서 론
풀협죽도(Phlox paniculata L)는 꽃고비과(polemoniaceae) 의 코베아속(Cobaea)에 속하는 다년생 숙근초로서 1 m 정도 크기로 자라고 줄기는 여러 대가 뿌리 부분에서 밀집해 나오 고 직립하여 자라며 꽃은 원추화서형으로 핀다. 풀협죽도는
북아메리카가 원산지이며 현재는 국내 전국적으로 재배면적 이 늘어나고 있는 식물 중의 하나이다(Kwon et al., 2003).
최근 각종 천연물에 대한 관심이 높아지면서 자생식물은 생 리활성물질 뿐만 아니라 항암 물질의 원료로도 이용되고 있 다. 지금까지도 세계 각국에서는 천연 동식물 소재를 활용하 고 그 성분을 분석하여 인간에게 유용한 물질을 개발하려는 연구가 활발히 진행 중이다(Chung, 2000; Min et al., 1997; Lee et al., 2001). 특히 약용자생식물에 관한 많은 연구가 보고됨에 따라 부가가치가 높은 신약개발이나 건강식품의 소재 및 신 기능성 소재의 중요한 자원으로 인식되고 있다(Brooker et al., 1981). 이러한 자생식물들은 생리활성물질 뿐 아니라 다양한 암의 치료를 위한 항암 물질의 원료로도 이용되고 있을 만큼 응용 분야도 다양하다(Park et al., 2004; Kwon et al., 2002). 또
풀협죽도 추출물에 의한 구강암 KB 세포의 apoptosis 유도
문연희*
초당대학교 치위생학과
Induction of apoptosis by extract of Phlox paniculata L in KB human oral cancer cells
Yeon-Hee Moon*
Department of Dental Hygiene, Chodang University, Muan, Korea
ABSTRACT
Purpose: Phlox paniculata L, belonging to the Polemoniaceae family, is widely planted for ornamental purposes in Korea. Here,
we investigated the molecular basis underlying the antitumor effects of Phlox paniculata L.Materials and Methods: For this, we analyzed the effects of this plant on the proliferation and expression of cell apoptosis-
related molecules in KB human oral cancer cells. The proliferation test was conducted by MTT assay. Treatments with Phloxpaniculata L extract dramatically reduced cell viabilities in a dose- and time-dependent manner. In addition, typical apoptosis
patterns were detected by DNA fragmentation assay and Western blot analysis.Results and Conclusion: Western blot data revealed that activation of caspases-3 and -7 increased after 24 hours and 12 hours
of treatment, respectively. We also confi rmed DNA fragmentation upon treatment with Phlox paniculata L extract in KB human oral cancer cells. Collectively, these results suggest that Phlox paniculata L may have benefi cial effects on the proliferation of oral cancer cells through activation of apoptosis.Key Words: Apoptosis, Oral cancer, Phlox paniculata L
Received Sep 8, 2012
Revised version received 1st, Sep 10, 2012; 2nd, Sep 17, 2012 Accepted Sep 18, 2012
Corresponding author: Yeon-Hee Moon
Department of Dental Hygiene, Chodang University, Muan-ro, Muan-eup, Muan 534-701, Korea
Tel: 82-61-450-1283, Fax: 82-61-450-1711
E-mail: [email protected]
한 Danggui Longhui Wan이라는 약초의 구성 성분인 인디루 빈이 구강암 세포의 apoptosis를 유도한다는 연구결과가 보고 된 바 있다(Chon et al., 2007).
세포사멸현상(apoptosis 또는 programmed cell death)은 정 상적인 발생 단계 및 생리 작용에서 세포의 수를 일정하게 유 지하기 위해 필수적인 과정이다. 인간에게서 세포사멸이 제 대로 일어나지 않는 경우가 많아 세포사멸 기전의 파괴는 정 상세포가 암세포로 변화되는 주요한 원인이라 할 수 있다(Hu
& Kavanagh, 2003; Yoon et al., 2009). 현재 항암 화학치료를 위 해 강한 독성으로 세포의 파괴(necrosis)를 유도하는 것보다 위와 같이 암세포 특이적인 세포사멸 현상으로 암세포를 죽 이는 원리가 이용되고 있다.
구강암은 세계적으로 여섯번째로 흔하게 발생되는 암으로 현재까지는 화학 요법 및 방사선 치료에 의존해 왔으나, 이러 한 치료법은 구강암 조절이 쉽지 않으며 예후도 좋지 않아 구 강암을 효과적으로 제거할 수 있는 특이적 항암 물질의 개발 이 매우 필요한 실정이다(Landis et al., 1999; Parkin et al.,1999;
Chon et al., 2007).
지금까지 전 세계적으로 안정적이고 강력한 항암 효능을 가 진 물질을 찾기 위해 다양한 생리활성물질의 암세포에 대한 효능을 확인하였다. 그러나 풀협죽도 추출물이 암세포에 미 치는 영향에 대한 연구는 전무하다. 따라서 본 연구에서는 구 강 편평세포 암종 세포를 대상으로 풀협죽도 추출물을 이용 하여 구강암 세포에서의 독성효능과 apoptosis 유도효과를 조 사하여 풀협죽도 추출물이 구강암에 대한 항암 후보 물질로 사용 가능한 근거를 제시하고자 하였다.
재료 및 방법
세포주 및 세포배양
구강편평세포암종 KB 세포는 ATCC (Manassa, VA, USA)로 부터 구입하였고 5% bovine calf serum과 100 μg/mL strepto- mycin, 100 units/mL penicillin, 1×minimum essential medium (MEM) non-essential amono acid solution이 포함된 MEM에 서 37oC, 5% CO2 조건하에 계대 배양하였다. 메탄올로 추출 된 풀협죽도(Phlox paniculata L) 추출물은 한국 야생화 연구 소(Gurye, Korea)에서 분양받아 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해하여 사용하였으며, KB 세포에 정해진 시간 및 농도별로 처리하였다.
MTT 분석
풀협죽도 추출물에 대한 KB세포의 생존율을 조사하 기 위하여 24 well plate에 5×104 cells/well 세포를 접종하
고 24시간 동안 풀협죽도 추출물을 농도별(10 μg, 50 μg, 100 μg, 200 μg)로 처리한 후 세포배양액 0.5 mL와 MTT용 액 50 μL (5 mg/mL in phosphate buff ered saline [PBS])를 가 하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenylte-trazolium bromide (MTT) dye uptake 방법으로 확인하였다. 3시간 후 배양액을 제거하고 acid-isopropanol (0.04 M HCL in isopropanol)을 가하였다. 96 well plate에 상기한 용액 100 μL 와 acid-isopropanol 100 μL를 혼합 후 Microplate Autoreader ELISA (Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 사용 하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 DMSO만 처리 한 그룹에는 DMSO 2.5 μL를 분주한 뒤 세포 증식률을 관찰하 였다.
DNA fragmentaion 분석
2×106 KB 세포를 10-well culture plate에 분주한 후 풀협 죽도 추출물 50 μg/mL를 12시간, 24시간 동안 처리하였다.
세포는 5분간 4oC에서 200×g으로 침전시켜 수거하고 lysis buffer로 용해시킨 후 phenol (pH 7.5)로 DNA를 추출하였 고, 동량의 isopropanol을 첨가 후 -70oC에서 24시간 동안 보 관한 뒤 15,700×g으로 -20oC에서 침전시켰다. 분리한 DNA 를 ethidium bromide가 포함된 2% agarose gel에서 50 V로120 분 동안 전기영동을 한 다음 UV transilluminator (Spectronics Corporation, Westbury, NY, USA) 하에서 DNA fragmentation 현상을 관찰하였다.
Western blot 분석
KB세포(5×106 cells)는 PBS로 두 번 세척하고, PRO-PREPTM protein extraction solution (iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea) 용액을 적용한 후 30분 뒤 15초 동안 교반하였다.
15,700×g에서 2분간 4oC 원심분리하고 상층액만 모아 -20oC 에서 보관하여 사용하였다. Immunoblotting을 위해 단백 질 100 μg/lane은 12% SDS-Polyacrylamide gel 상에서 전기 영동하고, membrane은 5% milk/tris buffered saline에서 1시 간 처리하였다. 1차 항체 anti-cleaved caspase-3/-7 antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)를 2% milk/tris buff ered saline에 1:1,000 비율로 4oC 조건 하에 16시간 동안 처 리하였으며, tris buff ered saline-tween 20에 세척 후 2차 항체 anti-rabbit 또는 anti-mouse antibody (Amersham Biociences, Buckinghamshire, UK)는 1:5,000 비율로 1시간 처리한 후 immunoblotting하였다.
통계 분석
각 그룹의 평균값을 구하고 평균±표준오차로 표현하였다.
모든 통계적 계산은 Microsoft Excel (Microsoft Co., Redmond, WA, USA)을 사용하여 산출하였다.
결 과
풀협죽도 추출물에 의한 구강암 세포증식 억제
풀협죽도 추출물의 세포증식 억제 효과를 조사하기 위해 MTT assay를 이용하여 세포의 생존율을 조사하였다. 먼저 KB 세포를 24-well에 5×104 cell/well로 접종하고 풀협죽도 추출물 을 농도별 또는 시간별로 처리한 뒤 MTT assay를 시행하였다.
그 결과 KB 세포에서 풀협죽도 추출물의 농도에 따른 효과를 보면 풀협죽도 추출물을 처리 후 24시간 뒤 10 μg/mL 처리한 세포에서는 거의 변화가 없는 것에 비해, 50 μg/mL과 100 μg/
mL에서는 90% 이상 감소를 보임으로써 세포의 성장이 급격 히 감소되는 것을 관찰하였다(Fig. 1A). 또한 풀협죽도 추출물 을 농도별로 처리하고 3, 6, 12, 24시간 후 MTT assay를 한 결 과 50 μg/mL 처리한 세포에서는 3시간부터 20% 감소를 보였 고 24시간 이후에는 90% 이상 감소하였다. 또한 추출물을 100 μg/mL처리한 세포에서는 처리 후 3시간부터 64% 감소하여 세 포의 성장이 급격히 저해되는 결과를 보였다(Fig. 1B). 그러나 DMSO만 처리한 후에는 세포 성장 저해는 관찰되지 않았다.
DNA fragmentaion 분석
풀협죽도 추출물에 의한 KB세포의 apoptosis 유도를 알아
Fig. 1. Effect of Phlox paniculata L on KB cell proliferation. (A) Inhibition of cellular growth by extract of Phlox paniculata L treatment in a dose- dependent manner. KB cells seeded to well of 24 well plates in the presence of normal serum containing media at 5×10
4cells/well. Twenty four hours later, cells were treated with virious concentration (10, 50, 100 and 200 µg/mL) of extract of Phlox paniculata L further 24 hours. Then MTT assay was performed as explained in Material and Methods. (B) Inhibition of cellular growth by extract of Phlox paniculata L treatment in a time-dependent manner. KB cells seeded to well of 24 well plates in the presence of normal serum containing media at 5×10
4cells/well. Twenty four hours later, cells were treated with virious concentration (10, 50, and 100 µg/mL) of extract of Phlox paniculata L for the indicated time.
Then MTT assay was performed as explained in Material and Methods.
Fig. 2. Induction of DNA fragmentation by Phlox paniculata L in KB
cells. DNA fragmentation assay was examined to confi rm of apop-
tosis after treatment of Phlox paniculata L extract (50 µg/mL) for 12
and 24 hrs, respectively. Genomic DNA was prepared as described in
Materials and methods and analyzed by 2% agarose electrophoresis
followed by ethidium bromide staining. The fi gure is a representa-
tive of results from three independent experiments. DMSO: dimethyl
sulfoxide.
보기 위해 풀협죽도 추출물 50 μg/mL을 12시간, 24시간 동 안 처리한 후 확인한 결과 12시간, 24시간 모두에서 DNA fragmentation을 분명하게 볼 수 있었다(Fig. 2).
Western blot
KB 세포에서 풀협죽도 추출물이 apoptosis에 의한 세포사 를 유도하는지 조사하기 위해 apoptosis를 활성화시키는 단백 질인 caspase-3/-7의 발현을 확인하였다. 풀협죽도 추출물 처 리 후 cleaved caspase-3/-7의 발현이 12시간에서 약하게 발현 되고 24시간에서 더욱 진하게 발현되는 것을 확인하였다(Fig.
3). 반면에 추출물을 처리하지 않은 세포와 DMSO만 처리한 세포에서는 전혀 발현되지 않았다.
고 찰
오늘날 생물산업이 발달함에 따라 약용식물은 중요한 자 원으로 여겨지고 있으며 그 중에서도 항바이러스 효과, 항종 양 효과 및 항염작용 등을 나타내는 식물소재들의 다양한 생
리활성 물질을 찾고자하는 노력이 활발해지면서 이들 천연물 을 각종 세포 및 세균에 적용 후 독성 효능에 관한 많은 연구가 진행되고 있다(Lee YC et al., 2002; Kim et al., 2007). 특히 대부 분의 후보 약물들은 낮은 항암 효율과 약물에 대한 저항성 유 발 때문에 전 임상 단계에서 개발이 제한되고 있다(Yoon et al., 2009). 일부 식물의 경우에도 강한 약리작용 및 유독성으로 인해 그 안전성이 입증되지 않아 실제 실생활에 응용되어 상 품화된 경우는 그리 많지 않다(Yang et al., 1995; Lee CH et al., 2002). 따라서 본 연구에서는 주변에서 흔히 자생하는 풀협죽 도 추출물을 이용하여 구강암 세포주인 KB 세포의 억제 효과 와 apoptosis 유도에 대해 연구하였다.
이전의 연구결과에서 사람의 섬유아세포에 풀협죽도 추출 물을 50 μg/mL의 농도로 처리한 결과 세포증식에는 어떠한 영향도 주지 않았다. 일반 정상세포에는 전혀 독성이 없는 안 전한 농도의 풀협죽도 추출물을 KB 세포에 적용한 뒤 세포증 식의 억제 효과를 MTT assay로 확인하였다. KB 세포에 추출 물을 농도별로 처리한 결과 처리 후 24시간 뒤 50 μg/mL의 농 도를 기준으로 세포의 성장을 90% 이상 급격히 저해시키는
Fig. 3. Activation of caspase-3 and -7 by treatment of Phlox paniculata L extract in KB cells. (A) Western blot analysis of caspase-3 and -7 in KB
cells. The cells were treated with 50 µg/mL of Phlox paniculata L extract for the indicated time periods. The cell lysate was prepared and analyzed
by western blot analysis as described in Materials and Methods. (B) Quantitative analyses of the blots in (A). DMSO: dimethyl sulfoxide.
효과를 보였다(Fig. 1A). 또한 추출물의 농도에 따른 시간별 처리 후 세포의 증식률은 50 μg/mL에서 12시간 이후 54%로 세포의 증식이 급격한 저해를 보였고, 100 μg/mL 처리 후 3시 간부터는 64% 이상 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 1B). 최근 문주란 추출물에 대한 연구결과에 따르면 HL-60 백혈병 세포 에 문주란 추출물을 50 μg/mL로 4일간 처리 후 83%의 효과를 보인 결과에 비해 세포증식억제에 더욱 효과적임을 확인하였 다(Hyun et al., 2008).
풀협죽도에 의한 KB 세포의 성장 증식 억제효과의 기전으 로 apoptosis를 고려할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 풀협죽 도 추출물의 KB 세포 증식 억제 효과가 apoptosis 유도 작용 에 의한 것인지 알아보기 위해 우선 DNA fragmentation을 확 인해 보았다. DNA 분절 현상은 apoptosis의 대표적 현상으로 Ca2+ 의존성 endonuclease가 활성화되어 chromatin의 linker DNA가 절단되어 nucleosomal DNA 분절을 이루게 된다. 이 러한 현상을 agarose gel에서 ladder 형태로 관찰할 수 있다 (Zimmermann et al., 2001). 풀협죽도 추출물을 KB 세포에 50 μg/mL 농도로 12시간 및 24시간 동안 처리하여 DNA ladder를 확인한 결과, Fig. 2에서와 같이 12시간, 24시간 모두에서 뚜 렷한 DNA ladder를 관찰할 수 있었고 반면 DMSO 처리 후에 는 어떠한 단편화 현상도 없었다. 또한 풀협죽도 추출물의 구 강암 세포 증식 억제가 전형적인 apoptosis의 사포사멸에 의 한 결과인지 확인하기 위해 apoptosis 유도 기전의 특징적인 caspase-3/-7 단백질 활성을 조사한 결과 풀협죽도 추출물 처 리 후 cleaved caspase-3/-7 모두 발현이 증가되는 것을 확인하 였다. 이와 같은 결과로 풀협죽도 추출물을 구강세포주인 KB 세포에 처리하면 apoptosis의 특징적인 경로에 의해 세포의 증 식억제 및 세포사멸과정을 유도하는 것으로 생각된다.
결론적으로, 이 연구에서는 기존의 알려진 항암제보다 강한 효능을 보이는 항암 물질을 개발하기 위해 새로운 풀협죽도 추출물의 효능을 구강암 세포주인 KB 세포에 적용하여 연구 하였다. 그 결과 구강암 세포에 풀협죽도 추출물을 50 μg/mL 농도로 처리하게 되면 세포의 증식을 빠른 시간 내에 억제시 킬 수 있을 뿐 아니라 apoptosis라는 세포사멸을 유도해 효과 적인 항암 후보물질이 될 수 있으며, 구강암에 특이적인 항암 제로서 개발에 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다.
