209
목 적: 추간판의 기질의 파괴와 퇴행성 변화에 깊이 관여하는 것으로 알려진 세포외 효소인 matrix metalloproteinase-3 (MMP-3; stromelysin)을 이용하여 퇴행성 측만증과 측만증이 동반되지 않은 단순 척추관 협착증 환자의 추간판에서의 MMP-3의 발현의 정도를 western blotting과 면역조직화학 염색을 이용 분석하여 추간판 기질의 파괴가 퇴행성 요추 측 만증의 병인에 있어서 관련됨을 증명하고자 한다.
대상 및 방법: 추간판 탈출증, 척추관 협착증 및 퇴행성 요추 측만증 환자에서 수술 중 제거한 추간판의 조직을 이용하였 다. 모든 조직의 채취는 후방 도달법에 의한 추간판 제거술로 시행되었으며, 채취된 조직은 즉시 액화 질소에 의하여 냉동 보관하였다. 채취된 조직 중 추간판 탈출증 2예를 대조군으로, 척추관 협착증 8예 및 퇴행성 요추 측만증 7예를 대상으로 하였다. Antihuman MMP-3를 이용하여 추간판의 면역화학적 염색과 western blotting을 시행하였다.
결 과: 면역조직화학 염색 결과 MMP-3의 발현에 있어서 퇴행성 요추 측만증의 추간판에서 측만증이 동반되지 않은 척추 관 협착증의 추간판보다 상당히 많은 양성 염색을 나타내었으며, western blotting 의 정량적 분석에 있어서도 퇴행성 요 추 측만증(평균 optical density: 20.68±8.4)에서 척추관 협착증(평균 optical density: 6.24±3.6)보다 유의하게 많은 발현 을 보였다.
결 론: 퇴행성 요추 측만증에 있어서 추간판의 퇴행성 변화와 관계가 깊은 MMP-3의 발현은 단순 척추관 협착증에 비하여 유의하게 많은 발현을 보였다. 따라서 퇴행성 요추 측만증의 병인에 있어서 MMP-3가 추간판의 퇴행성 변화에 중요한 역 할을 하는 것으로 생각된다.
색인 단어: 추간판, MMP-3, 퇴행성 요추 측만증, 척추관 협착증
Department of Orthopedic Surgery, Dae-Lim St. Mary’s Hospital, Seoul; Department of Orthopedic Surgery, Kang-Nam St. Mary’s Hospital College of Medcine, The Catholic University of Korea*, Seoul, Korea
Young-Hoon Kim, M.D., Kee-Yong Ha, M.D.*, Gyung-Min Kil, M.D., and Kwang-Young Choi, M.D.*
The Differences in Expression of Matrix Metalloproteinase-3 in Degenerative Lumbar Scoliosis and Spinal Stenosis
209
퇴행성 척추 측만증과 척추관 협착증에서 Matrix Metalloproteinase-3 발현의 차이
김영훈ㆍ하기용*ㆍ길경민ㆍ최광영*
대림성모병원 정형외과, 가톨릭대학교 의과대학 강남성모병원 정형외과*
209 209 통신저자 : 하 기 용
서울시 서초구 반포동 505 가톨릭대학교 강남성모병원 정형외과 TEL: 02-590-1464∙FAX: 02-535-9834
E-mail: kyh@cmc.cuk.ac.kr
Address reprint requests to Kee-Yong Ha, M.D.
Department of Orthopedic Surgery, Kang-Nam St. Mary’s Hospital, College of Medcine, The Catholic University of Korea, 505 Banpo-dong, Seocho-gu, Seoul 135-701, Korea
Tel: +82.2-590-1464, Fax: +82.2-535-9834 E-mail: kyh@cmc.cuk.ac.kr
Purpose: This experimental study hypothesize that rapid degeneration of the intervertebral disc over the ability of auto-stabilization by osteophytes bridging to adjacent segments might be the pathomecha- nism of degenerative lumbar scoliosis (DLS).,,
An effort to prove this hypothesis was attempted by con- firming the differences in the expression of matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) in DLS and pure spinal stenosis.
Materials and Methods: The intervertebral disc materials obtained during a discectomy through a pos- terior approach, were included in this experimental study. Two protruded herniated nucleus pulposus were included for the control group. Eight spinal stenosis and seven DLS were included as experimental groups 1 and 2, respectively. The expression of MMP-3 was evaluated by immunohistochemical staining and western blotting using anti human MMP-3 antibody.
,,
척추의 퇴행성 변화는 추간판의 퇴행성 변화부터 시작 되며, 이러한 변화는 척추의 골단판의 골화가 완성되는 사춘기 이후부터 추간판의 영양 공급의 저하와 함께 기 계적인 원인이 추가되어 퇴행성 변화를 가속화시키는 원 인으로 생각된다3). 특히 척추의 퇴행성 질환 중 퇴행성 요추 측만증은 임상 양상 및 방사선학적 소견이 다른 퇴 행성 질환과 차이가 있는데 현재까지 이에 대한 정확한 원인은 알려져 있지 않으며, 골다공증이나 추간판의 빠 른 퇴행성 변화에 의할 것이라는 추정만 되고 있는 상태
이다5,18). 일반적으로 추간판의 변성 변화는 척추의 불안
정성을 초래하며, 이에 대한 신체의 반응으로 추체 분절 의 안정을 얻고자 골극화가 발생하는데 퇴행성 요추 측 만증에 있어서는 추간판의 퇴행성 변화가 빠르게 진행되 어 골극 형성을 통한 척추 분절의 재 안정화 과정 이전에 측만증으로의 진행이 이루어진다고 생각되고 있다.
결국 척추의 퇴행성 변화는 질환별에 따라 다른 임상적 및 방사선학적 소견을 보이며 한 척추분절(functional spinal unit)에서 양 후관절, 추간판의 퇴행성 정도에 따라 임상적 소견이 달라질 수 있다. 따라서 이에 대한 분석이 필요하며, 최근에 척추분절의 퇴행성 변화에 대 하여 분자 유전학적 연구가 많이 진행되고 있으며, 후관 절 및 추간판의 퇴행성 변화와 관련된 단백질에 대하여 많은 연구가 이루어져 있다6-8,10,11).
척추의 퇴행성 변화는 추간판의 주요 성분인 당단백질 의 파괴가 추간판의 퇴행성 변화에 중요한 과정으로 작 용하며, 이에 관여하는 matrix metalloproteinase-3 (MMP-3; stromelysin)가 중요한 세포외 효소로 알려
져 있다2,8,9,12,16). 추간판의 주요 구성 성분인 당단백질은
aggregating 당단백질과 non-aggregating 당단백 질로 구성되어 있으며, aggregating 당단백질의 감소 가 추간판의 퇴행성 변화의 중요한 과정이며, 이 과정에
있어서 MMP-3 효소는 aggregating 당단백질의 분해 에 중요한 작용을 한다. MMP-3은 활성화를 위하여 금 속 이온이 필요하며, 관절 연골 및 추간판의 당단백질의 분해에 있어서 특히 당단백질의 hyaluronic acid 결합 부위의 연결을 끊어 당단백질의 분해에 관여 하는 것으로 알려져 있다22).
따라서 본 연구는 퇴행성 요추 측만증과 측만증이 동 반되지 않은 척추관 협착증 환자의 추간판에서 MMP-3 의 발현의 정도를 western blotting과 면역조직화학 염색법을 이용 분석하여, 추간판의 퇴행성 변화에 따른 질환의 차이를 증명하며, 퇴행성 요추 측만증의 원인으 로 추간판의 심한 변성 변화 및 이 과정에서 MMP-3의 관련성에 대하여 증명하고자 본 실험을 시행케 되었다.
재료 및 방법
1. 추간판 조직의 채취
추간판 탈출증, 척추관 협착증 및 퇴행성 요추 측만증 환자에서 수술 중 채취된 추간판 조직을 이용하였다. 모 든 조직의 채취는 후방 도달법에 의한 추간판 제거술로 시행되었으며, 채취된 조직은 즉시 액화 질소에 의하여 냉동보관하였다. 대조군으로 추간판 탈출증 2예, 척추 관 협착 증 8예 및 퇴행성 요추 측만증 7예를 포함하였다 (Table 1).
퇴행성 요추 측만증의 정의는 방사선학적으로 요추부 의 추간판의 퇴행성 변화가 심하며, 관상면상 측만증이 10° 이상이 있는 경우로 진단하여 분류하였으며19), 연령 별 차이에 따른 오차를 줄이기 위하여 척추관 협착증(평 균 연령: 65.8세)과 퇴행성 요추 측만증(평균 연령: 63.3 세)의 환자의 선택을 50-70세로 제한하였다. 대조군으 로 정상의 추간판 조직을 사용하여야 하나 정상의 추간판 조직을 얻기가 어려워 추간판 탈출증의 환자 중 탈출형 Results: In the immunohistochemical stains, sparse staining was noted in the control group. More stain- ing, however, mainly extracelluar, was noted in the discs of DLS compared with those of the spinal steno- sis group. In western blotting, greater MMP-3 expression was noted in the discs of DLS (mean optical den- sity: 20.68) than in those of the spinal stenosis group (mean optical density: 6.24) which was statistically significant (p<0.05).
Conclusion: Rapid degeneration of the intervertebral disc might be an important factor for the pathogen- esis of DLS. MMP-3 could be one of the key enzymes for the rapid degeneration of the intervertebral discs especially in DLS.
Key Words: Intervertebral disc, Matrix metalloproteinase-3, Degenerative Lumbar scoliosis, Spinal stenosis
이 아닌 돌출형의 추간판을 대조군으로 실험하였다.
2. Matrix Metalloproteinase-3의 발현 1) 면역 조직 화학적 분석
냉동된 각각의 조직을 상온에서 녹인 후 10% formalin 용액을 이용하여 고정한 후 paraffin에 포매하였다. 파 라핀 포매 조직을 3 m로 잘라 슬라이드에 부착시킨 후 60℃warmer에서 1시간 정도 조직이 떨어지지 않도록 안정되게 다시 한번 부착시켰다. Xylene 3단계로 탈파 라핀 하고 함수 과정을 거친 후 항원의 발현을 위해 PH 6.0인 citrate buffer에 5분간 2회 끓인 후 전자렌즈 안에서 10분, 실온에서 10분 방치 후 buffer로 수세하고 조직 내에 있는 peroxidase의 활성을 억제시키기 위하 여 0.3% H202-methanol 용액에 10분간 반응시켰다.
수세 후 비특이적인 항원-항체 결합을 방지하기 위하여 정상 인체 혈청에 15분간 반응시킨 후 1:60으로 희석된 antihuman MMP-3 monoclonal antibody (IM70, Oncogene Research Products, San Diego, CA, USA)를 primary antibody로 실온에서 90분간 결합 시킨 당단백인 avidin이 비타민 biotin에 친화력이 강 한 원리를 이용한 ABC법으로 발색했다. 1차 항체를 결 합시킨 슬라이드에 biotin이 부착된 secondary 항체로 실온에서 30분간 결합시킨 후 avidin과 효소가 결합된 검출계를 secondary 항체와 반응시킨다. Avidin에 존
재하는 탄수화물로 인한 lectin과 같은 물질에 친화력으 로 인한 비특이 결합을 막기 위하여 avidin의 결점을 보 완되어 있는 streptavidin을 사용했다. 검출계로 perox- idase를 부착시킨 후 AEC (3-amino-9-ethylcarba- zole)로 발색시켰다. 대조 염색으로 hematoxylin-eosin 염색을 실시하였다.
2) Western blotting을 이용한MMP-3의 정량적 분석 냉동 보관 되어있던 조직을 homogenizer를 이용하여 잘게 부순 후 단백질을 분리하기 위하여 Ready PrepTM (163-2103, Bio-Rad, CA, USA)반응 용액과 pro- teinase inhibitor를 이용하여 단백질을 추출하여, 4℃ 에서 15,000 rpm으로 원심 분리하여 상층액을 따로 분 리하여 실험에 사용하였다.
검체를 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate poly- acrylamide gel electrophoresis)을 이용하여 전기영 동하여 단백질을 크기 별로 분리 한 다음 gel을 꺼내어 transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20%
methanol)에 10-15분 정도 담가둔 후 nitrocellulose filter와 함께 electrotransfer kit에 담근 후 250-300 mA로 1시간 동안 transfer하였다. Nitrocellulose filter를 Ponceau S (Ponceau S 2 g, trichloroacetic acid 30 g, sulfosalicylic acid 30 g) 용액에 2분 정도 담근 후 증류수로 씻어내어 transfer band를 확인한 후 blocking buffer를 이용하여 filter 여백에 비 특이적 항체의 결합을 예방하였다.
Anti human MMP-3 antibody를 첨가하여 상온 에서 1시간 동안 반응시킨 후 peroxidase labeled anti-mouse antibody (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)를 이차 항체로 이 용하여 반응시킨 후 ECL (enhanced chemilumi- nescence) kit (Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 감광하여 결과를 확인하였다. 감광의 정도를 Image Master� VDS (Amersham Pharmacia Bio- tech) software를 이용하여 optical density (OD)를 측정하였다.
3. 통계적 분석
Western blotting에서 발현된 MMP-3의 상대적 양 을 optical density로 측정하여 척추관 협착증 및 퇴행
Sample No. Age Sex Diagnosis
1 25 M HNP
2 30 F HNP
3 60 M SS
4 67 F SS
5 78 F SS
6 69 F SS
7 70 M SS
8 67 M SS
9 63 F SS
10 68 M SS
11 56 F DLS
12 65 F DLS
13 70 F DLS
14 63 M DLS
15 67 M DLS
16 59 F DLS
17 63 M DLS
Table 1.Demographics of the subjects
HNP, Herniated Nucleus Pulposus; SS, Spinal Stenosis; DLS, Degen- erative Lumbar Scoliosis.
성 요추 측만증에서의 통계학적 유의를 위하여 inde- pendent sample t-Test (SPSS for windows 11.0) 를 이용하여 검증하였다.
결 과
1. 면역조직화학염색
면역화학적 염색 결과 MMP-3의 발현은 세포외 조직 에서 발현되었으며, 대조군인 추간판 탈출증의 조직에 서는 발현이 미미하였다(Fig. 1). 퇴행성 요추 측만증의 환자에서 얻은 추간판에서는 현저하게 많은 발현을 보였 으며, 이는 측만증이 없는 척추관 협착증(Fig. 2, 3)에 비하여 현저한 차이를 나타내었다(Fig. 4, 5).
2. Western blotting
동일한 정량에서의 MMP-3의 발현을 western blot- ting을 이용하여 얻은 band를 optical density (OD)를 측정하여 분석한 결과 대조군인 추간판 탈출증에서의 평 균 OD는 2.0±1.4이었으며, 척추관 협착증에서의 평균 OD는 6.24±3.6이었으며, 퇴행성 요추 측만증에서의 평균 OD는 20.68±8.4이었다(Fig. 6). 또한 각 군 간 의 평균 OD의 차이는 통계학적 의의가 있었다(p<0.05).
고 찰
추간판의 퇴행성 변화는 모든 퇴행성 척추 질환에서 초기의 변화로 생각하는데, 확산에 의한 추간판의 영양
Fig. 1.Immunohistochemical staining for MMP-3 (counter-stain with H-E, ×100). Sparse expression of MMP-3 in HNP.
Fig. 2.Immunohistochemical staining for MMP-3 (counter-stain with H-E, ×100). Degenerations of the disc and the expression of MMP-3 are noted in the sample, obtained in SS. The expres- sion of MMP-3 is marked by a reddish area.
Fig. 3.Immunohistochemical staining for MMP-3 (counter-stain with H-E, ×100). Degenerations of the disc and the expression of MMP-3 are noted in the sample, obtained in SS. The expres- sion of MMP-3 is marked by a reddish area.
Fig. 4.Immunohistochemical staining for MMP-3 (counter-stain with H-E). Severe disc degeneration with many cleft of the disc material is noted. Profuse expressions of MMP-3 is noted by the reddish stains in DLS.
공급이 사춘기 이후에는 척추체의 종판의 골화로 혈액순 환의 장애에 의한 퇴행성 변화가 시작된다고 알려져 있 다. 또한 반복적인 운동 및 외상에 의한 기계적인 손상 을 추간판의 퇴행성 변화의 다른 원인으로 생각하고 있
다4,17). 그러나, 임상에서 개인적인 차이와 질환 별 추간
판의 퇴행성 변화에 대한 차이가 확실히 존재 한다. 따라 서 추간판의 퇴행성 변화에 있어서 유전학적 차이가 존 재하리라는 예상은 쉽게할 수 있으며, 최근에는 이를 뒷 받침하는 연구가 발표되고 있고1,6,7,10-13), 이 중 vitamin D receptor 유전자와 MMP-3 유전자의 polymorphism 이 추간판의 퇴행성 변화와 관련이 있다고 보고되고 있
다13,20,21,11). 이 중 MMP-3은 관절 연골 및 추간판의 퇴
행성 변화에 있어서 중요한 부분을 차지하는 효소13,14)로 당단백질의 중심단백질과 hyaluronic acid의 연결을 끊 음으로써 당단백질을 분해한다.
추간판의 기질의 파괴에 있어서는 조직의 산성 환경에 서 작용하는 proteinase로 cathepsin D와 thiol pro- teinase 등이 관여하여 추간판 자체의 autolysis에 의한 기질의 파괴가 중요한 기전으로 이해되었으나15), 최근에 는 중성 환경에서의 작용하는 단백질 분해 효소인 MMP- 3의 역할에 초점이 맞춰지고 있다. 또한 퇴행성 추간판 에서의 MMP-3의 발현의 증가와, tissue inhibitor of metalloproteinase-1과의 균형의 파괴가 추간판의 퇴 행성 변화와 관련이 있다는 주장이 있으며10), MMP-3에 의하여 대식 세포에서 chemoattractant의 분비를 촉진 시켜 추간판의 퇴행성 변화가 더욱 촉진되며9), MMP-3
유전자의 promoter 중 5A allele 인 경우 퇴행성 변화 가 빠르다는 보고도 있다20). 그러나 이들 모든 연구가 퇴 행성 추간판에 대한 조직을 연구하였으나, 실제 임상에 서 모든 척추의 퇴행성 질환이 같은 임상 및 방사선학적 경과를 따르는 것이 아니며 질환에 따라 다른 양상을 보 인다. 따라서 본 연구는 같은 퇴행성 질환이지만 다른 임 상 및 방사선 소견을 보이는 퇴행성 요추 측만증에서 단 순 척추관 협착증과 차이점을 발견하고자 추간판의 변성 변화에 차이가 있는지 확인하기 위하여 분자학적으로 실 험케 되었다. 실험 결과로 퇴행성 요추 측만증의 경우 추 간판 조직에서의 MMP-3의 발현이 단순 척추관 협착증 과 추간판 탈출증의 추간판 조직과 달리 현저 한 차이가 나타났으며, 추간판 기질의 파괴의 소견으로 기질의 갈라 짐 현상이 관찰되었는데 이는 퇴행성 요추 측만증의 병리 기전으로 추간판의 퇴행성 변화에 MMP-3가 관여함을 증명할 수 있었다. 이러한 실험적 결과로 퇴행성 요추 측 만증이 다른 퇴행성 척추 질환과 달리 추간판의 변성 변 화에 따르는 척추의 불안정성을 극복하기위한 골극 형성 등의 과정을 통한 재 안정화 과정이 이루어지기 전에 빠 른 추간판 기질의 파괴가 원인이 되어 방사선상 시상면 및 관상면상의 측만증 및 요추 전만의 소실이 유발되는 것으로 생각된다. 또한 대조군으로 사용한 추간판 탈출 증의 조직에서는 MMP-3의 발현이 다른 질환에 비하여 적었는데 이는 본 실험에 사용된 추간판이 돌출형(pro- trusion) 추간판 탈출증의 환자의 조직을 사용하였던 것 이 원인이 될 수 있을 것으로 생각하며, 이는 추간판 탈출 증 중 돌출형보다 탈출형(extrusion or sequestrum) Fig. 6.Expression of MMP-3 in the intervertebral disc of various spinal diseases. Intensity of the bands was evaluated using Image Master�VDS software standardized for b-actin expression. HNP, Herniated Nucleus Pulposus; SS, Spinal Stenosis; DLS, Degen- erative Lumbar Scoliosis; *, p<0.05.
Fig. 5.Immunohistochemical staining for MMP-3 (counter-stain with H-E). Severe disc degeneration with many cleft of the disc material is noted. Profuse expressions of MMP-3 is noted by the reddish stains in DLS.
40 kd
HNP DLS DLS SS DLS SS DLS HNP MARKER
25 20 15 10 5
0HNP (n=2) SS (n=8) DLS (n=7) Expression of MMP-3
Optical density 20.68
*
6.24 2
추간판에서 MMP-3와 같은 효소의 발현이 현저히 증가 한다는 보고와 일치한다13). 따라서 퇴행성 요추 측만증 과 다른 퇴행성 척추 질환과의 MMP-3에 대한 유전자적 비교 연구를 향후 실시함으로써 퇴행성 척추 질환의 예 후 및 치료의 방침을 결정하는데 중요한 기준으로 사용될 수 있을 것으로 생각한다. 또한 퇴행성 요추 측만증은 MMP-3에 의한 추간판의 빠른 퇴행성 변화로 발생되는 것을 증명할 수 있었다
결 론
퇴행성 요추 측만증에 있어서 추간판의 퇴행성 변화와 관계가 깊은 MMP-3의 발현은 단순 척추관 협착증에 비하여 유의하게 많은 발현을 보였다. 따라서 퇴행성 요 추 측만증의 병인에 있어서 MMP-3가 추간판의 퇴행성 변화에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
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