262 책임저자：이원호, 609-735, 부산시 금정구 장전동
부산대학교 자연과학대학 생물학과 Tel: 051-510-2257, Fax: 051-517-2980 E-mail: [email protected]
접수일：2008년 10월 15일, 게재승인일：2008년 10월 24일
Correspondence to：Won Ho Lee
Department of Biology, Pusan National University, Jangjeon-dong, Geumjeong-gu, Busan 609-735, Korea
Tel: +82-51-510-2257, Fax: +82-51-517-2980 E-mail: [email protected]
인체혈구암 U937 세포에서 ERK 및 JNK 경로를 통한 Esculetin의 Apoptosis 유도
1부산대학교 자연과학대학 생물학과, 동의대학교 한의과대학 2생화학교실 및 3대학원 바이오물질제어학과
박 철1,2ㆍ최영현2,3ㆍ이원호1
Involvement of ERK and JNK Pathways in Apoptosis by Esculetin, a Coumarin Derivative, in Human Leukemic U937 Cells
Cheol Park1,2, Yung Hyun Choi2,3 and Won Ho Lee1
1Department of Biology, Pusan National University, Buan 609-735, 2Department of Biochemistry, Dongeui University College of Oriental Medicine and 3Department of Biomaterial Control,
Dongeui University Graduate School, Busan 614-052, Korea
Esculetin, a coumarin derivative contained in various plants such as Artemisia scoparia, A. capillaries, Ceratostigma willmottianum and in the leaves of Citrus limonia, has been shown to exhibit antioxidant, anti-inflammatory and anti-cancer effects. However, the cellular and molecular mechanism of its action are poorly understood. The aim of the present study was to further elucidate the possible mechanisms by which esculetin exerts its anti-proliferative action and apoptosis in human cancer cells. It was found that the growth inhibitory effects of esculetin were more sensitive in human leukemic cell lines (U937, HL-60 and K562) than in human solid cancer cell lines such as lung cancer (NCI-H460 and A549), breast cancer (MCF-7 and MDA-MB-231), colon cancer (HCT116 and HT29) and hepatocarcinoma (HepG2 and Hep3B) cells. The anti-proliferative effect of esculetin treatment in human leukemic U937 cells was associated apoptosis as determined by the loss of mitochondrial membrane potential (MMP, Δψm), formation of chromatin condensation, and a flow cytometry analysis. However, an extracellular signal-regulated kinase (ERK)-specific inhibitor, PD98059, and a c-Jun N-terminal kinase (JNK)-specific inhibitor, SP600125, significantly blocked esculetin-induced apoptosis in U937 cells by inhibiting the increases sub-G1 population, formation of chromatin condensation, loss of MMP, induction of DR4, and degradation of β-catenin and DEE45/ICAD. These results indicated that the JNK and ERK pathways were key regulators of apoptosis in response to esculetin in human leukemia U937 cells. (Cancer Prev Res 13, 262-270, 2008)
Key Words: Esculetin, Apoptosis, U937, ERK, JNK
서 론
모든 사망원인 중 약 30% 정도를 차지하고 있는 암은 인체에서 정상적으로 조절되지 않으며 침윤 및 전이를
유발하는 질병으로서 세계보건기구(World Health Organi- zation, WHO) 및 미국암학회(American Cancer Society, ACS) 에 따르면 2007년에는 약 760만명 정도가 암으로 사망한 것으로 보고되어지고 있다.1∼3) 특히 혈구암은 혈액이나 골수에 발병하는 암으로서 백혈구의 비정상적인 증식을
유발시키는 암으로서 임상 및 병리학적으로 급성 및 만 성 혈구암으로 구분되어지는데 급성 혈구암의 경우에는 어린이나 젊은 층에서 주로 발병하지만 만성 혈구암의 경우에는 나이가 많은 사람에게 주로 발병하는 것으로 알려져 있다. 또한 혈구암은 골수에서 유발되는 급성 림 프구성 백혈병과 과립성 백혈구 및 단핵 백혈구에서 발 병하는 골수성 백혈병으로 나누어지고 완전한 치료가 어려우며 재발의 확률도 매우 높은 것으로 보고되어지 고 있다.4∼7) 따라서 혈구암을 치료하는데 있어서 보다 더 효과적인 생리활성을 지닌 물질을 발굴하고 이들의 분자 및 세포 수준에서의 기작을 밝히는 것이 중요할 것 이다.
최근에는 질병 예방 측면에서 과일이나 야채의 중요 성이 새롭게 대두되고 있으며 특히 식물이나 과일 등에 많이 함유되어 있는 phytochemical이 많은 관심을 받고 있 다.8,9) Phytochemical은 외부의 여러 가지 자극에 대해서 식물체 자신을 보호하는 물질이지만 인체에서 발병하는 여러 가지 질병에 대해서도 예방 및 치료 효과를 가지는 것으로 보고되고 있다. 대부분의 phytochemical은 antioxi- dant 기능을 가지며, 콩에 많이 함유되어 있는 isoflavone 은 estrogen과 비슷한 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
또한 양배추에 함유되어 있는 indole은 효소 활성 촉진 기능이 있으며, 인삼의 주성분인 saponin은 DNA replica- tion을 억제함으로서 암을 억제하는 기능을 가지고, 마늘 의 주성분인 allicin의 경우에는 anti-bacterial effect가 있는 것으로 알려져 있다.10∼14) 특히 인진쑥(Artemisia scoparia), 비쑥(A. capillaries), 갯질경이과 식물(Ceratostigma willmottianum) 및 레몬(Citrus limonia)의 잎 등에 많이 함유되어 있는 것 으로 알려진 esculetin (6,7-dihydroxycoumarin)은 항산화, 항 염증 및 항암작용이 뛰어난 것으로 보고되어지고 있
다.15∼20) 하지만 이러한 기능들에 대한 분자적 기작에 대
해서는 명확히 밝혀져 있지 않다.
따라서 본 실험에서는 esculetin에 의하여 항암활성이 가장 높게 나타난 인체 혈구암세포인 U937 세포에 미치 는 항암 효과의 생화학적 기전의 해석을 위하여 암세포 의 증식에 미치는 영향을 조사하였고, esculetin이 유발하 는 증식억제 현상이 apoptosis에 어떠한 영향을 미치는지 를 조사하여 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
재료 및 방법 1. 실험재료
본 실험에 사용된 esculetin은 Sigma-Aldrich (St. Louis,
MO, USA)에서 구입하였으며 DMSO를 이용하여 200 mg/ml의 농도로 희석한 후 적정 농도로 배지에 희석하여 처리하였다. 단백질 분석을 위하여 사용된 DR4, β-cate- nin 및 DFF45/ICAD 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc.
(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며 immunoblotting 을 위해 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti- rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglo- bulin은 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다.
2. 세포의 배양
본 실험에 사용된 암세포들은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며 90%의 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM glutamine, 100 U/ml penicillin 및 100μg/ml streptomycin (Gibco BRL)이 포 함된 성장배지를 사용하여 5% CO2, 37oC의 조건하에서 배양하였다.
3. MTT assay에 의한 세포 성장억제 조사
세포 배양용 6 well plate에 암세포를 1×105개/ml로 분 주한 다음 esculetin을 배지에 희석하여 각 well 당 적정농 도로 처리하였다. 일정시간 경과 후 0.5 mg/ml 농도의 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, OH, USA)를 2 ml씩 분주하고 2시간 동안 CO2 incubator에서 배양시킨 다음 MTT 시약을 깨끗하게 제거하고 DMSO를 1 ml씩 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에 서 흡광도를 측정하였다.
4. Mitochondrial membrane potential (MMP, Δψm) 분석
Esculetin이 처리된 U937 세포의 MMP 변화 정도를 측 정하기 위하여 2,000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상층 액을 버리고 세포들만 모은 다음 500μl의 PBS를 첨가하 여 충분히 섞은 후, 10μM JC-1 (Sigma)을 처리하여 20분 간 37oC에서 반응시켰다. 반응시킨 세포를 2,000 rpm으 로 원심 분리하여 상층액을 버리고 다시 500μl의 차가 운 PBS를 첨가하고 35-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 esculetin 처리에 따른 MMP의 변화정도 를 분석하였다.
5. Flow cytometry 분석
Esculetin을 처리한 U937 세포들을 2,000 rpm으로 5분 간 원심 분리하여 상층액을 버리고 세포들만 모았다. 여 기에 다시 PBS를 첨가하여 충분히 씻은 다음 2,000 rpm 으로 5분간 원심분리 한 후 상층액만 버리고 남은 세포 에 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit (Becton Dickinson) 를 이용하여 고정 및 염색을 하여 4oC, 암실에서 30분 동 안 반응을 시켰다. 반응시킨 세포를 FACSCalibur를 이용 하여 형광반응에 따른 DNA content 및 histogram을 CellQuest software 및 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그 램을 이용하여 분석하였다.
6. DAPI staining에 의한 세포핵의 형태 관찰
암세포의 apoptosis 유발 여부 확인을 위한 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 esculetin이 적정농도로 처리된 세포를 모은 다음 37% formaldehyde 용액과 PBS를 1：9 의 비율로 섞은 fixing solution을 500μl 첨가하여 충분히 섞은 후, 상온에서 10분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 2.5μg/ml 농도의 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액으로 빛을 차단하고 상온에서 15분간 염색시킨 후 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 400배의 배 율로 각 농도에 따른 암세포의 핵의 형태 변화를 관찰하 였다.
7. 단백질 분리 및 Western blot 분석
정상 및 esculetin이 처리된 배지에서 48시간 동안 배양 된 세포를 모아 적당량의 lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM pheny- methylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 4oC에서 1시간 동안 반응시킨 후, 14,000 rpm으 로 30분간 원심분리하여 그 상층액을 취하였다. 상층액 의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 그 사용방법에 따라 정량 한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으 로 분리한 다음 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, 5% skim milk를 함유한 PBS-T (0.1% Tween 20 in PBS)에 담구어 상온에서 1시간 정도 incubation하여 비특이적인 단백질 들에 대한 blocking을 실시하고 PBS-T로 15분 정도 세척 하였다. 준비된 membrane에 1차 항체를 처리하여 상온에
서 2시간 정도 반응시킨 다음 PBS-T로 세척하고 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시킨 후 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액 (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백 질의 양을 분석하였다.
결 과
1. 다양한 암세포의 증식에 미치는 esculetin의 영향
인체폐암세포(NCI-H460 및 A549), 유방암세포(MCF-7 및 MDA-MB-231), 대장암세포(HCT116 및 HT29), 간암세 포(HepG2 및 Hep3B) 및 혈구암세포(U937, HL-60 및 K562)의 증식에 미치는 esculetin의 영향을 알아보기 위하 여 esculetin을 농도별로 처리한 다음 MTT assay를 실시하 였다. Fig. 1에 나타난 바와 같이 부착성 암세포에서는 약간의 차이가 있었지만 고농도 처리군의 경우에 약 30% 정도의 증식 억제 현상이 나타났지만 저농도 처리 군의 경우에는 큰 영향을 미치지 못하였다. 하지만 혈구 암세포의 경우에는 Fig. 2A에서와 같이 저농도 처리군에 서도 증식 억제 현상이 강하게 나타났으며, 특히 U937 세포의 10μg/ml 처리군에서 약 80% 정도 증식이 억제 되었다.
2. MMP에 미치는 esculetin의 영향
이상의 결과에서 esculetin 처리에 의하여 U937 세포에 서 가장 높은 감수성을 보였기 때문에, U937 세포에 의 한 증식억제에 미치는 esculetin의 영향을 조사하였다. 먼 저 esculetin이 미토콘드리아막 전위(MMP)에 어떠한 변화 를 유발하는지를 조사한 결과는 Fig. 2B에 나타난 바와 같다. Esculetin을 처리하지 않을 경우에는 정상적인 미토 콘드리아막 전위를 가진 세포가 약 89.8%, 손상된 미토 콘드리아막 전위를 가진 세포는 약 10.2% 정도로 나타났 지만 esculetin이 24시간 처리된 경우에는 정상적인 미토 콘드리아막 전위를 가진 세포가 약 28.4%, 손상된 미토 콘드리아막 전위를 가진 세포는 약 71.1% 정도로 나타났 다. 이는 esculetin에 의하여 유발된 증식 억제 현상이 미 토콘드리아막 전위의 변화와 밀접한 관련이 있음을 의 미하며, 미토콘드리아막 전위의 변화는 전형적인 apop- tosis 유발 시 관찰되는 현상이므로 esculetin이 U937 세포 에서 apoptosis를 유발한다는 것을 알 수 있었다(Fig. 3).
Fig. 1. Growth inhibition of human lung cancer (NCI-H460 and A549), breast cancer (MCF-7 and MDA-MB-231), colon cancer (HCT116 and HT29) and hepatocarcinoma (HepG2 and Hep3B) cells after treatment with esculetin. The cells were seeded at 1×105/ml in a 6-well plate and incubated for 24 h. The cells were treated with variable concentrations of esculetin for 24 h. The growth inhibition was measured by the metabolic-bye-based MTT assay. The data shown are means±SD of three independent experiments.
3. MAPKs 및 PI3K/AKT 경로가 esculetin에 의한 apoptosis 유발에 미치는 영향
U937 세포에서 esculetin에 의하여 유발되는 apoptosis에 있어서 mitogen-activating protein kinases (MAPKs) 및 phos- phatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT 경로가 관여하는지의 여부를 확인한 결과는 Fig. 3에 나타난 바와 같다. Fig.
3A에서와 같이 DNA flow cytometry 분석을 통한 세포주 기의 sub-G1기에 해당되는 세포들의 빈도를 조사한 결 과, esculetin을 처리하지 않았을 경우 약 2.5% 정도였던 sub-G1기의 세포가 esculetin을 6시간동안 처리하였을 경 우 약 24.7% 정도로 증가하는 것으로 나타났다. 하지만 extracellular signal-regulated kinase (ERK) 경로 저해제인 PD98059 및 c-Jun N-terminal kinase (JNK) 경로 저해제인
SP600125를 각각 1시간 선처리하여 ERK 및 JNK 경로를 억제하였을 경우 5.2% 및 5.0%로 현저하게 억제되는 것 으로 나타났다. 또한 DAPI 염색을 통해 핵의 형태변화를 조사한 결과, Fig. 3B에 나타난 바와 같이 esculetin 처리에 의하여 유발된 염색질 응축현상이 PD98059 및 SP600125 선처리에 의하여 정상적인 핵의 모양으로 회복되었다.
하지만 PI3K/AKT 저해제인 LY294002 및 p38MAPK 저해 제인 SB203580에 의해서는 아무런 변화가 관찰되지 않 았다. 이로 ERK 및 JNK 경로가 esculetin에 의하여 유발 되는 apoptosis에 관여하고 있음을 보여주는 결과이다.
4. MAPKs 및 PI3K/AKT 경로가 esculetin에 의한 MMP 변화에 미치는 영향
ERK 및 JNK 경로가 esculetin에 의하여 유발되는
Fig. 2. Growth inhibition of human leukemia (U937, HL-60 and K562) cells and loss of MMP in U937 cells by esculetin treatment.
(A) U937, HL-60 and K562 cells were seeded at 1×105/ml in a 6-well plate and treated with variable concentrations of esculetin for 24 h. The growth inhibition was measured by the metabolic-bye-based MTT assay. (B) The levels of MMP were measured with the lipophilic cationic probe, JC-1. The cells were exposed to 30μg/ml of esculetin for the indicated amounts of time, after which flow cytometric analyses were performed as described in Materials and methods. Data are expressed as mean of two independent experiments.
Fig. 3. Roles of ERK and JNK pathways on the esculetin-in- duced apoptosis in U937 cells.
LY294002 (25μM), SP600125 (40 μM), PD98059 (100μM), and/or SB203580 (10μM) were used for pretreatment for 1 h before treat- ment with 30 μg/ml of esculetin for 6 h. (A) DNA content was analyzed by flow cytometry. (B) Nuclei stained with DAPI solution were then observed under a fluorescent microscope using a blue filter.
apoptosis에서 미토콘드리아막 전위의 변화에 있어서 어 떠한 형향을 미치는 지를 조사한 결과는 Fig. 4에 나타난 바와 같다. 결과에서 알 수 있듯이 esculetin 6시간 처리에 의하여 약 55.0%의 세포에서 미토콘드리아막 전위에 손
상이 유발되었으나 PD98059 및 SP600125 처리에 의하여 미토콘드리아막 전위의 손상 정도가 각각 13.6% 및 13.3%로 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 하지만 LY294002 및 SB203580에 의해서는 큰 변화가 관찰되지
Fig. 4. Roles of ERK and JNK pathways on the esculetin-induced loss of MMP in U937 cells. LY294002 (25μM), SP600125 (40μM), PD98059 (100μM), and/or SB203580 (10μM) were used for pretreatment for 1 h before treatment with 30μg/ml of esculetin for 6 h. The cells were exposed to 30μg/ml of esculetin for 6 h, after which mitochondrial membrane potentials were determined as described in Materials and methods. Data are expressed as mean of two independent experiments.
Fig. 5. Roles of ERK and JNK pathways on the esculetin- induced changes of DR4, β-catenin and DFF45/ICAD ex- pression in U937 cells. LY294002 (25μM), SP600125 (40μM), PD98059 (100μM), and/or SB203580 (10μM) were used for pretreatment for 1 h before treatment with 30μg/ml of esculetin for 6 h. Equal amounts of cell lysate (50μg) were resolved on SDS–polyacrylamide gels, transferred to nitro- cellulose membranes, and probed with specific antibodies.
Actin was used as an internal loading control.
않았다. 따라서 esculetin 처리에 의한 apoptosis 유발 시 관 찰되는 미토콘드리아막 전위의 손상에도 ERK 및 JNK 경로가 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
5. ERK 및 JNK pathway가 DR4, β-catenin 및 DFF45/ICAD의 발현에 미치는 영향
Esculetin에 의하여 유발되는 apoptosis에 있어서 death receptor군에 속하는 DR4와 caspase-3 기질단백질인 β- catenin 및 DFF45/ICAD의 발현 변화와 ERK 및 JNK와의 관계를 조사한 결과는 Fig. 5에 나타난 바와 같다. 결과에
서 알 수 있듯이 esculetin 처리에 의하여 DR4의 발현 증 가와 β-catenin 및 DFF45/ICAD의 단편화 현상이 관찰되 었으며, 이러한 변화는 PD98059 및 SP600125 처리에 의 하여 억제되는 것으로 나타났다. 따라서 ERK 및 JNK 경 로가 DR4의 발현을 조절함으로서 esculetin에 의하여 유 발되는 apoptosis를 유발하는 것으로 생각된다.
고 찰
본 연구에서는 esculetin에 의하여 유발되는 인체암세 포의 증식억제 및 apoptosis 기전을 알아보기 위하여 고형 암세포인 폐암세포(NCI-H460 및 A549), 유방암세포 (MCF-7 및 MDA-MB-231), 대장암세포(HCT116 및 HT29) 및 간암세포(HepG2 및 Hep3B)와 혈구암세포(U937, HL-60 및 K562)를 대상으로 증식억제 정도를 조사하였 다. Fig. 1 및 Fig. 2A의 결과에 의하면 부착성 암세포주에 서는 esculetin에 의한 증식억제 효과가 크게 나타나지 않 은 반면 혈구암세포주에서는 증식억제 효과가 크게 나 타났으며, 특히 U937 세포에서 esculetin에 대한 감수성이 가장 높게 나타났다.
미토콘드리아는 apoptosis 유발에 있어서 중요한 역할 을 하는 것으로 알려져 있는데 death receptor에 의하여 caspase-8이 활성화되면 Bcl-2 homology 3 (BH3)-only pro- tein인 Bid를 단편화시켜 tBid를 형성하여 미토콘드리아 막 전위에 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다.21,22) 또 한 Bcl-2 family도 미토콘드리아막 전위를 조절하는데, Bcl-2 family는 apoptosis를 억제하는 anti-apoptotic 인자와 apoptosis를 유발하는 pro-apoptotic 인자로 구성되어 있으 며 이들은 서로 dimer를 형성하여 균형을 유지하고 있
다.23) 하지만 이 인자들 간의 균형이 깨어지게 되면 미토 콘드리아막 전위에 손상을 유발하여 미토콘드리아로부 터 세포질로 cytochrome c가 방출되어 cysteine-related pro- teases인 caspases, 종양억제 유전자인 p53, DNA의 단편화 와 연관된 endonuclease 등이 활성화되어 apoptosis가 유발 되는 것으로 알려져 있다.24∼26) 따라서 강력한 증식억제 효과가 나타난 U937 세포를 대상으로 esculetin 처리에 따 른 미토콘드리아막 전위의 변화 정도를 관찰하였다. Fig.
2B에 나타난 바와 같이 정상배지에서 자란 암세포들은 미토콘드리아막 전위에 큰 변화가 나타나지 않았지만 esculetin 처리시간의 증가에 따라 미토콘드리아막 전위 의 손상 정도가 증가하여 24시간 처리군에서는 약 71.1%
의 손상이 유발되는 것으로 나타났다. 이는 U937 세포에 서 esculetin 처리에 의한 증식억제는 apoptosis 유발과 밀 접한 연관이 있었고 이러한 apoptosis 유발에 있어서 미토 콘드리아 기능 손상이 중요한 역할을 함을 의미한다.
MAPKs는 여러 가지 자극에 의하여 활성화되어 세포 의 성장, 분화, 증식 및 죽음을 조절하는 protein kinase로 서 JNK, p38MAPK 및 ERK로 구성되어 있다.27∼30) 일반적 으로 ERK는 growth factor, cytokine 및 phorbol ester 등에 의하여 유발되어 세포의 성장이나 분화에 관여하는 것 으로 알려진 반면, JNK 및 p38MAPK는 proinflammatory cytokine, UV irradiation, heat, osmotic shock, hydrogen peroxide 및 스트레스에 의한 DNA 손상 등에 의하여 활 성화되어 성장억제 또는 apoptosis에 관여하는 것으로 알 려져 있다.31∼35) 하지만 최근 연구에 따르면 ERK, JNK 및 p38MAPK 모두 세포의 생존 및 죽음에 관여할 수 있 다고도 보고되어지고 있다.36∼38) 따라서 esculetin에 의하 여 유발되는 apoptosis에 있어서 MAPKs가 관여하는지를 조사한 결과, Fig. 3 및 4에서와 같이 esculetin을 처리하였 을 경우 sub-G1기에 해당하는 세포가 약 24.7%로 나타났 지만 ERK 및 JNK 경로를 억제하였을 경우 각각 5.2%
및 5.0%로 감소하였다. 또한 핵의 형태 변화 및 미토콘 드리아막 전위의 변화에 있어서도 ERK 및 JNK 경로 저 해제에 의해서 거의 완벽하게 회복되는 것으로 나타났 으므로 esculetin에 의한 ERK 및 JNK의 활성화가 apoptosis 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.
Extrinsic pathway에 있어서 중요한 역할을 하는 DR4는 tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)과 결합함으로서 활성화된 caspase-8에 의하여 caspase-3의 활성화가 유발되면 세포의 생존에 중요한 역 할을 하는 기질단백질들을 단편화시킴으로서 apoptosis 를 유발시키는 것으로 알려져 있다.39∼41) β-catenin은 caspase-3의 기질단백질이며 cell-cell adhesion 및 Wnt
signaling에 관여하는 E-cadherin–associated protein으로서 세 포 내 골격 유지와 다양한 부착성 세포의 전사 조절에 중요한 역할을 하며 세포 유착과 관계된 apoptosis 조절에 관여한다.42∼44) β-catenin은 정상 세포의 경우 92 kDa의 분자량을 가지나 세포 유착성 apoptosis가 유발되면 adenomatous polyposis coli (APC)와의 결합하여 N-terminal 에서 Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) 의존적인 phosphorylation을 유발하는 complex와 p53 의존적인 세포 주기 억제에 반응하는 complex등과 같은 두 개의 protea- some degradation complex에 의해 분해되어 62∼72 kDa로 단편화가 일어나는 것으로 알려져 있다.45∼47) 또한 DNA fragmentation factor (DFF)는 apoptosis의 가장 중요한 현상 중 하나인 DNA 단편화에 관여하는 유전자로서 caspase- activated DNase인 DFF40/CAD와 inhibitor of caspase-acti- vated DNase인 DFF45/ICAD로 구성되어 있다. DFF40/
CAD와 DFF45/ICAD는 서로 complex를 형성하고 있으며, apoptosis가 유발되면 caspases에 의하여 ICAD의 두 군데 Asp 잔기에서 단편화가 일어나는 것으로 알려져 있
다.48,49) 따라서 esculetin에 의하여 유발되는 apoptosis에 있
어서 이들 단백질의 발현 변화와 ERK 및 JNK와의 관계 를 조사한 결과, Fig. 5에서 나타난 바와 같이 esculetin은 DR4의 증가와 β-catenin 및 DFF45/ICAD의 단편화를 유 발하였으며 이러한 변화는 ERK 및 JNK 저해제에 의하 여 억제되는 것으로 나타났다.
이상의 결과에서 esculetin은 인체혈구암 U937 세포에 서 ERK 및 JNK 경로 활성화에 의하여 유발된 death receptor인 DR4의 활성화와 이로 인한 미토콘드리아막 전위의 변화 및 caspase-3 기질단백질인 β-catenin 및 DFF45/ICAD의 단편화에 의하여 apoptosis가 유발됨을 알 수 있었다. 이러한 연구 결과는 esculetin의 생화학적 항암 기전 해석을 이해하고 향후 지속적인 연구를 위한 귀중 한 자료로 사용될 것이다.
결 론
본 연구에서는 esculetin이 인체암세포 증식에 미치는 영향을 조사하였다. Esculetin은 다양한 고형암세포의 증 식에는 큰 영향을 미치지 않았으나 동일 조건에서 인체 혈구암세포의 증식은 매우 유의적으로 억제하였다. 혈 구암세포 중 U937 세포에서 esculetin에 의한 증식억제는 미토콘드리아의 기능 손상과 연관이 있었으며, esculetin 에 의한 U937 세포의 apoptosis 유발은 ERK 및 JNK 경로 를 통하여 이루어지고 있음을 확인하였다. 따라서 escule- tin은 혈구암세포의 증식 제어를 위한 항암제로서의 개
발 가능성이 높음을 시사하여 주며, 보다 다양한 접근을 통한 항암효과의 기전에 관한 부가적인 조사가 필요할 것으로 생각된다.
감사의 글
이 논문은 부산대학교 자유과제 학술연구비(2년)에 의 하여 연구되었음.
참 고 문 헌
1) Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J, Murray T, Thun MJ. Cancer statistics. CA Cancer J Clin 58, 71-96, 2008.
2) Smith RA, Cokkinides V, Brawley OW. Cancer screening in the United States, 2008: a review of current American Cancer Society guidelines and cancer screening issues. CA Cancer J Clin 58, 161-179, 2008.
3) Loeb LA, Loeb KR, Anderson JP. Multiple mutations and cancer. Proc Natl Acad Sci USA 100, 776-781, 2003.
4) Gilliland DG, Jordan CT, Felix CA. The molecular basis of leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 80-97, 2004.
5) Abramson N, Melton B. Leukocytosis: basics of clinical assessment. Am Fam Physician 62, 2053-2060, 2000.
6) Wiernik PH. Leukemias and myeloma. Cancer Chemother Biol Response Modif 10, 129-147, 1988.
7) Harris P, Ralph P. Human leukemic models of myelomono- cytic development: a review of the HL-60 and U937cell lines.
J Leukoc Biol 37, 407-422, 1985.
8) Liu RH. Health benefits of fruit and vegetables are from additive and synergistic combinations of phytochemicals. Am J Clin Nutr 78, 517S-520S, 2003.
9) Willett WC. Balancing life-style and genomics research for disease prevention. Science 296, 695-698, 2002.
10) Gross-Steinmeyer K, Stapleton PL, Liu F, Tracy JH, Bammler TK, Quigley SD, Farin FM, Buhler DR, Safe SH, Strom SC, Eaton DL. Phytochemical-induced changes in gene expression of carcinogen-metabolizing enzymes in cultured human pri- mary hepatocytes. Xenobiotica 34, 619-632, 2004.
11) Díaz GD, Li Q, Dashwood RH. Caspase-8 and apoptosis inducing factor mediate a cytochrome c-independent pathway of apoptosis in human colon cancer cells induced by the dietary phytochemical chlorophyllin. Cancer Res 63, 1254- 1261, 2003.
12) Usui T, Ikeda Y, Tagami T, Matsuda K, Moriyama K, Yamada K, Kuzuya H, Kohno S, Shimatsu A. The phyto- chemical lindleyin, isolated from Rhei rhizoma, mediates hormonal effects through estrogen receptors. J Endocrinol 175, 289-296, 2002.
13) Howard LR, Talcott ST, Brenes CH, Villalon B. Changes in phytochemical and antioxidant activity of selected pepper
cultivars (Capsicum species) as influenced by maturity. J Agric Food Chem 48, 1713-1720, 2000.
14) Sato Y, Suzaki S, Nishikawa T, Kihara M, Shibata H, Higuti T. Phytochemical flavones isolated from Scutellaria barbata and antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Ethnopharmacol 72, 483-488, 2000.
15) Lee BC, Lee SY, Lee HJ, Sim GS, Kim JH, Kim JH, Cho YH, Lee DH, Pyo HB, Choe TB, Moon DC, Yun YP, Hong JT. Anti-oxidative and photo-protective effects of coumarins isolated from Fraxinus chinensis. Arch Pharm Res 30, 1293- 1301, 2007.
16) Kuo HC, Lee HJ, Hu CC, Shun HI, Tseng TH. Enhancement of esculetin on taxol-induced apoptosis in human hepatoma HepG2 cells. Toxicol Appl Pharmacol 210, 55-62, 2006.
17) Fylaktakidou KC, Hadjipavlou-Litina DJ, Litinas KE, Nicolaides DN. Natural and synthetic coumarin derivatives with anti-inflammatory/antioxidant activities. Curr Pharm Des 10, 3813-3833, 2004.
18) Pan SL, Huang YW, Guh JH, Chang YL, Peng CY, Teng CM. Esculetin inhibits Ras-mediated cell proliferation and attenuates vascular restenosis following angioplasty in rats.
Biochem Pharmacol 65, 1897-1905, 2003.
19) Yue J, Xu J. Chemical components from Ceratostigma willmottianum. J Natl Prod 60, 1031-1033, 1997.
20) Chang WS, Lin CC, Chuang SC, Chiang HC. Superoxide anion scavenging effect of coumarins. Am J Chin Med 24, 11-17, 1996.
21) Li H, Zhu H, Xu CJ. Yuan J. Cleavage of BID by caspase-8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell 94, 491-501, 1998.
22) Luo X, Budihardjo I, Zou H, Slaughter C, Wang X. Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors. Cell 94, 481-490, 1998.
23) Reed JC. Bcl-2 family proteins. Oncogene 17, 3225-3236, 1998.
24) Donovan M, Cotter TG. Control of mitochondrial integrity by Bcl-2 family members and caspase-independent cell death.
Biochim Biophys Acta 1644, 133-147, 2004.
25) Scorrano L, Korsmeyer SJ. Mechanisms of cytochrome c release by proapoptotic BCL-2 family members. Biochem Biophys Res Commun 304, 437-444, 2003.
26) Rosse T, Olivier R, Monney L, Rager M, Conus S, Fellay I, Jansen B, Borner C. Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c. Nature 391, 496-499, 1998.
27) Sigoillot FD, Evans DR, Guy HI. Growth-dependent regulation of mammalian pyrimidine biosynthesis by the protein kinase A and MAPK signaling cascades. J Biol Chem 277, 15745-15751, 2002.
28) Chang L, Karin M. Mammalian MAP kinase signaling cascades. Nature 410, 37-40, 2001.
29) Geilen CC, Wieprecht M. Orfanos CE. The mitogen-activated protein kinases system (MAP kinase cascade): its role in skin
signal transduction. A review. J Dermatol Sci 12, 255-262, 1996.
30) Su B, Karin M. Mitogen-activated protein kinase cascades and regulation of gene expression. Curr Opin Immunol 8, 402-411, 1996.
31) Ichijo H. From receptors to stress-activated MAP kinases.
Oncogene 18, 6087-6093, 1999.
32) Beyaert R, Cuenda A, Vanden Berghe W, Plaisance S, Lee JC, Haegeman G, Cohen P, Fiers W. The p38/RK mitogen activated protein kinase pathway regulates interleukin-6 synthesis response to tumor necrosis factor. EMBO J 15, 1914-1923, 1996.
33) Marais R, Marshall CJ. Control of the ERK MAP kinase cascade by Ras and Raf. Cancer Surv 27, 101-125, 1996.
34) Waskiewicz AJ, Cooper JA. Mitogen and stress response pathways: MAP kinase cascades and phosphatase regulation in mammals and yeast. Curr Opin Cell Biol 7, 798-805, 1995.
35) Xia Z, Dickens M, Raingeaud J, Davis RJ, Greenberg ME.
Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. Science 270, 1326-1331, 1995.
36) Boutros T, Chevet E, Metrakos P. Mitogen-activated protein (MAP) kinase/MAP kinase phosphatase regulation: roles in cell growth, death, and cancer. Pharmacol Rev 60, 261-310, 2008.
37) Dhillon AS, Hagan S, Rath O, Kolch W. MAP kinase signalling pathways in cancer. Oncogene 26, 3279-3290, 2007.
38) Wu GS. Role of mitogen-activated protein kinase phos- phatases (MKPs) in cancer. Cancer Metastasis Rev 26, 579-585, 2007.
39) Kimberley FC, Screaton GR. Following a TRAIL: update on
a ligand and its five receptors. Cell Res 14, 359-372, 2004.
40) LeBlanc HN, Ashkenazi A. Apo2L/TRAIL and its death and decoy receptors. Cell Death Differ 10, 66-75, 2003.
41) Wang S, El-Deiry WS. TRAIL and apoptosis induction by TNF-family death receptors. Oncogene 22, 8628-8633, 2003.
42) Olmeda D, Castel S, Vilaró S, Cano A. β-catenin regulation during the cell cycle: implications in G2/M and apoptosis. Mol Biol Cell 14, 2844-2860, 2003.
43) Wijnhoven BP, Dinjens WN, Pignatelli M. E-cadherin-catenin cell-cell adhesion complex and human cancer. Br J Surg 87, 992-1005, 2000.
44) Johnson JP. Cell adhesion molecules in the development and progression of malignant melanoma. Cancer Metastasis Rev 18, 345-357, 1999.
45) Neufeld KL, Zhang F, Cullen BR, White RL. APC-mediated downregulation of beta-catenin activity involves nuclear sequestration and nuclear export. EMBO Rep 1, 519-523, 2000.
46) Henderson BR. Nuclear-cytoplasmic shuttling of APC re- gulates β-catenin subcellular localization and turnover. Nat Cell Biol 2, 653-660, 2000.
47) Fukuda K. Apoptosis-associated cleavage of β-catenin in human colon cancer and rat hepatoma cells. Int J Biochem Cell Biol 31, 519-529, 1999.
48) Widlak P, Garrard WT. Discovery, regulation, and action of the major apoptotic nucleases DFF40/CAD and endonuclease G. J Cell Biochem 94, 1078-1087, 2005.
49) Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation. Exp Cell Res 256, 12-18, 2000.
