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blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa in primary hospitals in Korea

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Original Article

pISSN 2233-9019 · eISSN 2233-9116

Korean J Fam Pract. 2015;5(3, suppl. 2):117-121

KJFP

Korean Journal of Family Practice

Original Article

pISSN 2233-9019 · eISSN 2233-9116 Korean J Fam Pract. 2015;5(3, suppl. 2):PB-1

KJFP

Korean Journal of Family Practice

Received June 18, 2015 Revised August 21, 2015 Accepted August 31, 2015 Corresponding Author Jeong-sook Yoon

Tel: +82-70-7609-9913, Fax: +82-70-7005-4230 E-mail: [email protected]

Copyright © 2015 The Korean Academy of Family Medicine

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted noncommercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

서 론

Pseudomonas aeruginosa

는 주요한 병원감염균이다.1, 2)

P

.

aeruginosa

병원균은 대부분의 항균제에 내성으로

carbapenem

에는 쓸 수 있는 항균제가 없는 경우가 많다.3, 4) 그러나

carbapenem

에까지 내성인

P

.

aeruginosa

Acinetobacter

균이 증가하고 있다.

2006

12

개의

3

차 병원5)을 대상으로 한 연구 결과,

P

.

aeruginosa

imipenem

내성율은

29

%나 되었다.

Imipenem

의 내성 기전들 로는 막변형, 항균제 유출, 분해효소 등이 있으며, 분해효소는 주 로

metallo

-

β

-

lactamase

가 많고 대부분이

bla

VIM-2

bla

IMP-1이다.6,

7)

metallo β

-

lactamase

와 유전자에 관한 연구는

3

차 병원 분리주 를 대상으로 드물게 이루어져 왔다. 그러나 지역사회를 대표하는

1

차 병원 들에서

metallo β

-

lactamase

에 관한 연구는 거의 없다.8)

저자들은

1

차 병원 들에서 전향적 연구로서

P

.

aeruginosa

균주의

imipenem

내성을 살펴보고, 국내에서 흔한

metallo β

-

lactamase

전자인

bla

VIM-2,

bla

IMP-1,

bla

NDM-1을 관찰하고자 하였다.

재료 및 방법

1. 배양 및 항균제 감수성 검사

1

차 병원

27

병원 들로부터 의뢰온 폐쇄성, 개방성 농, 혈액, 체액, 객담, 소변

960

검체를 대상으로 배양 및 항균제 감수성 검사를 실 시했다.

1

차 병원의 정의는 외래환자만 보며, 의사수

3

인 이내인 경 우로 하였다.

3

차 병원에 입원 경력이 있거나 항균제 사용력이 있는 환자는 대상에서 제외하였다. 반복 분리주는 제외하였다. 생화학적 방법과

API 20NE system

(

bioMerieux

,

Marcy 1

Etoile

,

France

) 및

한국 1차 병원의 Pseudomonas aeruginosa에서 bla VIM-2 유전자 관찰

윤정숙

*

서울 베스티안 병원

bla

VIM-2

of Pseudomonas aeruginosa in primary hospitals in Korea

Jeong-sook Yoon*

Director of laboratory medicine, Bestian Seoul Hospital.

Background: In 2007, the resistance rate of Pseudomonas aeruginosa to imipenem was 29% in Korean tertiary hospitals. The main cause of imipenem resistance is the metallo- β-lactamase. A few studies about metallo-β-lactamase are found in tertiary hospitals, however, there are few studies in primary hospitals. Therefore, we studied whether genes encoding metallo-β-lactamase were present in P. aeruginosa isolates from primary hospitals, and studied blaVIM-2, blaIMP-1, blaNDM-1 using molecular methods.

Materials and methods: A total of 960 blood, body fluid, open and closed pus, sputum, and urine specimens obtained from 27 primary hospitals of Bundang district were used this study. A screening test of metallo-β-lactamase was performed. The primers for blaVIM-2, blaIMP-1, and blaNDM-1 were used. DNA was extracted using the AccuPrep Nano-plus Plasmid mini Extraction Kit(Bioneer, Cheongwon, Korea). PCR was performed using AccuPower PCR PreMix(Bioneer).

Results: P. aeruginosa was isolated from 42 of the 960 specimens. After PCR was performed for all 42 isolates using the three sets of metallo-β-lactamase gene-specific primers, blaVIM-2 Was detected in one sputum isolate.

Conclusion: This study gives us warning that the metallo-β-lactamase could spread in the community.

Keywords: Pseudomonas aeruginosa, VIM-2, resistance

(2)

Jeongsook Yoon. blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa in primary hospitals in Korea

Korean Journal of Family Practice

KJFP

Vitek

(

Biomerieux

,

Marcy 1

Etoile

,

France

) 으로 균을 동정하였다.

항균제 감수성검사는 디스크확산법 및

Vitek 2 system

(

Biomerieux

,

Marcy 1

Etoile

,

France

)으로 두가지 모두 검사하였다. 항균제는

piperacillin

,

tobramycin

,

piperacillin

/

tazobactam

,

cefotaxime

,

ceftazidime

,

cefepime

,

aztreonam

,

gentamicin

,

amikacin

,

ciprofloxacin

,

trimethoprim

/

sulfamethoxazole

,

imipenem

,

colistin

을 포함했다. 대조균주는

P

.

aeruginosa ATCC 27853

으로 하였다.

2. 선별 검사

metallo

-

β

-

lactamase

를 검출하고자

Hodge

변법과

imipenem

-

EDTA

상승 시험을 실시하였다.

Hodge

변법은

E

.

coli ATCC 25922

McFarland 0

.

5

관 탁도로

Mueller

-

Hinton

한천에 면 봉으로 접종한 후 배지 중앙에

imipenem

디스크를 놓고 시험 세 균을

imipenem

디스크로부터 획선하였다.

24

시간 배양 후 억제 대가 시험 세균의 증식선에 따라 들어가면 양성으로 판독하였다.

Imipenem

-

EDTA

상승 시험은 시험 세균을

McFarland 0

.

5

관 탁 도로

Mueller

-

Hinton

한천에 면봉으로 접종 후

10μg imipenem

스크와

0

.

5 M EDTA

디스크를

10mm

간격으로 놓고,

35

℃에서

24

시간 배양한 후 디스크 사이에 억제대가 생기면 양성으로 판독했 다.9, 10)

3. metallo-β-lactamase 유전자의 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 1) 시발체

bla

VIM-2,

bla

IMP-1,

bla

NDM-1에 대한 시발체의 염기서열은 다음과 같다.7, 11, 12)

VIM2(1) blaVIM-2 5’ ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG 3’

VIM2(2) blaVIM-2 5’ CTACTCAACGACTGAGCG 3’

IMP1(1) blaIMP-1 5’-CATGGTTTGGTGGTTCTTGT-3’

IMP1(2) blaIMP-1 5’-ATAATTTGGCGGACTTTGGC-3’

NDM1(1) blaNDM-1 5’ ATGGAATTGCCCAATATTATGC 3’

NDM1(2) blaNDM-1 5’ TCAGCGCAGCTTGTCGGCCAT 3’

bla

IMP-1

485 bp

,

bla

VIM-2

801 bp

,

bla

NDM-1

300 bp

의 띠가 예상되었다.

2) 중합효소연쇄반응

AccuPrep Nano

-

plus Plasmid mini Extraction Kit

(

bioneer

,

cheongwon

,

Korea

)를 사용하여

DNA

를 추출하였다.

PCR

AccuPower PCR PreMix

(

bioneer

,

cheongwon

,

Korea

)를 이용하여 수행하였다.

20pmol

짜리

primer

각각

1μg

,

DNA 1μg

씩을 첨가하

여 최종 부피

20μL

가 되게 하였다.

cycle

94

℃에서

5

분간 둔 후,

94

℃에서

30

초간

denaturation

,

56

℃에서

30

초간

annealing

,

72

에서

45

초간

extension

25

회 하였다.7)

Gene Amp PCR System 9600

(

Perkin

-

Elmer Centus Corp

.,

Norwalk

,

CT

,

USA

)을 이용 하여 수행하였다.

bla

IMP-1

485 bp

,

bla

VIM-2

801 bp

,

bla

NDM-1

300 bp

에서 띠를 관찰하였다. 양성 대조 균주는

KONSAR

(

Korean Nationwide Surveilance of Antimicrobial Resistance

)에서

bla

VIM-2

bla

IMP-1

P

.

aeruginosa

를 구하였고, 음성 대조 균주는

P

.

aeruginosa ATCC 27853

균주를 사용하였다.

3) 전기영동

증폭된

DNA

산물

10μL

ethidium bromide

(

10μL

/

ml

)가 첨가

2

%

agarose gel

(

Promega

,

Madison

,

WI

,

USA

)에서

150 volt

,

30

분간 전기영동하였다.7)

Size marker

0

~

1

,

500 base pair

구간

100 bp DNA ladder standard

(

Gibco Bethesda Research Lab

.,

Bethesda

,

MA

,

USA

)를 이용하였다.

결 과

960

검체중

P

.

aeruginosa

42

균주 검출되었다(

4

.

4

%). 항 균제 감수성율을 살펴보면,

ceftazidime 87

%,

cefotaxime 33

%,

cefepime 73

%,

aztreonam 80

%,

piperacillin 60

%,

piperacillin

/

tazobactam 82

%,

tobramycin 60

%,

gentamicin 79

%,

amikacin 83

%,

ciprofloxacin 69

%,

trimethoprim

/

sulfamethoxazole 78

%,

imipenem 100

%,

colistin 100

%의 감수성율을 나타냈다(

Table 1

).

Table 1. Antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa in primary hospitals

항균제 1차병원 감수성율(%) 3차 병원 감수성율(%)[14]

CAZ 87 78

CTX 33 *

CEP 73 73

IPM 100 71

ATM 80 69

CPF 69 61

TRI 78 *

PIP/Tazo 82 75

AMK 83 75

GM 79 65

PIP 60 63

COL 100 *

abbreviations; IPM: imipenem, ATM: aztreonam, CEP: cefepime, CAZ:ceftazidime, CTX:cefotaxime. CPF: ciprofloxacin, TRI: trimethoprim/

sulfamethoxazole, PIP/Tazo: piperacillin/tazobactam, AMK: amikacin, GM gentamicin, PIP: piperacillin, TOB: tobarmycin, COL: colistin

* no results

(3)

윤정숙. 한국 1차 병원의 Pseudomonas aeruginosa에서 blaVIM-2 유전자 관찰 Korean Journal of Family Practice

KJFP

대조군과 비교할 때,

1

차 병원에서의 항균제 감수성율이 더 높았 다(

ceftazidime 87

%

vs 78

%,

imipenem 100

%

vs 71

%,

aztreonam 80

%

vs 69

%,

ciprofloxacin 69

%

vs 61

%,

piperacillin

/

tazobactam 82

%

vs 75

%,

amikacin 83

%

vs 75

%,

gentamicin 79

%

vs 65

%).

metallo

-

β

-

lactamase

선별검사에서 양성균은 관찰되지 않았다.

모든

P

.

aeruginosa 42

검체를 가지고

bla

VIM-2,

bla

IMP-1,

bla

NDM-1에 대하여

PCR

을 시행한 결과, 객담에서 분리된 균주에서

metallo

-

β

-

lactamase gene bla

VIM-2가 검출되어

801 bp

에서 띠가 관찰되었 다(

Figure 1

).

고 찰

P

.

aeruginosa

는 기회감염균으로서 주로 병원환경과 중환자 에게 많이 감염된다.1, 2) 병원균은

penicillin

,

aminoglycoside

,

ciprofloxacin

,

broad spectrum cephalosporin

,

monobactam

두에 내성이고

imipenem

외에는 쓸 수 있는 항균제가 거의 없 다.3, 4)

imipenem

penicillin

-

binding protein

과의 친화력이 우 수하며,

ESBL

을 포함한 대부분의

β

-

lactamase

를 가수분해하여

betalactam

내성 세균에 의한 감염증 치료에 유용하게 사용된다. 근 래

imipenem

에까지 내성인

P

.

aeruginosa

Acinetobacter spp

. 가 증가하였고,

Enterobacteriaceae

중에도 내성 균주가 보고되고 있다.13)

3

차 병원

12

병원을 대상으로 한 연구에서

imipenem

내성 율은

29

% 였다.14) 다른 연구에서도

imipenem

내성율을

31

.

2

% 로 보고하여,15)

3

차 병원의

imipenem

내성율은 거의

3

분의

1

에 달함 을 알 수 있다. 더구나 내성율이

2005

년도에는

21

%,

2006

년도에는

29

%로 급속히 증가되고 있다고 하였다. 다른

3

차 병원에서도

2000

23

%,

2001

24

%,

2002

28

%,

2003

30

%로서 점점 증가추 세였다.14, 19)

Enterobacteriaceae

에도

carbapenem

내성이 전달되어

CRE

(

carbapenem resistant Enterobacteriaceae

)로 발표되고 있다.16)

Imipenem

내성균의 치료로는

colistin

tigecycline

이 비교적 효 과적이라고 한다.6, 17)

Imipenem

의 내성기전으로는 막변형으로 인 한 항균제 축적의 감소나 유출 펌프 때문으로 사료되고,

imipenem

분해효소도 있다.

Carbapenem

분해 효소는 기능성 분류로

Ambler class A

serine

형,

class B

metallo

-

β

-

lactamase

,

class D

oxacillinase

가 있다.

Imipenem

내성은 주로

class B

metallo

-

β

-

lactamase

에 의하고,6, 18)

metallo

-

β

-

lactamase

monobactam

을 제외한

β

-

lactam

제제에 내성이며,

clavulanic acid

에 의해서는 효소 활성이 억제되지 않으나, 금속 이온

chelator

EDTA

에 의 해서는 억제된다.19) 국내에

bla

IMP가 발견된 이후 여러 종이 발견 되었고 그 중

VIM

-

2

,

IMP

-

1

이 가장 많이 보고되어 있다.13, 19)

581 P

.

aeruginosa

균주 중

bla

VIM-2 유전자를 나타낸 것은

34

균주,

bla

IMP-1 유전자를 나타낸 것은

2

균주였다.7)

metallo

-

β

-

lactamase

plasmid

transposon

내에 다른 항균제 내성 유전자와 함께

integron

상태로 공존하므로17) 쉽게 획득되어 전파가 가능하고 다제 내성균으로 발전할 수 있다.

Integron

의 구조와 크기는 각각 다르 며, 이들은 플라즈미드나 염색체내에서 수평이동으로써 다른 균에 전달될 수 있다.

transconjugant

실험에서

integron

E

.

coli J53

로 전달되는 것을 확인한 바 있다.

bla

VIM-2의 구조는

3

-

6kb

로 다양 하고, 위치와 서열이 다양하다.13)

이런 상황에서 국내

1

차 병원에서

metallo

-

β

-

lactamase

와 유 전자를 연구한 것은 거의 없다.

3

차 병원에서

imipenem

내성균이 급증하는 현실에서 지역사회의 감염감시 업무를 소홀히 할 수 없 을 것이다. 그러나 현재

1

차 병원의 연구는 거의 없어, 저자들은

1

차 병원에서의

metallo

-

β

-

lactamase

와 유전자를 살펴보기로 하였 다. 더욱이 최근에는 미국과 여러나라에서

metallo

-

β

-

lactamase

bla

NDM-1의 유행이 보고되고 있다.

NDM

-

1

형은

2008

년도 인도를

여행한 스웨덴인에서 처음 보고되었으며, 최근 국내 질병관리본부 에서도

bla

NDM-1이 보고되었다.20, 21)

bla

NDM-1은 주로

Klebsiella

E

.

coli

균주 및

P

.

aeruginosa

에서 보고된다.16, 22, 23)

이번 연구에서

1

차 병원들로부터 의뢰온

960

검체들 중

42

검체

P

.

aeruginosa

로 판명되어

12

3

차 병원 연구보다 낮은 빈도 로 검출되었다.14) 역시

1

차 병원에서

3

차 병원의 빈도보다 낮은 빈 도를 나타냈다. 이번 연구의 항균제 감수성율은

ceftazidime 87

%,

cefotaxime 33

%,

cefepime 73

%,

aztreonam 80

%,

piperacillin 60

%,

piperacillin

/

tazobactam 82

%,

tobramycin 60

%,

gentamicin

The primers for blaVIM-2, blaIMP-1, and blaNDM-1 were used. DNA was extracted using the AccuPrep Nano-plus Plasmid mini Extraction Kit (Bioneer, Cheongwon, Korea). PCR was performed using AccuPower PCR PreMix (Bioneer)

Figure 1. blaVIM-2 detected on 801 bp. band by PCR

(4)

Jeongsook Yoon. blaVIM-2 of Pseudomonas aeruginosa in primary hospitals in Korea

Korean Journal of Family Practice

KJFP

79

%,

amikacin 83

%,

ciprofloxacin 69

%,

trimethoprim

/

sulfamethoxazole 78

%,

imipenem 100

%,

colistin 100

%의 감수 성율을 나타냈다(

Table 1

). 항균제 감수성율은 시흥지역을 대상 으로 한 이전 연구와 매우 유사하였다.8)

3

차 병원의 연구에서는

ceftazidime 78

%,

cefepime 73

%,

aztreonam 69

%,

piperacillin

/

tazobactam 75

%,

amikacin 75

%,

gentamicin 65

%를 나타냈고, 따 라서

1

차 병원의 연구가 더 높은 항균제 감수성율을 나타냈다.14) 이 번 연구에서 검출된

42

주의

P

.

aeruginosa

중에

imipenem

내성은 없 었다.

1

차 병원에

imipenem

내성균이 거의 없고, 아직

imipenem

이 유효한 치료 효과가 있음을 알 수 있다.

3

차 병원이나 대학 병원 에서

imipenem

내성율이 거의

30

%에 육박함과 비교하여 지역사회 를 대표하는

1

차 병원에는

imipenem

내성균이 발견되지 않아

3

병원과 큰 차이를 나타내었다.

그러나 이번 연구에서

bla

VIM-2

1

차 병원에서 검출되었다 (

Figure 1

). 객담 검체에서 분리된 균주로

PCR

을 시행한 결과,

801 bp

에서 정확한 띠가 관찰되었다. 스크리닝 검사와의 불일치의 이 유는 유전자 수준에서의

bla

VIM-2 유전자가 충분히

metallo

-

β

-

lactamase

단백을 형성하지 않았기 때문으로 사료된다. 이 환자는

community

에서 균을 획득했고 이전 입원경력이나 항균제 사용력 이 없으므로 ‘

community onset infection

’으로 정의된다.

3

차 병원의 국내 보고에서도

20

균주의

metallo

-

β

-

lactamase

생성 균주 중

19

균주가

bla

VIM-2를 보유하고 있어

metallo

-

β

-

lactamase

유전자 중 대다수가

bla

VIM-2임을 나타냈다.19) 또, 한

3

병원에서도

bla

VIM-2 유전자를 가진

P

.

aeruginosa

의 빈도는

1997

11

.

5

%,

1998

8

.

2

%,

1999

5

.

9

% 로 꾸준히 보고되었다고 하였 다.24)

본 연구에서

imipenem

디스크 확산법에서는

26mm

로 감수성, 액체배지희석법에서는

MIC 2μg

/

mL

, 한천 희석법은

2μg

/

mL

로 감 수성이었다.

Imipenem

감수성균에서

metallo

-

β

-

lactamase

유전

bla

VIM-2가 검출되었는데, 어떤 보고에서는

carbapenemase

를 생

성하는

P

.

aeruginosa

라고 해도, 그 중

3

분의

1

은 항균제 감수성 범 위 내에 들었다고 하여,

carbapenemase

를 생성하여도 감수성 균이 상당수를 차지함을 나타냈다.17) 내성유전자가 있어도

carbapenem

제제의 종류에 따라 내성 정도가 다른 것으로 보고되어 있으므로

ertapenem

,

meropenem MIC

을 검사하였다. 그 결과

ertapenem

,

meropenem MIC

1µg

/

mL

,

2µg

/

mL

이었다.

국내

3

차 병원에서도

imipenem

감수성 균에서

bla

VIM-2 빈도 를 살펴보면 총 빈도는 지금보다 높아질 것이다. 따라서 이 현상은

metallo

-

β

-

lactamase

를 생성하지 못하거나, 적게 생성하므로 아 직 내성 표현형을 나타내지 않는

plasmid level

gene transference

나 다른

clone

간의

genetic exchange

를 나타내는 것으로 사료된 다.

Shenoy

등의 연구에서도

PCR

에서

bla

NDM-1을 나타낸 경우,

screeing test

에서

metallo

-

β

-

lactamase

가 검출된 경우는 일부였다 고 하였다.25) 그리고 현재

metallo

-

β

-

lactamase

유전자

bla

VIM-2가 국내

1

차 병원으로 전파되어 있는 상황으로 사료된다. 지역사회에서

metallo

-

β

-

lactamase

생성균의 감시를 더욱 철저히 하여야 할 것 으로 생각된다. 이를 위해서는

Metalo

-

β

-

lactamase

의 빠른 검출을 위해서 분자적 검출이 필요하다. 결론적으로 국내

1

차 병원에서

P

.

aeruginosa 42

균주 중 한 균주에서

bla

VIM-2를 나타냈다. 아직

1

병원에

metallo

-

β

-

lactamase

에 의한

imipenem

내성균이 만연하 지는 않으나 분자적 수준의 유전자 전이를 나타내는 것으로 고려되 어, 지역사회에

metallo

-

β

-

lactamase bla

VIM-2 유전자가 침투, 확산 되어 있다고 생각된다. 분자 유전 수단을 통한 감염 감시 관리를 철 저히 하여야 할 것이다.

요 약

연구배경:

2007

년, 한국

3

차 병원에서

Pseudomonas aeruginosa

imipenem

내성율은

29

%였다. 내성의 가장 흔한 원인은

Metallo

-

β

-

lactamase

이다.

3

차 병원에서는

metallo

-

β

-

lactamases

에 관한 보고들이 있으나,

1

차 병원에서 이에 대한 연구는 거의 없다. 이 연 구의 목적은

1

차 병원들에서

metallo

-

β

-

lactamase

가 존재하는지 와 한국에서 흔한

bla

VIM-2,

bla

IMP-1 유전자 및

bla

NDM-1을 분자적으 로 검출하고자 한 것이다.

재료 및 방법: 연구 대상은

27

개의 분당지역

1

차 병원들로부터 의 뢰온 개방성 또는 폐쇄성 창상, 혈액, 체액, 객담, 소변

960

검체였 다. 이들에서 분리된

P

.

aeruginosa

에서

metallo

-

β

-

lactamase

별 검사를 실시하였다. 시발체

bla

VIM-2,

bla

IMP-1,

bla

NDM-1를 제조 하였다. 검체에서

AccuPrep Nano

-

plus Plasmid mini Extraction Kit

(

bioneer

,

cheongwon

,

Korea

)를 이용하여

DNA

를 추출한 후,

AccuPower PCR PreMix

를 이용하여

PCR

을 수행하였다.

결과:

960

검체중

P

.

aeruginosa

42

검체에서 분리되었다 (

4

.

4

%).

42

검체 모두를

PCR

한 결과

1

균주에서

bla

VIM-2, 가 검출되었다.

결론: 한국의

1

차 병원들의

P

.

aeruginosa

균주에서

bla

VIM-2가 검출 되었다.

metallo

-

β

-

lactamase

유전자를 검출하기 위한

surveillance

프로그램이 필요할 것이다.

(5)

윤정숙. 한국 1차 병원의 Pseudomonas aeruginosa에서 blaVIM-2 유전자 관찰 Korean Journal of Family Practice

KJFP

중심단어: 녹농균,

VIM

-

2

, 내성균 REFERENCES

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수치

Table 1. Antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa in primary  hospitals 항균제 1차병원 감수성율(%) 3차 병원 감수성율(%)[14] CAZ 87 78 CTX 33 * CEP 73 73 IPM 100 71 ATM 80 69 CPF 69 61 TRI 78 * PIP/Tazo 82 75 AMK 83 75 GM 79 65 PIP  60 63 COL 100 *
Figure 1. bla VIM-2  detected on 801 bp. band by PCR

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