddar, S.Iftekhar, K.Suh, A. G.Woolfork, S.Ovbude, A.Pekarek, M.Walters, S.L.David, S.Hage, Affinity chromatography: A review of trends and developments over the past 50 years, . J. Chromatography B, 1157 (2020), pp. 1-16
4) D.S. Hage, R. Matsuda, Affinity chromatography: a historical perspective, S. Reichelt (Ed.), Affinity Chromatography Methods in Molecular Biology, Springer, New York (2015), pp.
1-19
FMN) 의존성 효소의 분리가 있다. 셀룰로오스 유도체는 핵산, 전이 RNA 및 뉴클레 오티드의 특정 가닥의 정제에 추가 적용되었다.
지지체와 지지체에 대한 고정 방법은 1960년대에 이루어졌는데 대표적으로 지지체 로서 비드 형태의 아가로스를 만든 것으로 이는 액체 크로마토그래피에서 셀룰로오스 기반 지지체에서 발생하는 기계적 안정성 문제를 해결하였다. 그 후에 CNBr(cyanogen bromide) 고정화 방법이 개발되었는데, 이 방법은 양성자화되지 않 은 아민 그룹을 통해 CNBr 활성화 아가로스에 펩타이드와 단백질을 부착하는 비교적 쉬운 수단을 제공하였다. 이 두 가지 발전은 1968년 Cuatrecasas, Anfinsen 및 Wilchek에 의해 결합되어 뉴클레아제 저해제를 비드로 만든 아가로스에 고정화한 다 음 뉴클레아제 정제에 사용되었으며, 결과 논문은 표적 분리 또는 분리를 위한 특정 수단으로 컬럼의 생물학적 제제를 사용하는 방법에 "affinity chromatography"라는 이름이 처음으로 사용되었다.
8.2. 친화성 크로마토그래피 지지체
친화성 크로마토그래피 지지체로 사용되는 물질과 매트릭스는 매우 다양하며, 이러 한 지지체와 상대적 사용 범위를 [그림 8.2]에 나타내었다5).
[그림 8.2] 친화성 크로마토그래피에서 다양한 지지체의 사용. "기타 폴리머"로 나열된 그룹에는 폴리메타크릴레이트(종이의 0.3%에 사용됨), 폴리설폰(0.3%) 및 폴리아미드 (0.4%) 포함
5) E. L.Rodriguez, S.Poddar, S.Iftekhar, K.Suh, A. G.Woolfork, S.Ovbude, A.Pekarek, M.Walters, S.L.David, S.Hage, Affinity chromatography: A review of trends and developments over the past 50 years, . J. Chromatography B, 1157 (2020), pp. 1-16
Agarose는 1968년 Cuatrecasas 등의 연구 이후 친화성 크로마토그래피에 대한 가장 일반화된 지지체가 되었다. 친화성 크로마토그래피를 위한 지지체로서 Agarose 를 사용하는 장점은 저렴한 비용, 큰 공극 크기(예: 생체분자 분리 또는 고정용), 많은 생물학적 제제에 대한 낮은 비특이적 결합, 넓은 pH 범위에 대한 우수한 안정성이다.
이러한 특징으로 인해 Agarose는 [그림 8.2]에 나타낸 바와 같이 정제를 위한 친화성 크로마토그래피에서 가장 광범위하게 사용하고 있다. 그러나 Agarose는 높은 작동 압력에서 기계적 안정성에 취약한 측면이 있으며, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 를 기반으로 하는 분석 규모의 분리에서 지지체로의 Agarose는 사용이 제한적이다.
다른 유형의 탄수화물도 친화성 크로마토그래피에서 지지체로 사용되는데 [그림 8.2]에 나타낸 바와 같이, 대표적인 물질이 셀룰로오스이다. 셀룰로오스는 1950년대 와 1960년대 항체 또는 효소 정제를 위해 등장한 친화성 크로마토그래피의 초기 적 용에 일반적으로 사용되었다. 셀룰로오스는 현재 친화성 크로마토그래피의 Agarose 만큼 대중적이지는 않지만, 멤브레인 기반의 친화성 분리에 사용된다6)7). 비드 처리된 Agarose보다 표면적이 낮고 기계적 안정성이 낮음에도 불구하고 멤브레인 형식의 셀 룰로오스는 낮은 배압을 제공할 수 있고 높은 유속의 예비 작업에 사용할 수 있다8). 1970년대 후반에서 1980년대 초반 친화성 크로마토그래피를 HPLC와 결합하는 방 법에 대한 연구에 집중하였는데, 이러한 결합을 고성능 친화성 크로마토그래피 (high-performance affinity chromatography: HPAC) 또는 고성능 액체 친화성 크로마토그래피(high-performance liquid affinity chromatography: HPLAC)라고 한다. 친수성 그룹(예: 디올)이 포함된 변형된 다공성 실리카 입자 또는 유리 비드가 HPAC에서 일반적으로 사용되기 시작했는데, 이러한 물질이 제공하는 장점은 다양한 기공 크기와 입자 직경에서 사용할 수 있고, HPLC 시스템에서 사용되는 조건에서 우 수한 기계적 강도와 광범위한 친화성 리간드의 고정화를 위해 변형되는 능력, 표적 정제에서 제약 또는 생의학 분석 및 흐름 기반 면역 분석에 이르는 응용 분야에 적용 할 수 있다는 것이다. 많은 탄수화물 지지체에 비해 실리카 및 유리계 지지체의 단점 은 pH 안정성이 낮고 높은 비특이적 결합을 들 수 있다.
다양한 유기 중합체도 친화성 크로마토그래피의 지지체로 사용되고 있다. 이러한 유기 중합체의 대부분은 폴리스티렌 또는 폴리메타크릴레이트를 기반으로 이루어져
6) P. Gustavsson, P. Larsson, Support materials for affinity chromatography, in: D.S. Hage (Ed.), Handbook of Affinity Chromatography, 2nd ed., Boca Raton, 2006: pp. 15–33.
7) C. Charcosset, Review: purification of proteins by membrane chromatography, J. Chem.
Technol. Biotechnol., 71 (1998), pp. 95-110
8) D.K. Roper, E.N. Lightfoot, Separation of biomolecules using adsorptive membranes, J.
Chromatogr. A, 702 (1995), pp. 3-26
있다. 천연 폴리스티렌은 친화성 크로마토그래피에서 높은 수준의 비특이적 상호작용 을 유발할 수 있는 소수성 백본을 가지고 있지만, 친수성 코팅이 이 물질에 위치할 수 있으므로 관류 매질 또는 기타 분리 형식을 기반으로 하는 친화성 크로마토그래피 에 폴리스티렌 지지체를 사용할 수 있다. 폴리메타크릴레이트는 본질적으로 보다 친 수성이며 친화성 분리를 위해 원래의 형태로 사용하거나 개질된 형태로 사용할 수 있 다. 코팅된 폴리스티렌 또는 폴리메타크릴레이트를 기반으로 하는 유기 폴리머가 HPAC에 사용되기도 한다. 친화성 크로마토그래피에 사용된 유기 폴리머로서 최근에 관심을 갖는 멤브레인 지지체에 사용된 폴리설폰 및 폴리아미드이다. 아가로즈와 마 찬가지로 이러한 유기 고분자의 대부분은 넓은 pH 범위에서 사용할 수 있으며 생체 적합성이 우수하다.
지난 15-20년 동안 친화성 크로마토그래피의 성장 영역 중 하나는 모노리스 지지 체의 개발 및 사용이었다. 원래 1990년대에 다른 형태의 크로마토그래피용으로 개발 된 모노리스 지지체는 기존 미립자 지지체 대비 낮은 배압, 높은 투과성, 우수한 분 리 효율 및 다양한 크기와 모양으로 만들 수 있는 능력과 같은 몇 가지 장점을 가지 고 있다. 유기 고분자부터 실리카, 아가로스 및 cryogel에 이르기까지 친화성 크로마 토그래피에 여러 유형의 모노리스가 사용되었다. 친화성 크로마토그래피에 사용된 많 은 모노리스는 glycidyl methacrylate(GMA) 및 ethylene glycol dimethacrylate (EDMA)를 기반으로 하는 중합체로, 항체, 효소 및 펩타이드를 포함하는 고정화제와 함께 사용되었다. 여기에는 매질(convective interaction media: CIM)로 알려진 polymethacrylate 모노리스가 포함되며, 이는 대형 생물학적 제제(예: DNA, 단백질 및 바이러스)의 정제에서 항체 기반 분리 및 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래 피(IMAC)에 이르는 다양한 응용 분야에 사용된다.
최근 몇 년 동안 친화성 크로마토그래피에 대한 지지체로서 다른 대체 물질에 대한 연구가 이루어지고 있다. 이러한 재료 중 하나가 티타니아(TiO2)이다. 티타늄 기반 지 지체는 금속 산화물 친화성 크로마토그래피(metal oxide affinity chromatography:
MOAC) 라고 하는 방법에서 포스포 펩티드의 분리에 주로 사용되었다. Ti 를 함유 한 티타늄 나노입자 및 수지상 폴리글리세롤 코팅 키토산 나노물질 또한 포스포펩티 드와 글리코펩티드의 분리 및 정제를 위해 IMAC에서 사용되었다.
[그림8.3]에 나타낸 바와 같이 친화성 크로마토그래피에 사용할 수 있는 지지체가 다양하게 존재하며 패킹 컬럼은 가장 일반적인 형태이다. 1910년 Starkenstein의 연 구에서 1968년 친화성 크로마토그래피의 현대 시대가 시작될 때까지 친화성 크로마 토그래피의 초기 작업에 이 접근 방식이 사용되었다는 점을 고려할 때 이는 놀라운 일이 아니다. [그림 8.3]에 도시된 바와 같이, 패킹된 컬럼은 친화성 크로마토그래피
의 주요 지지체 형식으로 남아 있으며 지난 50년 동안 이 분야에서 보고된 응용 분야 의 90% 이상에서 활용되었다.
[그림 8.3] 친화성 크로마토그래피에 사용되는 지지체
그러나 이 밖에도 다양한 지지체가 친화성 크로마토그래피에 사용된다. 모세관 지 지체는 1980년대 초반부터 친화성 리간드와 함께 사용되어 왔으며 이는 컬럼 다음으 로 많이 사용되고 있는 지지체이다. 물질 전달을 돕기 위해 통과 구멍을 포함하는 모 노리스 및 관류 기반 매체는 친화성 크로마토그래피의 분석 및 예비 응용 분야에서 활용되었고, 멤브레인을 포함한 섬유 기반 지지체도 친화성 크로마토그래피의 예비 용도로 지난 20-30년 동안 사용되었다.
8.3. 친화성 크로마토그래피의 고정화 기술
앞서 언급했듯이 적합한 고정화 방법의 가용성은 친화성 크로마토그래피에 대한 새 로운 응용 프로그램의 개발과 밀접하게 연결되어 있다. [그림 8.4]는 고정화에 사용할 수 있는 다양한 방식을 보여준다. 고정화 계획의 올바른 선택은 여전히 친화성 컬럼 을 준비할 때 고려해야 할 가장 중요한 요소인데, 친화성 리간드의 최종 활성에 중대 한 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 예를 들어, 고정으로 인한 부적절한 방향 및 입체 장애는 결합제의 실제 또는 겉보기 활성의 감소로 이어질 수 있으며, 지지체에 대한 친화성 리간드의 다중 부위 부착은 결합제의 활성에 변화를 일으킬 수 있다.
[그림 8.4] 친화성 크로마토그래피에서 고정상으로 사용하기 위해 지지체 내에 결합제 또는 친화성 리간드를 고정하거나 배치하는 데 사용할 수 있는 일반적인 전략의 예
1936년 Landsteiner와 van der Scheer, 1951년 Campbell 등에 의해 도입된 공 유 고정화(Covalent immobilization) 기술은 지지체에 친화성 리간드를 결합하기 위 해 가장 일반적으로 사용되는 기술이다9). 지지체 및/또는 리간드의 활성화는 일반적 으로 이 접근 방식의 전제 조건이다. Cautrecasas 등이 사용한 CNBr(cyanogen bromide) 방법에서 지지체 상의 히드록실 기는 먼저 활성 cyanate ester 또는 imidocarbonate 기를 형성하도록 변형되고, 이 그룹은 친화성 리간드의 1차 아민과 반응하여 isourea 결합을 형성한다. 결합제는 carbonyldiimidazole 또는 N-hydroxysuccinimide로 활성화된 표면을 사용하여 아민을 통해 고정화될 수 있다.
아민 함유 제제와 함께 사용할 수 있는 또 다른 공유 커플링은 환원성 아민화 또는 Schiff 염기 방법이 있다. 히드록실 또는 카르복실기를 함유하는 결합제는 공유 고정 화에도 사용될 수 있다.
아민과 같은 상대적으로 일반적인 그룹을 통한 리간드 커플링에 의해 생성되는 부 적절한 배향 또는 다중 부위 부착은 고정화를 위해 리간드의 더 많은 사이트-선택적
9) S. Magdeldin, A. Moser, Affinity chromatography: principles and applications, S.
Magdeldin (Ed.), Affinity Chromatography, Intech Open Science, Rijeka, Croatia (2012), pp.
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사이트를 사용함으로써 회피할 수 있다. 항체 또는 다른 당단백질의 특정 위치에서 발견되는 탄수화물 그룹은 공유 고정화에도 사용할 수 있는데, 탄수화물 그룹은 일반 적으로 먼저 과요오드산염으로 산화되거나 효소 처리를 통해 전환되어 알데히드 그룹 을 형성하며, 리간드 부착은 아민 또는 히드라지드 그룹을 포함하는 지지체와 알데하 이드를 반응시켜 수행된다.
친화성 리간드는 공유 공정화 이외의 방법을 통해서도 지지체에 결합시킬 수도 있 는데, 사실 친화성 크로마토그래피 분야의 초기 작업은 비공유 고정화를 사용하였다.
이 접근법은 정전기 상호작용, 소수성 상호작용 또는 수소 결합과 같은 힘을 통해 표면에 결합제의 물리적 흡착을 기반으로 한다. 고정에 사용되는 상호작용 유형은 지 지체 및 친화성 리간드에 따라 다르게 나타나는데, 탄수화물과 무기 지지체(예: 알루 미나 및 실리카)는 모두 비공유 고정화에 사용되었다. 이 방법의 핵심은 단순성에 있 다. 단점은 비공유 고정화를 통해 제조된 친화성 지지체에 대한 제한된 안정성과 무 작위 배향을 통한 결합제 활성 손실 가능성이다.
생체 특이성 흡착은 1차 친화성 리간드를 결합 및 고정하기 위해 지지체에 부착된 2차 리간드를 사용하는 비공유 고정화의 한 형태이다. 이 접근법의 초기 예는 1976년 에 펩티드와 단백질이 비오틴 태그로 변형되고 고정된 아비딘을 포함하는 지지체 결 합이다. 문헌에 자주 나타나는 생체특이성 흡착의 또 다른 예는 Protein A 또는 Protein G(즉, 면역글로불린 결합 단백질)를 지지체에 사용하여 항체에 결합하고 고 정화 시키는 경우이다.
비공유 고정화 방법의 또 다른 기술은 캡슐화 또는 포획을 기반으로 하는 것으로, 이 분야의 초기 연구는 친화성 리간드 주위에 유기 중합체를 형성함으로써 이러한 유 형의 고정화를 이룬 것이다. 실리케이트 기반 졸 겔로 생성된 무기 물질은 효소, 단 백질 및 기타 친화성 리간드의 포획에서 수년 동안 특별한 관심을 받아왔다. 대안으 로, 친화성 리간드를 지지체 위 또는 내부에 배치하고 가교결합을 통해 포획하거나 리간드가 이 물질을 떠나는 능력을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질 BSA는 이 단백질을 글루타르 알데하이드와 가교 결합하여 포획하는 것이다. 또한, 인간 혈청 알 부민(HSA), alpha1-acid glycoprotein(AGP), IgG 및 기타 제제는 최근 hydrazide 활성화 지지체 및 산화된 글리코겐을 캡핑제(capping agent)로 사용하여 실리카 내 로 포획한다.
친화성 크로마토그래피에서 고정화에 대한 또 다른 대안적인 접근 방식은 분자 각 인을 활용하는 것이다. 이 방법은 키랄 분리에 사용하기 위해 1970년 대 초 개발되었 으나, 현재는 고체상 추출 및 크로마토그래피 방법에도 자주 사용된다. 이 방법의 일 반적인 목표는 원하는 표적에 대한 친화성 리간드로 작용하는 결합 포켓이 있는 지지
체를 만드는 것이다. 분자 각인 고분자(molecularly imprinted polymer: MIP)를 만 드는 한 가지 방법은 표적과 상호작용할 수 있는 작용기를 가진 단량체를 포함하는 중합 혼합물과 표적을 혼합하는 것이다. 그런 다음 타겟은 폴리머에서 세척되어 적용 된 샘플에서 동일한 유형의 타겟을 결합하는 데 사용되는 공동(cavity) 또는 포켓이 있는 지지체를 제공하는 것이다. MIP가 나타내는 상호 작용은 생물학적 시스템의 상 호 작용과 유사하며 저질량 표적의 결합 및 분리에 대한 많은 연구에서 사용되었다.
보다 최근의 연구는 단백질과 같은 거대분자를 가진 MIP의 개발과 사용에 대한 것으 로 MIPS의 고체상 추출 및 친화성 크로마토그래피, 선택적 보관 모두 미립자 지지체 와 단일체로 사용되었다.
8.4. 친화성 크로마토그래피의 결합제
다양한 유형의 친화성 크로마토그래피를 분류하는 한 가지 방법은 분리에 사용되는 결합제의 유형에 따라 다르다. 많은 결합제가 친화성 크로마토그래피에서 고정상으로 활용되었는데, [그림 8.5]에 도시된 바와 같이 자연 발생 결합제와 비생물학적 리간드 가 사용되고 있는 것을 알 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용되는 천연 결합제 는 효소, 항체, 항원, 면역글로불린 결합 단백질, 비오틴+아비딘 또는 스트렙타비딘, 렉틴, 혈청 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산 등이다. 비생물학적 리간드에는 앱타머, 염 료, 금속 이온 킬레이트, MIP 및 보로네이트 등이 있다.
[그림 8.5] 친화성 크로마토그래피에 사용되는 대표적인 생물학적 및 비생물학적 결합 제
8.5. 최신 친화성 크로마토그래피의 응용
친화성 크로마토그래피를 화학적 또는 생화학적 분리, 정제, 분석 또는 특성화에 사용할 수 있는 방법은 매우 다양하다. [그림 8.6]은 연구 간행물을 기반으로 친화성 크로마토그래피가 사용되는 분야의 일부를 나타낸 것이다. 이러한 응용 프로그램의 대부분은 생화학, 생화학 연구 및 분자 생물학 분야에서 이루어지고 있는데 전체 조 사자료의 약 49.2%를 차지하고 있다. 이는 친화성 크로마토그래피가 원래 이러한 분 야와 유사한 생명 공학, 미생물학, 세포 생물학 및 면역학 분야에서도 일반적으로 사 용되고 있음을 의미한다. 분석 화학 및 기타 화학 분야(예: 환경 화학, 임상 화학, 종 합 화학)는 약리학 및 제약 과학(4.2%)과 함께 친화성 크로마토그래피(17.7%)의 또 다른 중요한 응용 분야를 구성하고 있다.
[그림 8.6] 친화성 크로마토그래피의 응용분야
[그림 8.6]에 표시된 많은 응용 분야는 생체 분자의 정제 방법으로 친화성 크로마토그 래피의 사용을 포함하고 있다. 이는 1장에서 논의된 바와 같이 개발 이면에 있는 역 사를 반영한다. 이러한 유형의 응용 분야는 친화성 크로마토그래피의 기능을 사용하 여 주어진 표적에 대해 높은 선택성과 강력한 결합을 모두 제공하므로 복잡한 매트릭 스에 존재하는 경우에도 이 표적을 단 한 단계 또는 몇 단계로 분리할 수 있다. 예를 들면 염료-리간드 또는 생체모방 친화성 크로마토그래피를 사용하는 것과 같이 효소, 천연 단백질 및 재조합 단백질의 소규모 및 대규모 정제 모두에 친화성 크로마토그래
피를 사용하는 것이다.
세포 친화성 크로마토그래피는 친화성 기반 분리에서 표적 정제와 관련된 또 다른 주요 응용 분야이다. 이 분야에서 친화성 크로마토그래피는 세포 표면의 작용제(예:
수용체 또는 당단백질)와 이러한 작용제에 결합하는 리간드 사이의 상호 작용을 사용 하여 특정 유형의 세포를 분리하거나 정제하는 데 사용된다. 이러한 목적으로 사용된 친화성 리간드의 예로는 세포막의 당단백질과 상호작용할 수 있는 렉틴과 특정 표면 단백질에 결합할 수 있는 항체가 있다. 이 분야의 연구는 1970년대 초중반에 간 세포 막의 인슐린 수용체가 친화성 크로마토그래피로 정제되면서 시작되었는데, Con A를 결합제로 사용하여 면역원성이 높은 종양 세포를 분리하였다. 세포 친화성 크로마토 그래피는 분리 흉선 세포, 적혈구, 혈소판, 림프구, 과립구, 정자, 암세포 및 항균 펩 타이드로 이용되고 있는데, 컬럼, 모세관, 마이크로어레이, 자기 안정화 유동층 (magnetically stabilized fluidized beds), 미세유체 장치, 크라이오겔 및 모노리스를 포함한 다양한 형식으로 사용되고 있다.
지난 40년 동안 친화성 크로마토그래피는 중요한 분석 도구로도 사용되었다. 앞서 언급한 바와 같이, 이러한 경향은 주로 HPLC 시스템에 사용하기에 적합한 친화성 크 로마토그래피에 기초하여 고성능 기술이 개발 되었기 때문이다. 친화성 크로마토그래 피의 on/off 용리 모드는 단순성과 속도 및 자동화 용이성으로 인해 이러한 응용 분 야에서 용이하게 응용되었다. 항체 또는 항원, Protein A 또는 Protein G 크로마토 그래피, IMAC, 보로네이트 및 렉틴을 기반으로 하는 분석 방법이 모두 이러한 접근 방식을 기반으로 하고 있다. 중간 농도의 표적 화합물은 종종 온라인 형광 또는 흡광 도 검출기를 사용하거나 질량 분석 또는 컬럼 후 반응 방식을 사용하여 이러한 방법 에서 직접 검출한다. 또한, 친화성 컬럼은 역상 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피 및 모세관 전기영동과 같은 다른 분석 방법과 결합되어 시료 내 화학 물질의 분리 및 /또는 분석을 위한 다차원 기술을 제공하기도 한다. 표적 분석물의 간접 검출은 친화 성 컬럼과 함께 사용할 수도 있다. 이 접근법은 종종 면역 크로마토그래피의 영역에 친화성 컬럼에 사용되는데, 예를 들어, 표적의 표지된 유사체를 사용하여 표적과 경쟁 하거나 이러한 제제 중 하나에 결합할 수 있는 고정된 항체를 포함하는 컬럼에서 표 적에 의해 대체될 수 있다.
친화성 크로마토그래피는 분석 방법에서 시료 전처리 수단으로 사용되기도 한다.
예를 들어 MIP는 종종 고체상 추출에 사용된다. 또 다른 일반적인 예로서 고정된 항 체를 포함하는 친화성 컬럼을 사용하여 다른 방법으로 분석하기 전에 하나 이상의 표 적 용질을 포획하는 면역 추출에 사용하기도 한다. 시료 전처리를 위한 친화성 크로 마토그래피의 또 다른 용도는 동일한 시료의 다른 용질이 추가로 처리되고 측정되기
전에 시료에서 하나 이상의 성분을 선택적으로 제거하는 것이다.
친화성 크로마토그래피의 또 다른 분석 응용은 키랄 분리이다. 키랄 고정상(CSP)은 1970년대 후반에 크로마토그래피 분리에 처음 사용되었으며 현재는 약물 발견 및 개 발을 위한 중요한 도구이기도 하다. 친화성 크로마토그래피의 고정화 기술과 결합제 에서 이미 언급한 키랄 고정상의 예는 MIP, BSA, HSA 또는 AGP와 같은 혈청 단백 질 및 amylose, cellulose, cyclodextrins, cyclofructans을 기반으로 하는 탄수화 물 상(phase)이다. CSP로 사용된 다른 제제는 cellobiohydrolases, α -chymotrypsin, penicillin G acylase, lysozyme; streptavidin, avidin;
ovomucoid 및 항체이다.
친화성 크로마토그래피를 사용할 수 있는 마지막 방법은 생물학적 상호작용을 조사 하는 것이다. 이 방법을 사용할 수 있는 한 가지 방법은 이러한 상호작용의 결합 강 도와 이 과정에 관련된 부위의 수 또는 유형을 특성화하는 것이다. 친화성 크로마토 그래피는 1970년대 초부터 이러한 목적으로 사용되어 왔으며 단백질-단백질, 약물- 단백질, 효소-억제제, 항체-항원, 앱타머-표적 및 수용체-리간드 상호작용 등을 포함 한다. 이에 대한 일반적인 접근 방식은 영역 용출(zonal elution)이며, 이는 이 분석 물을 고정된 결합제가 포함된 친화성 컬럼에 주입할 때 분석물의 보유 또는 피크를 검사하는 방법이다. 결합 연구를 위한 친화성 크로마토그래피에서 자주 사용되는 두 번째 방법은 정면 분석(frontal analysis)이다. 정면 분석은 알려진 농도의 분석물을 친화성 컬럼에 전면 또는 파과 곡선이 형성될 때까지 지속적으로 적용하여 수행한다.
파과 곡선의 위치와 모양은 평형 상수와 친화성 리간드에 대해 적용된 분석물의 결합 부위 수를 결정하는 데 사용할 수 있다.
친화성 크로마토그래피는 생물학적 상호 작용의 역학을 조사하는데 이용될 수 있 다. 다수의 방법이 밴드 확대 측정(band-broadening measurements), 피크 피팅 방법(peak-fitting methods), 스플릿 피크 효과(the split peak effect), 피크 소멸 분석(peak decay analysis)에 기반한 기술로서 1970년대 중반 이래 개발되었다. 이 러한 접근법은 단백질-단백질, 약물-단백질, 항체-항원 및 앱타머-표적 상호작용을 포함하는 다양한 생물학적 시스템을 조사하는 데 사용되었다. 최근 등장한 친화성 크 로마토그래피에 기반한 또 다른 방법은 초고속 친화성 추출이며, 이는 약물-단백질 복합체의 결합 및 해리를 연구하는 데 사용되고 있다. 이 방법은 초 단위에서 밀리초 단위의 시간 영역에서 주입된 시료에서 약물의 결합되지 않은 형태를 추출하기 위해 마이크로 규모의 친화성 컬럼에 고정된 결합제를 사용하는 방법이다. 이 추출에 허용 되는 시간을 변경하여 결합에 대한 평형 상수와 가용성 약물-단백질 복합체에 대한 해리 속도를 모두 측정할 수 있다. 결합 및 동역학 연구를 위한 다른 기술도 친화성
크로마토그래피에 대한 연구로 인해 나타났다. 중요한 예로서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분광법을 기반으로 하는 최신 바이오센서 플랫폼으로, 고정된 에이전트와 용질 의 결합이 시스템의 출구가 아닌 유동 기반 챔버 내에서 검사되는 기술이다.
[참고] 본 자료는 L.Rodriguez, S.Poddar, S.Iftekhar, K.Suh, A. G.Woolfork, S.Ovbude, A.Pekarek, M.Walters, S.L.David, S.Hage, Affinity chromatography: A review of trends and developments over the past 50 years, Journal of Chromatography B, 1157 (2020) pp. 1-16. 자료를 기반으로 작성하였습니다.
