98 책임저자：최영현, 614-052, 부산광역시 부산진구 양정동
산 45번지, 동의대학교 한의과대학 생화학교실 Tel: 051-850-7413, Fax: 051-853-4036
E-mail: [email protected]
접수일：2007년 6월 14일, 게재승인일：2007년 6월 22일
Correspondence to：Yung Hyun Choi
Department of Biochemistry, Dongeui University College of Oriental Medicine, San 45, Yangjeong-dong, Busanjin-gu, Busan 614-052, Korea Tel: +82-51-850-7413, Fax: +82-51-853-4036
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신령버섯 추출물에 의한 U937 인체 백혈병세포의 Apoptosis 유발
1부산대학교 자연과학대학 미생물학과, 2동의대학교 한의과대학 생화학교실
김성윤1,2ㆍ박 철2ㆍ정진우1ㆍ이재동1ㆍ최영현2
Apoptotic Cell Death by Water Extract of Agaricus Blazei Murill in Human Leukemia U937 Cells
Cheung-Yun Jin1,2, Cheol Park2, Jin-woo Jeong1, Jae Dong Lee1 and Yung Hyun Choi2
1Department of Microbiology, College of Natural Sciences, Pusan National University, Busan 609-735,
2Department of Biochemistry, Dongeui University College of Oriental Medicine, Busan 614-052, Korea
Agaricus blazei Murill is a traditional herb medicine which has been used for patient suffering from cancer in Oriental medicine. It used to be a source of antitumor and immunoactive compounds in Oriental medicine, and considered a health food in many countries. In the present study, it was examined the biochemical mechanisms of apoptosis by water extract of Agaricus blazei Murill (WEAB) in human leukemia U937 cells. It was found that WEAB could inhibit the cell growth of U937 cells in a dose-dependent manner, which was associated with apoptotic cell death such as formation of apoptotic bodies and DNA fragmentation. Flow cytometry analysis confirmed that WEAB treatment increased populations of apoptotic-sub G1 phase. Apoptosis of U937 cells by WEAB was associated with a down-regulation of anti-apoptotic Bcl-2 expression and an up-regulation of pro-apoptotic Bax expression.
WEAB treatment induced the proteolitic activation of caspase-3, 8, 9 and downregulation of pAkt or upregulation of pERK. These results indicated that the anti-proliferative effects of WEAB were associated with the induction of apoptotic cell death through regulation of several major growth regulatory gene products such as Bcl-2 family expression and caspase protease ativity though activation of pERK or inactivation of pAkt, and WEAB may have therapeutic potential in human leukemia treatment. (Cancer Prev Res 12, 98-105, 2007)
Key Words: Agaricus blazei Murill, Apoptosis, Bcl-2, Bax, Caspase
서 론
1940년대 초반에 미국에서 처음 발견되었으며, 미국의 플로리다와 중남미의 중원지대에 자생되는 버섯으로 최 근 국내에서 재배되기 시작한 신령버섯(Agaricus blazei Murill)은 분류학상으로 균계, 진균문, 담자균아문, 주름 버섯목, 주름버섯과의 주름버섯속에 속한다. 이는 양송
이와 같은 속으로서, 송이버섯, 팽이버섯, 느타리버섯과 같은 목에 속하는 버섯으로써 강력한 면역증강 활성물 질이 함유되어 있다고 알려져 있다.1) 최근까지 많은 연 구가 일본이나 중국의 학자들에 의해서 이루어져 왔는 데, 특히 일본의 학자들은 중남미의 잉카지역 주민들이 암 관련 질환이나 각종 성인병환자가 적으며 장수하는 사람이 유난히 많다는 점에 주목하고, 이 지역주민들의 장수원인에 대한 비밀을 연구한 결과, 그 원인이 그 지역
주민들이 즐겨 식용하는 버섯에 있음을 밝혀내게 되었 다.2,3) 신령버섯의 주요 효과에는 항종양, 면역증강, 항염 작용, 혈당 강하 작용, 강심작용, 혈압 강화 작용, 콜레스 테롤 저하 작용, 치매개선 효과, 비만억제 효과, 고혈압, 고지혈증 등의 성인병과 미용효과가 있는 것으로 연구 발표 되고 있으며,4∼6) 건강보조식품 등 여러 다양한 분 야에서 각광을 받고 있어서 앞으로 더욱더 많은 관심을 야기시킬 것으로 생각된다.7,8)
세포의 여러 가지 활동 중 세포의 죽음은 necrosis와 apoptosis로 구분되며, 이것은 세포의 형태학적 및 생화학 적인 특성에 의하여 구분될 수 있다. Apoptosis는 개체의 발생단계나 DNA 손상, 바이러스 감염 등에 의한 유전적 조절 하에서 일어나는 정교한 방어기전이라는 점에서 생리적이거나 화학적인 외상에 의한 세포의 죽음인 necrosis와는 구별된다.9∼11) 또한 apoptosis는 개체보존의 수준에서 손상된 세포들의 제거를 위한 중요한 수단이 기도 하다. Apoptosis의 유발에 종양억제유전자 p53, Bcl-2 family 및 caspase member 등과 같은 유전자가 관여한다는 사실이 알려지면서 apoptosis와 연관된 분자적 기전이 최 근 많이 밝혀지고 있는데, Bcl-2 family에 속하는 Bcl-2는 apoptosis를 억제하는 반면, Bax의 과발현이 이루어졌을 때는 apoptosis를 유발시킨다고 알려져 있다.12) 그리고 caspase라고 이름 붙여진 ICE/CED-like protease family 역시 apoptosis 유발에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, 이들은 proenzyme 형태로 존재하다가 apoptosis 유도를 활 성화시키는 신호에 의해 활성화된 cysteine-related pro- teases로 되어 직접 또는 간접으로 세포 내에 존재하는 많은 표적 단백질의 분해에 관여하게 된다.13∼15) 본 실험에서는 인체 U937세포의 증식에서 신령버섯 추출물에 의한 백혈병세포 성장억제 효과와 apoptosis의 유발에 관한 기전 해석의 시도를 위하여 U937세포의 성 장 및 생존율 억제, 이로 인한 세포와 핵의 형태적 변화 및 apoptosis의 유발과 연관성을 가지는 주요 유전 인자와 관련 기작효소 단백질들의 발현 변화를 조사하였다.
재료 및 방법 1. 암세포배양 및 시료의 처리
본 연구에 사용된 U937 인체 백혈병세포는 한국생명 공학연구소(KRIBB, Taejeon, Korea)에서 분주받아 사용하 였으며, 암세포의 배양을 위해 90%의 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 1%의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)이 포함
된 성장배지를 사용하여 37oC, 5% CO2 조건 하에서 배양 하였다. 본 실험에 사용된 신령버섯(Agaricus blazei Murill) 은 김해시 소재 청원농산에서 제공받았으며, 100 g을 1,000 ml의 증류수에 3시간 이상 끓인 후, 3,000 rpm으로 20분간 원심 분리시켜 침전물을 제거하였다. 이를 다시 0.45μm의 여과지를 이용하여 부유 성분을 걸러낸 후 수 용성분을 동결 건조하여 사용하였다. 준비된 신령버섯 수용액 추출물(water extracts of A. blazei Murill, WEAB)은 3차 증류수에 용해하여 멸균과 여과 과정을 거쳐 배지에 적정 농도로 희석하여 처리하였다.
2. Hemocytometer를 이용한 세포 생존율의 측정
세포 배양용 6 well plate에 인체 폐암세포를 5×105개/
ml의 개수로 well 당 2 ml씩 분주하고 24시간 동안 안정 화시킨 다음 WEAB를 배지에 희석하여 각 well당 1~5 mg/ml의 농도로 처리한 후 배양하였다. 24시간 후 phos- phate-buffered saline (PBS)를 각 well 당 적정량을 첨가하여 세포를 모은 다음, 2,000 rpm으로 5분간 원심분리 하였 다. 상층액을 제거하고 세포만 남긴 다음 다시 PBS를 1 ml 첨가하여 잘 섞은 후 세포 부유액과 0.5% trypan blue (Gibco BRL)를 동량으로 섞은 후 2분간 처리한 후 위상 차 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 살아있는 세포 를 계수하였다. 이에 따른 결과를 Microsoft EXCEL pro- gram을 사용하여 분석하였다.
3. DAPI staining에 의한 세포핵의 형태 관찰
WEAB 처리에 의한 U937세포의 apoptosis 유발 여부 확 인을 위한 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 준비된 세포를 모은 다음 37% formaldehyde 용액과 PBS를 1：9 의 비율로 섞은 fixing solution을 모아진 세포에 500μl 첨 가하여 잘 섞어준 후, 실온에서 10분 동안 고정하였다.
1,000 rpm으로 5분간 원심 분리한 후 상층액을 제거하고 PBS 200μl를 넣어서 충분히 섞은 후, slide glass 위에 80 μl 정도 떨어뜨려 900 rpm에서 5분간 cytospin하였다.
PBS로 2∼3회 washing하고 PBS가 다 마르기 전에 0.2%의 Triton X-100을 첨가하여 실온에서 10분간 고정하였다.
그 후 다시 PBS로 washing하고 4’,6-diamidino-2-pheny- lindole (DAPI, Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액을 세포가 고정된 slide glass 위에 적당량을 떨어뜨린 후 빛을 차단 하고 실온에서 염색시켰다. 15분 가량 염색시킨 후, PBS 로 DAPI 용액을 충분하게 washing하고 형광 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 400배의 배율로 각 WEAB 처리 농도에 따른 인체 백혈병세포의 핵의 형태 변화를 관찰하였다.
4. DNA flow cytometry에 의한 분석
정상 및 WEAB를 처리한 배지에서 24시간 동안 배양 시킨 U937세포를 PBS로 씻어 내고 0.05% trypsin-EDTA 를 처리하여 부유시킨 다음 1,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 세포들만 모았다. 여기에 다 시 PBS를 첨가하여 충분히 씻은 다음 1,000 rpm으로 10 분간 원심분리한 후 상층액만 버리고 남은 세포에 0.5 ml의 PBS로 잘 부유시키고, 차가운 ethanol 0.5 ml을 첨가 한 후 한 시간 동안 고정시켰다. 5×106개의 고정된 세포 들을 원추형 vial에 넣어서 1,000 rpm으로 수분 간 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma)이 함유된 PBS로 2∼3회 washing 과정을 거 친 후 다시 수 분간 원심 분리하였다. 세포 침전물을 1%
BSA를 함유한 PBS 0.8 ml로 부유시키고 DNA intercalating dye propidium iodide (PI, concentration, 50μg/ml; Sigma)와 0.1 mg/ml의 RNase (Sigma)를 처리하여 암실(4oC)에서 1시 간 동안 염색과정을 거쳤다. PBS로 두 번 washing 과정을 거친 후, 부유액을 만들고, 35μM pore size의 nylon mesh에 부유액을 pipette으로 통과시켜 단일 세포로 분리시킨 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) program을 사용하여 분석하였다.
5. Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석
정상 및 WEAB가 처리된 배지에서 48시간 배양된 세 포들을 PBS로 washing하고 0.05% trypsin-EDTA를 처리하 여 부유시킨 다음 수 분간 원심 분리하여 세포를 모았다.
이렇게 모은 세포에 적정량의 lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 500μl 첨가하여 4oC에서 30분간 반응시킨 후, 14,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 그 상층액을 취하 였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 그 사용방법에 따라 정량 한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 완성한 후, 분석하고자 하는 단백질의 분자량 에 따라 적정 농도의 sodium dodecyl sulphate (SDS)-poly- acrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분 리된 gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 2∼3시간 가 량 전이시켰다. 전체 단백질이 전이된 membrane에 비특 이적 단백질에 대한 blocking을 위해 10% skin milk를 함 유한 PBS-T (0.1% Tween 20 in PBS) 용액으로 상온에서
1시간 incubation하고 PBS-T로 15분(5분씩 나누어 3번) 정 도 washing하였다. 준비된 membrane에 각각의 적정 항체 를 처리하여 4oC에서 1시간 이상 반응시킨 다음 PBS-T로 15분간 washing한 후 다시 5분씩 5번을 washing하였다. 그 후, 처리된 1차 항체에 대응하는 2차 항체(PBS-T로 1：
1000으로 희석하여 사용)를 처리하고 실온에서 1시간 반 응시켰다. 다시 PBS-T로 10분간 3번, 5분간 3번의 wa- shing을 하고 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액(Amer- sham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 처리 한 다음 암실에서 Kodak X-ray film에 감광시켜 특정단백 질의 양을 분석하였다.
6. In vitro caspase-3, 8 및 caspase-9의 activity 측정
Caspase-3, 8와 caspase-9의 in vitro 활성 측정을 위한 colorimetric assay kits는 CLONTECH Lab. (Palo Alto, CA, USA) 및 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 각각 구입하였으며, 제시된 방법에 준하여 활성의 증감 여부 를 조사하였다. 이를 위하여 정상 및 WEAB가 처리된 배 지에서 24시간 배양된 세포를 모은 뒤 단백질을 추출하 고 정량하여 각각 20μg의 단백질을 fluorogenic peptide 기 질 100μM이 함유된 extraction buffer [40 mM HEPES (pH 7.4), 20% glycerol (v/v), 1 mM EDTA, 0.2% NP-40 and 10 mM DL-DTT] 50μl에 혼합하였으며, microtiter plate에 다 시 extraction buffer에 희석하여 각 sample 당 총 volume이 100μl가 되게 하였다. 준비된 plate를 37oC에서 2시간 동 안 incubation 시킨 후 VERSAmax tunable microplate reader 를 이용하여 405 nm의 흡광도를 이용하여 반응의 정도 를 측정하였다.
결과 및 고찰
1. WEAB가 인체 U937 백혈병세포의 증식에 미치는 영향
인체 백혈병세포의 세포 생존율에 WEAB가 각 처리 농도별로 어떤 영향을 미치는지에 대해 hemocytometer를 이용한 조사를 통하여 분석한 결과는 Fig. 1에서 나타낸 바와 같다. 결과에서 알 수 있듯이 WEAB를 24시간 동안 처리한 결과 U937세포에서 처리농도 의존적으로 세포 의 생존율이 감소하였음을 알 수 있었다. 특히 WEAB 처 리 농도가 2 mg/ml 이상부터는 생존율이 50% 이상 억제 되었으며, 최종 농도인 8 mg/ml에서는 세포의 수가 정상 적인 배지에서 배양된 세포보다 약 12% 정도로 줄어들 었다(Fig. 1A). Fig. 1B에서 위상현미경을 통한 세포모양
Fig. 1. Effect of WEAB on the proliferation of human leulima U937 cells. The cell seeded at 5×105 cells/ml and incubated for 24 h. The cells cultured in the absence or presence of increasing concentrations of WEAB for 24 h. A viability was measured by MTT assay (A). Morphology of cells treated with or without WEAB for 24 h and examined under light micro- scopy (×400) (B). Each point represents the mean±SD of three independent experiments. The significance was deter- mined by Student’s t-test (*p＜0.05 vs. untreated control).
Fig. 2. Effects of WEAB on cell cycle distribution and apoptotic body formation in U937 cells. Exponentially growing cells have been grown in different concentrations of ABE for 24 h and then analyzed by flow cytometry described (A). After 24 h incubation with WEAB, the cells were harvested and spun down. After fixing, the cells were stained with DAPI solution, and stained nuclei were then observed under fluorescent microscope using blue filter magnification, ×400 (B). The data are from representative experiments repeated three times with similar results. *p＜0.05 vs. untreated control.
에서 확인할 수 있듯이 WEAB를 24시간 동안 2, 4 mg/ml 를 처리한 결과 Fig. 1A의 결과와 마찬가지로 현저하게 U937 세포의 성장이 억제되는 것을 조사할 수 있었다.
따라서 WEAB를 처리하였을 경우 인체 백혈병세포의 성 장과 생존율에 처리 농도 의존적인 억제 효과가 있음을 알 수 있었다. 이는 선행 연구에서의 MTT assay분석을 통한 세포증식 억제 조사에서 관찰된 것과 유사한 결과 였다.16)
2. WEAB 처리에 의한 apoptosis의 유발
다음은 WEAB의 처리에 의한 U937세포의 생존율 감 소 및 성장 억제가 apoptosis 유발에 연관성이 있을 것으 로 추측되어 WEAB를 24시간 동안 처리한 후 U937세포 의 각 세포주기를 비교하였다. 이를 위하여 각 농도별로 WEAB를 처리한 후 PI염색을 이용하여 세포의 핵을 염 색한 다음 DNA flow cytometry analysis를 이용하여 조사하 였다. Fig. 2A 나타낸 바와 같이 apoptosis 유발 집단에 해
당하는 sub-G1기가 WEAB 처리농도 의존적으로 매우 증 가하였음을 알 수 있었다. 아울러 apoptosis의 직접적인 증거를 제시하기 위하여 정상 및 WEAB가 처리된 배지 에서 24시간 동안 배양한 인체 백혈병 세포를 대상으로 DAPI staining을 통해 핵의 형태적인 변화를 조사하였 다.9) Fig. 2B에서 나타난 바와 같이 WEAB가 처리된 배지 에서 자란 U937 인체 백혈병 세포는 정상 배지에서 배양 된 세포에서는 관찰할 수 없는 apoptosis 유발 특이적인 핵 내의 DNA 단편화에 의한 apoptotic body를 관찰할 수 있었다.11) 또한, WEAB의 처리 농도 의존적으로 U937세 포의 밀도 역시 크게 감소하였으며, apoptotic body의 출 현 빈도도 크게 증가하였다. 이런 apoptotic body의 출현 빈도의 증가는 DNA flow cytometry analysis (Fig. 2A)의 결 과에서의 sub-G1 집단의 증가와도 유사하였다. 아울러 WEAB를 24시간 처리한 후 세포 내 총 DNA를 추출하여, DNA fragmentation 여부를 분석하여 본 결과, 정상 배지 에서 자란 인체 폐암세포에 비해서 WEAB가 처리한 세
Fig. 3. The expression levels of apoptosis-related Bcl-2 and Bax proteins by treatment with WEAB in U937 cells. The cells were treated with indicated concentrations of WEAB. Equal amounts of cell lysates (30μg) were resolved by SDS–PAGE, transferred to nitrocellulose, and probed with specific anti- bodies anti-Bcl-2, and anti-Bax (A). A representative study is shown, and two additional experiments yielded similar results.
The data obtained from the immunoblot analyses of Bax and Bcl-2 were used to evaluate the effect of WEAB on the Bax/Bcl-2 ratio (B). Data are expressed as mean±SD of three independent experiments. The significance was determined by Student’s t-test (*p＜0.05 vs. untreated control).
Fig. 4. The expression levels of apoptosis-related caspase proteins by treatment with WEAB in U937 cells. The cells were treated with indicated concentrations of WEAB. Equal amounts of cell lysates (30μg) were resolved by SDS–PAGE, trans- ferred to nitrocellulose, and probed with specific antibodies anti-caspase-3, anti-caspase-8 and anti-caspase-9 (A). Ca- spases (-3, -8, and -9) activities were determined using a caspase assay kit obtained from R&D following the ma- nufacturer's protocol. Data are expressed as mean±SD of three independent experiments (B). The significance was determined by Student’s t-test (*p＜0.05 vs. untreated control).
포에서 DNA fragmentation 유발현상을 어느 정도 관찰 할 수 있었다(나타내지 않음). 이는 선행 연구들의 결과 에 의해 WEAB에 의해 apoptosis가 유발되었다는 또 다른 증거가 될 수 있으며,17) Fig. 2A의 DAPI staining에서의 결 과에서 나타난 apoptotic body 형성에 따른 결과로 생각된 다. 따라서 WEAB 처리에 의한 인체 백혈병세포의 증식 억제는 apoptosis와 직접적인 관련이 있음을 알 수 있었 다.
3. Bcl-2 및 Bax의 발현에 미치는 WEAB의 영향
이상의 결과들을 근거로 하여 WEAB의 처리로 인한 apoptosis 유발 현상과 연관된 몇 가지 기본적인 기전 해 석을 위하여 Western blotting을 통해 apoptosis 유발과 연 관된 여러 인자들의 발현 변화를 조사하였다. 그중 Bcl-2/Bax family에 속하는 유전자인 Bcl-2는 apoptosis 유발
을 억제하는 anti-apoptotic 분자이며, Bax는 apoptosis 유발 을 촉진하는 pro-apoptotic 분자이다.18,19) 이 두 유전자는 세포의 mitochodria로부터 cytochrome c를 유리시켜 종양 억제 유전자인 p53, caspase 및 DNA 단편화와 연관된 endonuclease 등의 활성을 조절한다.18,20,21) 이들 두 유전자 는 dimer를 이루고 있는데 Bax의 발현이 증가하고 Bcl-2 의 발현이 감소하면 apoptosis가 유발될 수 있는 것으로 알려져 있다.18,22) Fig. 3A의 결과와 같이 Bax의 전사수준 과 단백질 발현의 정도는 WEAB의 처리 농도 의존적으 로 그 양이 증가하였으나 dimer를 이루는 Bcl-2는 단백질 의 발현이 농도의존적으로 현저하게 감소되었다. Fig. 3B 에서 나타낸 Bax/Bcl-2 비율을 조사한 결과 역시 농도 의 존적으로 현저하게 apoptosis 유발단질의 발현이 WEAB 의 처리에 의하여 조절되고 있음을 확인할 수 있었다.
Fig. 5. WEAB induced apoptosis is related the AKT, ERK and JNK phospholylation. U937 cells were treated 4 mg/ml WEAB with indicated time-dependent manner then detected the expre- ssion and phosphorylation levels of Akt, p38, JNK and ERK (A) by western blot. The cells were pre- treated with LY294002, PD98059, SP600125 and SB203580 respec- tively for 2 h, followed by 12 h treatment with or without 4 mg/
ml WEAB. The cells were treated with indicated concentrations of inhibitors. Viability was mea- sured by MTT assay (B). Data are expressed as mean±SD of three independent experiments.
The significance was determined by Student’s t-test (*p＜0.05 vs.
untreated control).
따라서 WEAB 처리에 의한 인체 백혈병세포의 apoptosis 유발에는 Bcl-2의 발현 억제 및 Bax의 발현 증가와 직접 적인 연관성이 있는 것으로 추정된다.
4. Caspase-3, 8 및 caspase-9의 활성에 미치는 WEAB의 영향
Caspase는 세포의 apoptosis 유발에 핵심적인 역할을 하 는 인자로서 세포내의 핵과 mitochondria의 외막에 불활 성 상태로 존재하다가 apoptosis를 유도하는 자극에 의하 여 활성화될 수 있다.20) 따라서 caspase의 활성화는 apop- tosis의 유발에 대한 또 다른 증거가 될 수 있으며 많은 선행연구 등에서 검증되어 왔다.23) 그 활성화의 정도를 in vitro caspase activity assay 및 활성화된 단백질 발현양을 통하여 실험해본 결과는 Fig. 4와 같았다. 그 결과에서 알 수 있듯이 인체 백혈병세포에서 WEAB의 처리에 따 른 농도 의존적으로 caspase-3, 8 및 caspase-9의 활성 단백
질 발현의 증가(Fig. 4A)와 caspase activity가 농도 의존적 으로 현저하게 증가하는 현상(Fig. 4B)을 관찰할 수 있었 으며, 특히 caspase-8, 9보다 caspase-3의 활성이 더 크게 증 가하였음을 알 수 있었다.
5. PI3K/Akt 및 MAPK의 발현에 미치는 WEAB의 영향
WEAB을 처리하여 얻은 세포분쇄물의 western blot 분 석으로부터 pAkt, pp38, pERK와 pJNK의 단백질 발현을 조사하였다. WEAB를 12시간 처리하였을 때 pAkt level이 현저하게 저하되었으며 pp38을 제외한 pERK와 pJNK의 발현량은 시간이 증가함에 따라 현저하게 증가하였다 (Fig. 5A). 각각의 inhibitor와 WEAB를 단독 혹은 함께 12 시간 처리한 결과 pAkt inhibitor인 LY294002와 pJNK inhibitor인 SP600125 및 pERK inhibitor인 PD98059를 함께 처리하였을 때 U937세포의 증식이 WEAB 단독처리 시 에 비하여 현저하게 감소되었다. Akt는 phosphatidyl
inositol 3-kinase (PI3K)의 주요 target으로 PI3K의 생성물 에 의해 활성화되고 phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10 (PTEN) tumor suppressor에 의해 활성 화가 억제된다.24) ERK와 JNK는 Ras/Raf serine/threonine kinase에 의해 활성화되며, 활성화되면 다양한 transcrip- tion factors, kinases, phosphastase의 인산화를 유도하여 세 포의 증식 및 분화에 관여한다.25) 따라서 여러 가지 암 에서 이러한 분자들 발현이 활성화되기 때문에 이들의 발현을 조절하는 물질을 항암제로 개발하려는 연구들이 진행 중이다.26) 본 실험에서 WEAB에 의한 apoptosis의 증 가는 Akt, ERK 및 JNK 인산화 감소 및 증가와 관련이 있다는 것을 알 수 있다.
결 론
강력한 항암 및 면역강화 작용을 가진 것으로 알려져 있는 물질 중의 하나인 신령버섯(Agaricus blazei murill)의 수용성 추출물(WEAB)을 이용하여 U937세포 성장 억제 기전을 해석하기 위하여 인체 백혈병세포 U937 세포주 를 대상으로 조사하였다. WEAB가 처리된 U937 인체 백 혈병세포는 처리 농도 의존적으로 성장 및 생존율이 현 저히 감소되었으며, apoptosis가 유발된 세포에서 특징적 으로 관찰되는 chromatin condensation 현상을 유발하였고 DNA Flow cytometry 분석결과 apoptotic sub-G1기에 해당 하는 세포들의 빈도가 처리농도 의존적으로 증가하였 다. Bcl-2/Bax family의 단백질 수준에서 관찰한 결과 pro- apoptotic 인자인 Bax의 경우 protein 수준에서 발현이 증 가되었고, anti-apoptotic 인자인 Bcl-2의 경우 처리군에서 현저하게 감소되는 것이 관찰되었다. 또한, WEAB는 cas- pase-3, 8 및 caspase-9의 활성 증가에 영향을 주었으며 특 히 caspase-3의 활성에 큰 영향을 주었다. 뿐만 아니라 WEAB는 세포의 증식과 분화를 조절하는 Akt, ERK 및 JNK의 인산화를 조절하였으며 각각의 억제제를 선처리 한 후 비교한 결과 현저하게 세포증식이 감소되는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과에서 WEAB에 의한 백혈병세 포의 생존율 저하는 세포의 증식, 분화 조절 인자와 apoptosis 관련된 단백질 발현 조절 인자들과 밀접한 관련 이 있었으며, 이는 신령버섯 추출물이 강력한 항암 및 암예방 효능의 잠재력을 가지고 있음을 의미하며 지속 적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
감사의 글
이 논문은 부산대학교 자유과제 학술연구비(2년)에 의
하여 이루어진 결과의 일부분이며 이에 감사드립니다.
참 고 문 헌
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