Original Article
pISSN 2233-9019 · eISSN 2233-9116
Korean J Fam Pract. 2015;5(3, suppl. 2):117-121
KJFP
Korean Journal of Family PracticeOriginal Article
pISSN 2233-9019 · eISSN 2233-9116 Korean J Fam Pract. 2015;5(3, suppl. 2):PB-1
KJFP
Korean Journal of Family PracticeReceived June 18, 2015 Revised August 21, 2015 Accepted August 31, 2015 Corresponding Author Jeong-sook Yoon
Tel: +82-70-7609-9913, Fax: +82-70-7005-4230 E-mail: [email protected]
Copyright © 2015 The Korean Academy of Family Medicine
This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted noncommercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
서 론
Pseudomonas aeruginosa
는 주요한 병원감염균이다.1, 2)P
.aeruginosa
병원균은 대부분의 항균제에 내성으로carbapenem
외 에는 쓸 수 있는 항균제가 없는 경우가 많다.3, 4) 그러나carbapenem
에까지 내성인P
.aeruginosa
와Acinetobacter
균이 증가하고 있다.2006
년12
개의3
차 병원5)을 대상으로 한 연구 결과,P
.aeruginosa
의imipenem
내성율은29
%나 되었다.Imipenem
의 내성 기전들 로는 막변형, 항균제 유출, 분해효소 등이 있으며, 분해효소는 주 로metallo
-β
-lactamase
가 많고 대부분이bla
VIM-2나bla
IMP-1이다.6,7)
metallo β
-lactamase
와 유전자에 관한 연구는3
차 병원 분리주 를 대상으로 드물게 이루어져 왔다. 그러나 지역사회를 대표하는1
차 병원 들에서metallo β
-lactamase
에 관한 연구는 거의 없다.8)저자들은
1
차 병원 들에서 전향적 연구로서P
.aeruginosa
균주의imipenem
내성을 살펴보고, 국내에서 흔한metallo β
-lactamase
유 전자인bla
VIM-2,bla
IMP-1,bla
NDM-1을 관찰하고자 하였다.재료 및 방법
1. 배양 및 항균제 감수성 검사
1
차 병원27
병원 들로부터 의뢰온 폐쇄성, 개방성 농, 혈액, 체액, 객담, 소변960
검체를 대상으로 배양 및 항균제 감수성 검사를 실 시했다.1
차 병원의 정의는 외래환자만 보며, 의사수3
인 이내인 경 우로 하였다.3
차 병원에 입원 경력이 있거나 항균제 사용력이 있는 환자는 대상에서 제외하였다. 반복 분리주는 제외하였다. 생화학적 방법과API 20NE system
(bioMerieux
,Marcy 1
’Etoile
,France
) 및한국 1차 병원의 Pseudomonas aeruginosa에서 bla VIM-2 유전자 관찰
윤정숙
*서울 베스티안 병원
bla
VIM-2of Pseudomonas aeruginosa in primary hospitals in Korea
Jeong-sook Yoon*
Director of laboratory medicine, Bestian Seoul Hospital.
Background: In 2007, the resistance rate of Pseudomonas aeruginosa to imipenem was 29% in Korean tertiary hospitals. The main cause of imipenem resistance is the metallo- β-lactamase. A few studies about metallo-β-lactamase are found in tertiary hospitals, however, there are few studies in primary hospitals. Therefore, we studied whether genes encoding metallo-β-lactamase were present in P. aeruginosa isolates from primary hospitals, and studied blaVIM-2, blaIMP-1, blaNDM-1 using molecular methods.
Materials and methods: A total of 960 blood, body fluid, open and closed pus, sputum, and urine specimens obtained from 27 primary hospitals of Bundang district were used this study. A screening test of metallo-β-lactamase was performed. The primers for blaVIM-2, blaIMP-1, and blaNDM-1 were used. DNA was extracted using the AccuPrep Nano-plus Plasmid mini Extraction Kit(Bioneer, Cheongwon, Korea). PCR was performed using AccuPower PCR PreMix(Bioneer).
Results: P. aeruginosa was isolated from 42 of the 960 specimens. After PCR was performed for all 42 isolates using the three sets of metallo-β-lactamase gene-specific primers, blaVIM-2 Was detected in one sputum isolate.
Conclusion: This study gives us warning that the metallo-β-lactamase could spread in the community.
Keywords: Pseudomonas aeruginosa, VIM-2, resistance
Jeongsook Yoon. blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa in primary hospitals in Korea
Korean Journal of Family Practice
KJFP
Vitek
(Biomerieux
,Marcy 1
’Etoile
,France
) 으로 균을 동정하였다.항균제 감수성검사는 디스크확산법 및
Vitek 2 system
(Biomerieux
,Marcy 1
’Etoile
,France
)으로 두가지 모두 검사하였다. 항균제는piperacillin
,tobramycin
,piperacillin
/tazobactam
,cefotaxime
,ceftazidime
,cefepime
,aztreonam
,gentamicin
,amikacin
,ciprofloxacin
,trimethoprim
/sulfamethoxazole
,imipenem
,colistin
을 포함했다. 대조균주는P
.aeruginosa ATCC 27853
으로 하였다.2. 선별 검사
metallo
-β
-lactamase
를 검출하고자Hodge
변법과imipenem
-EDTA
상승 시험을 실시하였다.Hodge
변법은E
.coli ATCC 25922
를McFarland 0
.5
관 탁도로Mueller
-Hinton
한천에 면 봉으로 접종한 후 배지 중앙에imipenem
디스크를 놓고 시험 세 균을imipenem
디스크로부터 획선하였다.24
시간 배양 후 억제 대가 시험 세균의 증식선에 따라 들어가면 양성으로 판독하였다.Imipenem
-EDTA
상승 시험은 시험 세균을McFarland 0
.5
관 탁 도로Mueller
-Hinton
한천에 면봉으로 접종 후10μg imipenem
디 스크와0
.5 M EDTA
디스크를10mm
간격으로 놓고,35
℃에서24
시간 배양한 후 디스크 사이에 억제대가 생기면 양성으로 판독했 다.9, 10)3. metallo-β-lactamase 유전자의 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 1) 시발체
bla
VIM-2,bla
IMP-1,bla
NDM-1에 대한 시발체의 염기서열은 다음과 같다.7, 11, 12)VIM2(1) blaVIM-2 5’ ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG 3’
VIM2(2) blaVIM-2 5’ CTACTCAACGACTGAGCG 3’
IMP1(1) blaIMP-1 5’-CATGGTTTGGTGGTTCTTGT-3’
IMP1(2) blaIMP-1 5’-ATAATTTGGCGGACTTTGGC-3’
NDM1(1) blaNDM-1 5’ ATGGAATTGCCCAATATTATGC 3’
NDM1(2) blaNDM-1 5’ TCAGCGCAGCTTGTCGGCCAT 3’
bla
IMP-1은485 bp
,bla
VIM-2는801 bp
,bla
NDM-1은300 bp
의 띠가 예상되었다.2) 중합효소연쇄반응
AccuPrep Nano
-plus Plasmid mini Extraction Kit
(bioneer
,cheongwon
,Korea
)를 사용하여DNA
를 추출하였다.PCR
은AccuPower PCR PreMix
(bioneer
,cheongwon
,Korea
)를 이용하여 수행하였다.20pmol
짜리primer
각각1μg
,DNA 1μg
씩을 첨가하여 최종 부피
20μL
가 되게 하였다.cycle
은94
℃에서5
분간 둔 후,94
℃에서30
초간denaturation
,56
℃에서30
초간annealing
,72
℃ 에서45
초간extension
을25
회 하였다.7)Gene Amp PCR System 9600
(Perkin
-Elmer Centus Corp
.,Norwalk
,CT
,USA
)을 이용 하여 수행하였다.bla
IMP-1은485 bp
,bla
VIM-2는801 bp
,bla
NDM-1은300 bp
에서 띠를 관찰하였다. 양성 대조 균주는KONSAR
(Korean Nationwide Surveilance of Antimicrobial Resistance
)에서bla
VIM-2와
bla
IMP-1P
.aeruginosa
를 구하였고, 음성 대조 균주는P
.aeruginosa ATCC 27853
균주를 사용하였다.3) 전기영동
증폭된
DNA
산물10μL
를ethidium bromide
(10μL
/ml
)가 첨가 된2
%agarose gel
(Promega
,Madison
,WI
,USA
)에서150 volt
,30
분간 전기영동하였다.7)Size marker
는0
~1
,500 base pair
구간 의100 bp DNA ladder standard
(Gibco Bethesda Research Lab
.,Bethesda
,MA
,USA
)를 이용하였다.결 과
960
검체중P
.aeruginosa
는42
균주 검출되었다(4
.4
%). 항 균제 감수성율을 살펴보면,ceftazidime 87
%,cefotaxime 33
%,cefepime 73
%,aztreonam 80
%,piperacillin 60
%,piperacillin
/tazobactam 82
%,tobramycin 60
%,gentamicin 79
%,amikacin 83
%,ciprofloxacin 69
%,trimethoprim
/sulfamethoxazole 78
%,imipenem 100
%,colistin 100
%의 감수성율을 나타냈다(Table 1
).Table 1. Antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa in primary hospitals
항균제 1차병원 감수성율(%) 3차 병원 감수성율(%)[14]
CAZ 87 78
CTX 33 *
CEP 73 73
IPM 100 71
ATM 80 69
CPF 69 61
TRI 78 *
PIP/Tazo 82 75
AMK 83 75
GM 79 65
PIP 60 63
COL 100 *
abbreviations; IPM: imipenem, ATM: aztreonam, CEP: cefepime, CAZ:ceftazidime, CTX:cefotaxime. CPF: ciprofloxacin, TRI: trimethoprim/
sulfamethoxazole, PIP/Tazo: piperacillin/tazobactam, AMK: amikacin, GM gentamicin, PIP: piperacillin, TOB: tobarmycin, COL: colistin
* no results
윤정숙. 한국 1차 병원의 Pseudomonas aeruginosa에서 blaVIM-2 유전자 관찰 Korean Journal of Family Practice
KJFP
대조군과 비교할 때,
1
차 병원에서의 항균제 감수성율이 더 높았 다(ceftazidime 87
%vs 78
%,imipenem 100
%vs 71
%,aztreonam 80
%vs 69
%,ciprofloxacin 69
%vs 61
%,piperacillin
/tazobactam 82
%vs 75
%,amikacin 83
%vs 75
%,gentamicin 79
%vs 65
%).metallo
-β
-lactamase
선별검사에서 양성균은 관찰되지 않았다.모든
P
.aeruginosa 42
검체를 가지고bla
VIM-2,bla
IMP-1,bla
NDM-1에 대하여PCR
을 시행한 결과, 객담에서 분리된 균주에서metallo
-β
-lactamase gene bla
VIM-2가 검출되어801 bp
에서 띠가 관찰되었 다(Figure 1
).고 찰
P
.aeruginosa
는 기회감염균으로서 주로 병원환경과 중환자 에게 많이 감염된다.1, 2) 병원균은penicillin
,aminoglycoside
,ciprofloxacin
,broad spectrum cephalosporin
,monobactam
모 두에 내성이고imipenem
외에는 쓸 수 있는 항균제가 거의 없 다.3, 4)imipenem
은penicillin
-binding protein
과의 친화력이 우 수하며,ESBL
을 포함한 대부분의β
-lactamase
를 가수분해하여betalactam
내성 세균에 의한 감염증 치료에 유용하게 사용된다. 근 래imipenem
에까지 내성인P
.aeruginosa
와Acinetobacter spp
. 가 증가하였고,Enterobacteriaceae
중에도 내성 균주가 보고되고 있다.13)3
차 병원12
병원을 대상으로 한 연구에서imipenem
내성 율은29
% 였다.14) 다른 연구에서도imipenem
내성율을31
.2
% 로 보고하여,15)3
차 병원의imipenem
내성율은 거의3
분의1
에 달함 을 알 수 있다. 더구나 내성율이2005
년도에는21
%,2006
년도에는29
%로 급속히 증가되고 있다고 하였다. 다른3
차 병원에서도2000
년23
%,2001
년24
%,2002
년28
%,2003
년30
%로서 점점 증가추 세였다.14, 19)Enterobacteriaceae
에도carbapenem
내성이 전달되어CRE
(carbapenem resistant Enterobacteriaceae
)로 발표되고 있다.16)Imipenem
내성균의 치료로는colistin
과tigecycline
이 비교적 효 과적이라고 한다.6, 17)Imipenem
의 내성기전으로는 막변형으로 인 한 항균제 축적의 감소나 유출 펌프 때문으로 사료되고,imipenem
분해효소도 있다.Carbapenem
분해 효소는 기능성 분류로Ambler class A
인serine
형,class B
인metallo
-β
-lactamase
,class D
인oxacillinase
가 있다.Imipenem
내성은 주로class B
인metallo
-β
-lactamase
에 의하고,6, 18)metallo
-β
-lactamase
는monobactam
을 제외한β
-lactam
제제에 내성이며,clavulanic acid
에 의해서는 효소 활성이 억제되지 않으나, 금속 이온chelator
인EDTA
에 의 해서는 억제된다.19) 국내에bla
IMP가 발견된 이후 여러 종이 발견 되었고 그 중VIM
-2
,IMP
-1
이 가장 많이 보고되어 있다.13, 19)581 P
.aeruginosa
균주 중bla
VIM-2 유전자를 나타낸 것은34
균주,bla
IMP-1 유전자를 나타낸 것은2
균주였다.7)metallo
-β
-lactamase
는plasmid
나transposon
내에 다른 항균제 내성 유전자와 함께integron
상태로 공존하므로17) 쉽게 획득되어 전파가 가능하고 다제 내성균으로 발전할 수 있다.Integron
의 구조와 크기는 각각 다르 며, 이들은 플라즈미드나 염색체내에서 수평이동으로써 다른 균에 전달될 수 있다.transconjugant
실험에서integron
이E
.coli J53
으 로 전달되는 것을 확인한 바 있다.bla
VIM-2의 구조는3
-6kb
로 다양 하고, 위치와 서열이 다양하다.13)이런 상황에서 국내
1
차 병원에서metallo
-β
-lactamase
와 유 전자를 연구한 것은 거의 없다.3
차 병원에서imipenem
내성균이 급증하는 현실에서 지역사회의 감염감시 업무를 소홀히 할 수 없 을 것이다. 그러나 현재1
차 병원의 연구는 거의 없어, 저자들은1
차 병원에서의metallo
-β
-lactamase
와 유전자를 살펴보기로 하였 다. 더욱이 최근에는 미국과 여러나라에서metallo
-β
-lactamase
인bla
NDM-1의 유행이 보고되고 있다.NDM
-1
형은2008
년도 인도를여행한 스웨덴인에서 처음 보고되었으며, 최근 국내 질병관리본부 에서도
bla
NDM-1이 보고되었다.20, 21)bla
NDM-1은 주로Klebsiella
나E
.coli
균주 및P
.aeruginosa
에서 보고된다.16, 22, 23)이번 연구에서
1
차 병원들로부터 의뢰온960
검체들 중42
검체 가P
.aeruginosa
로 판명되어12
개3
차 병원 연구보다 낮은 빈도 로 검출되었다.14) 역시1
차 병원에서3
차 병원의 빈도보다 낮은 빈 도를 나타냈다. 이번 연구의 항균제 감수성율은ceftazidime 87
%,cefotaxime 33
%,cefepime 73
%,aztreonam 80
%,piperacillin 60
%,piperacillin
/tazobactam 82
%,tobramycin 60
%,gentamicin
The primers for blaVIM-2, blaIMP-1, and blaNDM-1 were used. DNA was extracted using the AccuPrep Nano-plus Plasmid mini Extraction Kit (Bioneer, Cheongwon, Korea). PCR was performed using AccuPower PCR PreMix (Bioneer)
Figure 1. blaVIM-2 detected on 801 bp. band by PCR
Jeongsook Yoon. blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa in primary hospitals in Korea
Korean Journal of Family Practice
KJFP
79
%,amikacin 83
%,ciprofloxacin 69
%,trimethoprim
/sulfamethoxazole 78
%,imipenem 100
%,colistin 100
%의 감수 성율을 나타냈다(Table 1
). 항균제 감수성율은 시흥지역을 대상 으로 한 이전 연구와 매우 유사하였다.8)3
차 병원의 연구에서는ceftazidime 78
%,cefepime 73
%,aztreonam 69
%,piperacillin
/tazobactam 75
%,amikacin 75
%,gentamicin 65
%를 나타냈고, 따 라서1
차 병원의 연구가 더 높은 항균제 감수성율을 나타냈다.14) 이 번 연구에서 검출된42
주의P
.aeruginosa
중에imipenem
내성은 없 었다.1
차 병원에imipenem
내성균이 거의 없고, 아직imipenem
이 유효한 치료 효과가 있음을 알 수 있다.3
차 병원이나 대학 병원 에서imipenem
내성율이 거의30
%에 육박함과 비교하여 지역사회 를 대표하는1
차 병원에는imipenem
내성균이 발견되지 않아3
차 병원과 큰 차이를 나타내었다.그러나 이번 연구에서
bla
VIM-2가1
차 병원에서 검출되었다 (Figure 1
). 객담 검체에서 분리된 균주로PCR
을 시행한 결과,801 bp
에서 정확한 띠가 관찰되었다. 스크리닝 검사와의 불일치의 이 유는 유전자 수준에서의bla
VIM-2 유전자가 충분히metallo
-β
-lactamase
단백을 형성하지 않았기 때문으로 사료된다. 이 환자는community
에서 균을 획득했고 이전 입원경력이나 항균제 사용력 이 없으므로 ‘community onset infection
’으로 정의된다.3
차 병원의 국내 보고에서도20
균주의metallo
-β
-lactamase
생성 균주 중19
균주가bla
VIM-2를 보유하고 있어metallo
-β
-lactamase
유전자 중 대다수가bla
VIM-2임을 나타냈다.19) 또, 한3
차 병원에서도bla
VIM-2 유전자를 가진P
.aeruginosa
의 빈도는1997
년11
.5
%,1998
년8
.2
%,1999
년5
.9
% 로 꾸준히 보고되었다고 하였 다.24)본 연구에서
imipenem
디스크 확산법에서는26mm
로 감수성, 액체배지희석법에서는MIC 2μg
/mL
, 한천 희석법은2μg
/mL
로 감 수성이었다.Imipenem
감수성균에서metallo
-β
-lactamase
유전자
bla
VIM-2가 검출되었는데, 어떤 보고에서는carbapenemase
를 생성하는
P
.aeruginosa
라고 해도, 그 중3
분의1
은 항균제 감수성 범 위 내에 들었다고 하여,carbapenemase
를 생성하여도 감수성 균이 상당수를 차지함을 나타냈다.17) 내성유전자가 있어도carbapenem
제제의 종류에 따라 내성 정도가 다른 것으로 보고되어 있으므로ertapenem
,meropenem MIC
을 검사하였다. 그 결과ertapenem
,meropenem MIC
는1µg
/mL
,2µg
/mL
이었다.국내
3
차 병원에서도imipenem
감수성 균에서bla
VIM-2 빈도 를 살펴보면 총 빈도는 지금보다 높아질 것이다. 따라서 이 현상은metallo
-β
-lactamase
를 생성하지 못하거나, 적게 생성하므로 아 직 내성 표현형을 나타내지 않는plasmid level
의gene transference
나 다른
clone
간의genetic exchange
를 나타내는 것으로 사료된 다.Shenoy
등의 연구에서도PCR
에서bla
NDM-1을 나타낸 경우,screeing test
에서metallo
-β
-lactamase
가 검출된 경우는 일부였다 고 하였다.25) 그리고 현재metallo
-β
-lactamase
유전자bla
VIM-2가 국내1
차 병원으로 전파되어 있는 상황으로 사료된다. 지역사회에서metallo
-β
-lactamase
생성균의 감시를 더욱 철저히 하여야 할 것 으로 생각된다. 이를 위해서는Metalo
-β
-lactamase
의 빠른 검출을 위해서 분자적 검출이 필요하다. 결론적으로 국내1
차 병원에서P
.aeruginosa 42
균주 중 한 균주에서bla
VIM-2를 나타냈다. 아직1
차 병원에metallo
-β
-lactamase
에 의한imipenem
내성균이 만연하 지는 않으나 분자적 수준의 유전자 전이를 나타내는 것으로 고려되 어, 지역사회에metallo
-β
-lactamase bla
VIM-2 유전자가 침투, 확산 되어 있다고 생각된다. 분자 유전 수단을 통한 감염 감시 관리를 철 저히 하여야 할 것이다.요 약
연구배경:
2007
년, 한국3
차 병원에서Pseudomonas aeruginosa
의imipenem
내성율은29
%였다. 내성의 가장 흔한 원인은Metallo
-β
-lactamase
이다.3
차 병원에서는metallo
-β
-lactamases
에 관한 보고들이 있으나,1
차 병원에서 이에 대한 연구는 거의 없다. 이 연 구의 목적은1
차 병원들에서metallo
-β
-lactamase
가 존재하는지 와 한국에서 흔한bla
VIM-2,bla
IMP-1 유전자 및bla
NDM-1을 분자적으 로 검출하고자 한 것이다.재료 및 방법: 연구 대상은
27
개의 분당지역1
차 병원들로부터 의 뢰온 개방성 또는 폐쇄성 창상, 혈액, 체액, 객담, 소변960
검체였 다. 이들에서 분리된P
.aeruginosa
에서metallo
-β
-lactamase
선 별 검사를 실시하였다. 시발체bla
VIM-2,bla
IMP-1,bla
NDM-1를 제조 하였다. 검체에서AccuPrep Nano
-plus Plasmid mini Extraction Kit
(bioneer
,cheongwon
,Korea
)를 이용하여DNA
를 추출한 후,AccuPower PCR PreMix
를 이용하여PCR
을 수행하였다.결과:
960
검체중P
.aeruginosa
는42
검체에서 분리되었다 (4
.4
%).42
검체 모두를PCR
한 결과1
균주에서bla
VIM-2, 가 검출되었다.결론: 한국의
1
차 병원들의P
.aeruginosa
균주에서bla
VIM-2가 검출 되었다.metallo
-β
-lactamase
유전자를 검출하기 위한surveillance
프로그램이 필요할 것이다.윤정숙. 한국 1차 병원의 Pseudomonas aeruginosa에서 blaVIM-2 유전자 관찰 Korean Journal of Family Practice
KJFP
중심단어: 녹농균,
VIM
-2
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