Screening and Purification of an Antimicrobial Peptide from the Gill of the Manila Clam Ruditapes philippinarum

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Copyright © 2016 The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science pISSN:0374-8111, eISSN:2287-8815

서 론

대부분의척추동물및무척추동물들은세균

,

^바이러스

,

^곰팡 이

,

^{또는기생충등과같은외부미생물의침입으로부터자신} 을방어하기위한효과적인면역체계를각각포함하고 있다

(Hancock and Diamond, 2000).

선천면역과적응면역이각각 잘발달되어있는척추동물과는달리무척추동물은선천면역 만을포함하고있으므로외부환경에대한방어작용은오로지 선천면역에만의존하고있다

.

^{일반적으로선천면역은외부침} 입물질에대한초기방어및적응면역의유도를담당하므로그 기능과역할에대한관심이최근들어서증대되고있는실정이 다

.

^{선천면역을담당하는대표적인물질로는}

lectin, propheno- loxidase activating factor, phagocytosis, antimicrobial peptide

등이알려져있으며

,

^{이들은외부로부터생체내로의이물질침}

입에대한

1

차방어역할을담당한다고알려져있다

(Relf et al., 1999; Tincu and Taylor, 2004).

최근들어서여러가지의선천 면역요소들중에서비특이적이고빠른반응성을가지는자연 친화적인항균펩타이드에대한관심이증가되고있는실정이 다

(Zasloff, 2002).

항균펩타이드는유전자에의해암호화되어있는양친매성의

α-helix

^나

β-sheet

^{구조를취하는}

positive net charge

^를가지는

12-100

^{개의아미노산으로구성된선천면역에관여하는물질로}

서

,

^{미생물뿐만아니라무척추동물에서척추동물에이르는넓} 은범위에서분포하고있는단백질성항균물질이다

(van’'t Hof et al., 2001; Stark et al., 2002; Izadpanah and Gallo, 2005).

또 한항균펩타이드는막을주요

target site

^{로삼고있으므로내성} 균유발의가능성이거의없는특징을가지고있어서차세대항 생제개발을위한주요후보물질로서각광을받고있다

(Han-

바지락( Ruditapes philippinarum) 아가미로부터 항균 펩타이드의 탐색 및 정제

서정길*

국립 군산대학교 해양과학대학 식품생명공학과

Screening and Purification of an Antimicrobial Peptide from the Gill of the Manila Clam Ruditapes philippinarum

Jung-Kil Seo*

Department of Food Science and Biotechnology, Kunsan National University, Kunsan 54150, Korea

This study screened the biological activity of an acidified gill extract of the Manila clam Ruditapes philippinarum in- cluding antimicrobial, hemolytic, membrane permeabilization, and DNA-binding activity, and purified the antimicro- bial material. The acidified gill extract showed potent antimicrobial activity against Bacillus subtilis and Escherichia coli without significant hemolytic activity, but showed no membrane permeabilization or DNA-binding ability. An antimicrobial material was purified from the acidified gill extract using C ₁₈ reversed-phase and cation-exchange high- performance liquid chromatography (HPLC). Treatment of the purified material with trypsin completely abolished all of the antibacterial activity against Bacillus subtilis , suggesting that the purified material is a proteinaceous antibiotic.

The molecular weight of the purified material was 2571.9 Da, but no primary structural information was obtained due to N-terminal blocking. A future study should confirm the primary structure. Our results suggest that the Manila clam gill contains proteinaceous antibiotics that have a role in first-line defense. This information could be used to better understand the Manila clam innate immune system.

Key words: Manila clam, Ruditapes philippinarum , Antimicrobial peptide, Innate defense, Purification

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial Licens (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

http://dx.doi.org/10.5657/KFAS.2016.0137 Korean J Fish Aquat Sci 49(2) 137-145, April 2016

Received 29 February 2016; Revised 1 April 2016; Accepted 7 April 2016

*Corresponding author: Tel: +82. 63. 469. 1827 Fax: +82. 63. 469. 7448

E-mail address: [email protected]

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서정길

cock REW and Diamond G, 2000; Zasloff M, 2002).

항균펩타이드는구조에따라서크게

4

가지종류로나눌수 있다

(Andreu and Rivas, 1998): i) Cys

^{을포함하지않는}

linear α-helical peptide, ii) Cys

을포함하는

looped peptide, iii)

특 이구조를취하지않는

random extended peptide, iv)

^특이아 미노산을많이포함한

peptide

^등이다

.

^{항균펩타이드는이온} 결합과소수성상호작용을이용한

barrel-stave model, toroidal model

^또는

carpet model

^을통해서

membrane pore

^를형성하 거나세포내부로들어가세포내기관이나대사과정의저해를 통해서항균효과를나타낸다고알려져있다

(Shai, 2002; Li, 2009).

^{현재까지해양무척추동물유래항균}

peptide

^는갯지렁 이

(Ovchinnikova et al., 2004),

군소

(Iijima et al., 2003),

투구 게

(Miyata et al., 1989; Saito et al., 1995),

^꽃게

(Khoo et al., 1999),

흰다리새우

(Destoumieux et al., 1997),

홍합

(Charlet et al., 1996; Mitta et al., 1999; Mitta et al., 2000),

^굴

(Seo et al., 2005; 2012; 2013; Nam et al., 2015; Gueguen et al., 2006),

^전 복

(De Zoysa et al., 2009)

등이보고되어있다

.

바지락은우리나라의패류산업에서큰비중을차지하는패류 양식자원중의하나로서중요성이크게증대되고있으나

,

최근 들어서다양한병원성미생물감염원에의한대량폐사가일어 나고있어서경제적

,

^{환경적으로큰문제가되고있다}

(Park et al., 2006).

따라서이러한문제점을해결하기위한기초자료로 서바지락의

host defense mechanism

^{을이해하고}

,

^{질병감염원} 의종류또는분포와바지락의선천면역요소들간의상호연관 성연구가절실히요구되고있는실정이다

.

^특히

,

^{다양한해양무} 척추동물에있어서선천면역요소중의하나인항균펩타이드의 질병감염에대한효과적인방어기능이보고되면서질병감염에 대한연구가활발히진행되고있는반면

,

^{바지락과연관된항균} 펩타이드에대한연구는극히제한적으로진행되고있는실정 이다

.

^{현재까지보고된바지락유래항균펩타이드는}

defensin (Zhang et al., 2015), big defensin (Zhao et al., 2010)

^또는

mus- sel defensin MGD-1

유사

peptide (Kang et al., 2006)

등과같 은

defensin

^{류에한정되어있으므로선천면역을담당하는다양} 한항균펩타이드에대한연구가필요한실정이다

.

따라서본연구는바지락

(Manila clam, Ruditapes philippina-

rum)

^{의면역관련조직인아가미추출물을이용해서항균활성}

의탐색및항균물질의정제과정을수행하고항균물질의구조 규명과정을수행함으로써바지락의선천면역에대한기초자료 를제공하고자수행되었다

.

재료 및 방법

실험동물

본실험에사용한바지락

(Manila clam, Ruditapes philippina- rum)

은충청남도곰소만에서구입하였으며바지락의아가미와 외투막조직을추출에사용하였다

.

^{모든추출물은사용하기전}

까지

-70

^o

C

^{에보관하였다}

. 시약 및 재료

항균활성측정을위한

tryptic soy broth (TSB)

와

agarose type I (Low EEO Agar)

은

Merck

사

(Merck, Darmstadt, Germany)

와

Sigma

^사

(St. Louis, MO, USA)

^{에서각각 구입하여 사용} 하였다

.

^{정제과정에서 사용된}

HPLC

^용

water

^와

acetonitrile (CH

₃

CN)

은

Tedia

사

(Ohio, USA)

로부터구입하였고

,

그이외 의모든시약들은특급을사용하였다

.

추출방법

바지락의패각을흐르는수돗물에씻어서패각오염물을제거 한후

,

^{아가미와외투막조직을취하여}

5 mL volume

^이될때까 지얼음속에서모았다

.

모아진아가미와외투막조직에끓고있 는

4

^배량의

1% acetic acid(v/v)

^{를첨가하여}

100℃

^에서

5

^분동 안끓인후

,

얼음에보관하여충분히냉각시켰다

.

충분히냉각 된조직은

homogenizer (T10 basic ULTRA-TURRAX, IKA, USA)

^{를사용하여완전히파쇄시켰다}

.

^{조직파쇄액은}

4℃

^에서

20

분동안

8,000 g

로원심분리

(VS-21SMT, Vision Scientific, Buchon, Korea)

^{를행한후에상층액을취해서항균활성탐색} 및항균물질의정제과정에사용하였다

.

항균활성 측정방법 및 사용균주

항균활성 측정에는 그람 양성균인

Bacillus subtilis KCTC 1021

과그람음성균인

Escherichia coli D31 (

미국

North Caro- lina

^{주립대수의과대학}

Noga

^{교수가제공}

)

^{을사용하였다}

.

^활 성측정방법으로는서로다른농도를포함한두층의배지를 사용하는

ultrasensitive radial diffusion assay (URDA)

^법을이 용하였다

(Lehrer at al., 1991).

^{항균활성측정에사용된균주는} 우선

tryptic soy broth (TSB)

에접종한후

18

시간동안

37℃

에서

pre-culture

^{를 수행한후}

colorimeter (Product No. 52- 1210, BioMerieux, Inc., USA)

를사용하여균농도를

84%T (≒ 1×10

⁸

CFU/mL)

^{가되도록조정하였다}

.

^그후

, 9.5 mL

^의

0.03% TSB, 1% TypeⅠ agarose

^및

10 mM phosphate buffer (PB) (pH 6.5)

를포함하는

underlay gel

에각각의농도로희석 된균액

0.5 mL

^{를넣고잘섞은후에}

plate

^{에편평하게부어굳} 혔다

.

굳은

plate

에

punch

를사용하여직경

2.5 mm

의

well

을뚫

은후에

5 μL

^{의각추출물또는정제단계의분획물을도입시켰}

다

.

^{추출물또는분획물이배지에스며들면}

3

^시간동안

37℃

^에 서

1

차배양한후

,

그위에

10 mL

의

6% TSB, 1% TypeⅠ aga-

rose

^및

10 mM phosphate buffer (pH 6.5)

^{를포함하는}

overlay

gel

을붓고굳힌후에동일한온도에서

18

시간동안

2

차배양하 였다

.

^다음날

well

^{주위에생긴}

clear zone

^{의크기를측정하여} 항균활성을확인하였다

.

^{항균활성측정동안}

positive control

^로 는미국산잡종농어

(Morone saxatilis×Morone chrysops)

의

mast cell

^{에서정제된항균펩타이드인}

piscidin 1

^{을사용하였고}

negative control

로는

1% acetic acid

또는

0.01% acetic acid

를

사용하였다

(Silphaduang and Noga, 2001).

Protease 처리에 의한 단백질성 확인

추출물또는정제된항균물질의단백질성확인을위해서

tryp- sin

처리전

·

후의항균활성변화를확인하였다

.

바지락추출물 또는정제된물질

4 μL

^에

trypsin (1,000 μg/mL) 1 μL

^를첨가 하고

37℃

^에서

60

^{분간반응시킨뒤}

, URDA

^법으로

B. subtilis

KCTC1021

에대한항균활성변화를측정하였다

.

Hemolysis

추출물에존재하는독성물질의유무를확인하기위해서인간 의적혈구에대한용혈활성을측정하였다

(Seo et al., 2014).

^사 람의혈액

(Blood type: B)

^에동량의

phosphate buffered saline (PBS, 50 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4)

을넣 고혼합한후

800 rpm

^에서

15

^{분간원심분리하여상등액은버} 리고침전물을얻었다

.

이러한세척과정을

3

회반복한후얻어 진적혈구를

1%

^{혼합용액이되도록}

PBS

^{를첨가한후사용하} 였다

.

^{얻어진적혈구}

90 μL

^를

96-well microplate

^{에도입시키} 고바지락추출물또는정제물질

10 μL

를첨가한다음

37℃

에 서

60

^{분간반응시켰다}

.

^{이후반응액을원심분리}

(1,500 rpm, 10

분

, 4℃)

하여얻어진상등액

80 μL

를새로운

microtiter plate

로 옮긴후헤모글로빈유출정도를확인하기위해서

490 nm

^에서 흡광도를측정하였다

.

^적혈구의

100%

^{용혈을위한비교물질로} 는

triton X-100 (0.1%)

을사용하였다

.

Acid-Urea PAGE와 bug-blot

바지락추출물내의양이온성단백질

/

펩타이드의조성분포와 활성

band

^{를확인하기위해서}

acid-urea PAGE

^와

bug-blot

^을

E. coli D31

^{에대해서수행하였다}

(Seo et al., 2005). Bug-blot

^에 사용된

E. coli D31

은

TSB

에서

37℃

로

18

시간동안배양한후

colorimeter (Product No. 52-1210, BioMerieux, Inc., USA)

^를사 용하여균농도를

84%T (≒ 1×10

⁸

CFU/mL)

가되게조정하 였다

.

^그후

, 9.5 mL

^의

LB, 1% TypeⅠ agarose, 10 mM phos- phate buffer (PB) (pH 6.7)

^및

NaCl

^{를포함하는}

gel

^{에희석된균} 액

0.5 mL

를넣고잘섞은후에

plate

에편평하게부어굳혔다

.

AU-PAGE

^를위한

gel

^은

urea 3.6 g, D.W 3.4 mL, 30% acryl- amide/1.6% bis-acrylamide solution 5 mL, glacial HAc 0.65 mL

^{를비커에넣고}

stirring (10min, RT)

^과

degassing (20 min, RT, desiccator)

^을한후

TEMED 0.06 mL, 10% APS 0.275 mL

를첨가한후

stirring (1 min, RT)

하고

, gel

액을붓고유출 유무를확인한뒤

comb

^{를꽂은후충분히실온에서굳혔다}

.

^이 후장치에

5% HAc

를붓고

pre-run (150 v, 60 min, RT)

을하 였다

. Well

^{에도입할각시료는}

20 µL

^의

2×sample buffer

^와

1:1(v/v)

^{로혼합해서사용하였고}

, standard

^는

histone H1 (～21 kDa), lysozyme (～11 kDa), aprotinin (～6.5 kDa)

및

piscidin 1 (～2.5 kDa)

^{을포함하는}

20 µL

^의

0.01% HAc

^와

2×Sample buffer

를

1:1 (v/v)

로혼합해서사용하였다

. Pre-run

이끝난후

running buffer (5% HAC)

^{를교체하고}

well

^{에시료를도입시} 킨후전기영동을실시하였다

(150 v, 45 min).

전기영동후

, 1

개의

gel

^은

CBB R-250

^{으로염색시켰고}

,

^나머지

1

^개의

gel

^을

rinse buffer (10 mM PB buffer, pH 7.4)

로

2

회세척을한후에

E. coli D31

을포함하는

LB plate

^에

overlay

^시킨후

37℃

^에서

3

^{시간배양하였다}

.

^배양후에

overlay

^시켰던

gel

^{을제거한후에}

LB plate

는동일한온도에서

18

시간동안

2

차배양하였다

.

다음 날

LB plate

^에나타난

clear zone

^{을염색및탈색된}

gel

^의

band

결과와비교하였다

.

추출물들의 cytoplasmic membrane permeabili- zatin assay

바지락추출물의세균내막투과성측정을위해서

nonmem-

brane-permeative chromogenic substrate

^인

o-nitrophenyl-β- D-galactopyranoside (ONPG)

에대한추출물도입후의

E. coli ML35p

^{의세포질에서유출된}

β-galactosidase

^{의활성을확인하} 는실험을수행하였다

(Skerlavaj et al., 1990).

^배양된

mid-log phase

의

E. coli ML35p

를

10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4)

^{로세척을한후}

, 1.5 mM

^의

ONPG

^{를포함하는동일}

butter

에용해시켰다

.

그후

,

측정할추출물들을첨가한뒤

37℃

에서

60

^{분간배양하면서}

10

^{분간격으로유출된}

β-galactosidase

에의한

ONPG

^의

o-nitrophenol

^{로의가수분해정도를}

405 nm

에서측정하였다

.

막투과활성측정의표준물질로는강한막투 과성을포함하는것으로알려진항균펩타이드인

piscidin 1

^을 사용하였다

.

DNA Binding Assay

바지락추출물에존재하는염기성의

DNA

^{결합성물질의존}

재유무를확인하기위해서

DNA binding

에의한

DNA band

들 의

agarose gel-electrophoresis

^{에서의이동의저해정도를확인} 하는

DNA-binding assay

를수행하였다

(Hsu et al., 2003; Al- fred et al., 2013).

^{이를위해서}

1 kb DNA marker (λ-HindIII- digested DNA, 50 ng)

^{와추출물을혼합해서}

37℃

^에서

60

^분동 안반응시킨후

0.5 μg/mL EtBr

을포함하는

1.4% agarose gel

에서전기영동을수행한후

DNA-binding

^{정도를확인하였다}

. 항균활성물질의 분리 및 정제

아가미추출물에존재하는 항균물질의분리 및정제과정은

HPLC (YL9100 HPLC system, Young Lin Instrument Co.,

Korea)

를이용하여수행하였다

.

추출물에존재하는항균물질

의정제과정은역상및이온교환성을갖는

2

^{가지특성의}

HPLC

column

을사용하여수행되었고

,

정제과정중의분획들에대한

항균활성은

B. subtilis KCTC1021

에대해서

URDA

^법으로측 정하였다

.

^{첫번째정제과정으로}

CapCell-Pak C

₁₈

column (4.6

mm×250 mm, Shiseido, Japan)

을이용하여다음과같은조건 으로분리과정을수행하였다

. A

^용매는

0.1% Trifluoroacetic

acid (TFA)

를포함하는

H

₂

O (pH 2.2)

이며

B

용매는

0.1% TFA

140

서정길

를포함하는

100% CH

₃

CN (pH 2.2)

^{를사용하였다}

.

^분리조건 은

5%

에서

65%

까지

60

분간

B

용매를순차적으로증가시켰으 며

,

^유속은

1.0 mL/min,

^파장은

220 nm

^{에서확인하였고모든} 정제과정은실온에서수행되었다

.

항균활성을지닌분획들을 모아서

TSK-gel SP-5PW column (7.5 mm×75 mm, Tosoh,

Japan)

^{에도입시키고다음과같은조건으로분리과정을수행}

하였다

. A buffer

는

10 mM phosphate buffer (PB, pH 6.0)

이 며

B buffer

^는

1.0 M NaCl

^{을포함하는}

10 mM PB (pH 6.0)

를사용하였다

.

분리조건은

0%

에서

100%

까지

100

분동안

B buffer

^{를순차적으로증가시켰으며}

,

^유속은

1.0 mL/min,

^파장 은

220 nm

^{에서분리과정을수행하였다}

.

^{활성이확인된분획은}

CapCell-Pak C

₁₈

column (4.6 mm×250 mm)

에적용시켜다 음과같은조건으로최종분리과정을수행하여단일

peak

^를정 제하였다

. A

용매는

0.1 % TFA

를포함하는

H

₂

O (pH 2.2)

이며

B

^용매는

0.1% TFA

^{를포함하는}

100% CH

₃

CN (pH 2.2)

^를사 용하였다

.

^{분리조건은}

5%

^에서

45%

^까지

40

^분간

B

^{용매를순차} 적으로증가시켰으며

,

유속은

1.0 mL/min,

파장은

220 nm

에 서확인하였다

.

분자량 측정

최종정제된물질의분자량은

Ultraflex III matrix-assisted la- ser desorption ionisation time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometer (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)

를 사용하여

linear mode

^{로 측정하였다}

.

^{정제물질을}

0.1%

TFA/50% CH

₃

CN (1:1, v/v)

에녹인후

α-cyano-4- hydroxy- cinnamic acid (CHCA) matrix solution (10 mg/mL CHCA in 0.1% TFA/50% CH

₃

CN, 1:1, v/v)

^{과혼합하여}

MALDI plate

에도입한후에분자량을측정하였다

. Standard

로는

Calmix 2

를사용하였다

.

펩타이드 일차구조 분석

정제물의

N-terminal amino acid sequence

^는

pulse liquid au- tomatic sequencer (model 473A; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

를사용하여분석하였다

.

결과 및 고찰

바지락 추출물의 생리활성

바지락 추출물의 항균활성

바지락

(Manila clam, Ruditapes philippinarum)

^{으로부터채}

취한아가미와외투막조직들은

1% HAC

^{를이용한약산추출}

과정을수행하였으며

,

^{각추출물내의단백질성항균물질의존} 재유무를확인하기위하여각추출물

(4 μL)

의

trypsin

처리전

∙

후의항균활성변화를

URDA

^{법을이용하여}

B. subtilis

및

E.

coli D31

^{에대해서측정하였다}

(Fig. 1).

^실험결과

,

^{각추출물은}

B. subtilis

와

E. coli D31

에대해서강한항균활성을나타내었

으며

, trypsin

^{처리후에는항균활성이현저히감소되었다}

.

^이러 한결과는바지락추출물에단백질성항균물질이포함되어있 음을의미하는것이다

.

^{또한추출물또는균주간의활성비교} 에서는아가미추출물이외투막추출물보다는강한항균활성 을나타내었으며

, E. coli D31

보다

B. subtilis

에더욱효과적인 것으로나타났다

.

^{이러한결과를토대로바지락유래단백질성} 항균물질을정제하기위해서아가미추출물을연구과정에사 용하였다

.

Acid-urea PAGE와 bug-blot

바지락추출물내의염기성단백질

/

펩타이드의구성분포와그 들의항균활성유무를확인하기위해서

AU-PAGE

^와

bug-blot

를수행하였다

(Fig. 2).

^그결과

,

^{바지락추출물들은저분자물} 질보다는상대적으로고분자물질의농도가높게나타났으며

,

외투막추출물보다는아가미추출물에서구성물질들의다양성 이더높게나타났다

.

또한

,

추출물의항균활성은

slow migra- tion zone (SMZ) (～11 kDa)

^과

rapid migration zone (RMZ) (～2.5 kDa)

^{을포함하는두위치에서나타났으며}

, RMZ

^의항 균활성이

SMZ

보다는강하게나타났다

.

이러한결과는바지락 추출물에는다양한분자량의항균물질이존재하고있으며

,

^아 마도저분자의항균물질이보다중추적인역할을담당하는것 으로판단된다

.

바지락 추출물의 hemolysis

바지락추출물들에포함된독성물질의유무를확인하기위해 서추출물을인간적혈구

(

혈액형

: B

형

)

에대한용혈활성

(hemo- lytic activity)

^{을측정하였다}

(Fig. 3).

^{비교물질로는}

piscidin 1

^을 사용하였으며

100% hemolysis

^{의표준물질로는}

0.1% Triton-

X 100

^{을사용하였다}

.

^{측정결과대조군으로사용된항균펩타}

이드인

piscidin 1

^{은낮은농도}

(12.5 μg/mL)

^{에서도강한용혈활} 성을나타낸반면

,

바지락추출물들은용혈활성을거의나타내 지않았다

.

^{이러한결과는바지락추출물들은세포독성을나타} 내는물질을거의포함하고있지않다는것을의미하는것이다

.

Fig. 1. Antimicrobial activity of the crude extracts of the Manila clam Ruditapes philippinarum. Antimicrobial activity of gill or mantle extract (before) and trypsin treated extract (after) against B. subtilis KCTC1021 and E. coli D31. Scale bar indicates 5 mm.

B. subtilis

KCTC1021

E. coli D31

Before After Before After

Gill Mantle

: 5 mm

Histone H1 (~21 kDa)

Lysozyme (~11 kDa) Aprotinin (~6.5 kDa) Piscidin 1 (~2.5 kDa)

1 2 3

(A)

1 2 3

Histone H1 (~21 kDa)

Lysozyme (~11 kDa) Aprotinin (~6.5 kDa) Piscidin 1 (~2.5 kDa) (B)

1 2 3 4 5

1: λ-HindIII-digested DNA 2: Buffer without peptide 3: Gill

4: Mantle 5: Piscidin 1

(---) % CH

3

CN---

5 35 65

Absorbance at 220 nm

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0 0

Piscidin 1 0.01% HAc Gill Mantle

10 20 30

Time (min)

Fluorescence Intensity

40 50 60

0 10 20 30 40 50 60

Time (min)

: 5 mm

(A)

Absorbance at 220 nm

0 0 0.15 0.30

Time (min)

20 40 60 80 100

0

0.5 1.0

(---) NaCl (M)

: 5 mm

(B)

(---) % CH

3

CN

5 25 45

Absorbance at 220 nm

0 0.04 0.08 0.12 0.15

0 10 20 30 40

Time (min)

: 5 mm

(A)

Mass [m/z]

% Intensity

20 40 60 80

799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0

100 1.0E+4

[M+2H]²⁺

1286.9

0

(B)

[M+H]⁺ 2571.9

100

90 80 70 60 50 40 30 20 10

0 0

Gill Mantle Piscidin 1

10 20 30

Peptide concentration (μg/mL)

Hemolysis (%)

40 50 60 70 80 90 100

바지락 아가미 항균 펩타이드

141

바지락 추출물에 포함된 항균물질의 작용부위 확인 실험

바지락추출물에포함된항균물질의

target site

^{를예측하기위}

해서세균내막투과성과핵내구성물인

DNA

^{와의상호작용} 유무를관찰하였다

.

우선

,

항균물질의

target site

가핵내부의

DNA

^{인지를확인하기 위해서}

DNA-peptide interaction

^에의 한

DNA migration

저해현상을관찰할수있는

DNA-binding assay

^{를수행하였다}

(Fig. 4).

^그결과

,

^{양성대조군으로사용한}

piscidin 1

^은강한

DNA-binding

^{활성을나타낸반면바지락추} 출물들은

DNA migration

에전혀영향을주지않는것으로나 타났다

.

^{이러한결과는바지락추출물에존재하는항균물질은} 핵내의

DNA

와의상호작용에의해항균작용을나타내는것은 아님을의미하는것이다

.

^두번째로

,

^{추출물에포함된항균물질} 의

target site

^{가세포막자체인지를확인하기위해서}

membrane permeabilization assay

를 수행하였다

(Fig. 5).

실험결과양성 대조군으로사용한

piscidin 1

^{은강한내막투과성을나타낸반} 면음성대조군으로사용한

1% HAc

와측정에사용된바지락 추출물들은막투과활성을거의나타내지않았다

.

^{이것은실험}

에사용된

1% HAc

^{는막투과활성에거의영향이없음을나타}

내는것이므로바지락추출물들에는막투과활성물질이거의 포함하고있지않다는것을의미하는것이다

.

^{이러한결과는추} 출물내의항균물질의예상작용

target site

은막자체는아니라 는것을의미하는것이다

.

^{두가지의실험결과바지락추출물에} 포함된항균물질의작용기작은세포막을직접공격하거나핵 내부의

DNA

와의직접적인상호작용에의한것보다는세포표 면물질들과의상호작용또는세포질에존재하는세포내구성 성분에작용할가능성이있다는것을의미하는것이다

.

Fig. 2. AU-PAGE gel overlay assay of gill and mantle extract

against E. coli D31. (A) AU-PAGE run and stained with Coomass- ie Brilliant Blue R-250. Lane 1, molecular weight markers: 3 μg of human histone H1, 2 μg of human lysozyme, 1 μg of aprotinin, and 1 μg of piscidin 1, lane 2: 20 μL of gill extract, lane 3: 20 μL of mantle extract. (B) AU-PAGE gel overlay assay of gill and mantle extract against E. coli D31.

B. subtilis

KCTC1021

E. coli D31

Before After Before After

Gill Mantle

: 5 mm

Histone H1 (~21 kDa)

Lysozyme (~11 kDa) Aprotinin (~6.5 kDa) Piscidin 1 (~2.5 kDa)

1 2 3

(A)

1 2 3

Histone H1 (~21 kDa)

Lysozyme (~11 kDa) Aprotinin (~6.5 kDa) Piscidin 1 (~2.5 kDa) (B)

1 2 3 4 5

1: λ-HindIII-digested DNA 2: Buffer without peptide 3: Gill

4: Mantle 5: Piscidin 1

(---) % CH

3

CN---

5 35 65

Absorbance at 220 nm

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0 0

Piscidin 1 0.01% HAc Gill Mantle

10 20 30

Time (min)

Fluorescence Intensity

40 50 60

0 10 20 30 40 50 60

Time (min)

: 5 mm

(A)

Absorbance at 220 nm

0 0 0.15 0.30

Time (min)

20 40 60 80 100

0

0.5 1.0

(---) NaCl (M)

: 5 mm

(B)

(---) % CH

3

CN

5 25 45

Absorbance at 220 nm

0 0.04 0.08 0.12 0.15

0 10 20 30 40

Time (min)

: 5 mm

(A)

Mass [m/z]

% Intensity

20 40 60 80

799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0

100 1.0E+4

[M+2H]²⁺

1286.9

0

(B)

[M+H]⁺ 2571.9

100

90 80 70 60 50 40 30 20 10

0 0

Gill Mantle Piscidin 1

10 20 30

Peptide concentration (μg/mL)

Hemolysis (%)

40 50 60 70 80 90 100

Fig. 3. Hemolytic activities of gill or mantle extract and piscidin 1 against human erythrocytes (blood type: B).

B. subtilis

KCTC1021

E. coli D31

Before After Before After

Gill Mantle

: 5 mm

Histone H1 (~21 kDa)

Lysozyme (~11 kDa) Aprotinin (~6.5 kDa) Piscidin 1 (~2.5 kDa)

1 2 3

(A)

1 2 3

Histone H1 (~21 kDa)

Lysozyme (~11 kDa) Aprotinin (~6.5 kDa) Piscidin 1 (~2.5 kDa) (B)

1 2 3 4 5

1: λ-HindIII-digested DNA 2: Buffer without peptide 3: Gill

4: Mantle 5: Piscidin 1

(---) % CH

3

CN---

5 35 65

Absorbance at 220 nm

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0 0

Piscidin 1 0.01% HAc Gill Mantle

10 20 30

Time (min)

Fluorescence Intensity

40 50 60

0 10 20 30 40 50 60

Time (min)

: 5 mm

(A)

Absorbance at 220 nm

0 0

0.15 0.30

Time (min)

20 40 60 80 100

0

0.5 1.0

(---) NaCl (M)

: 5 mm

(B)

(---) % CH

3

CN

5 25 45

Absorbance at 220 nm

0 0.04 0.08 0.12 0.15

0 10 20 30 40

Time (min)

: 5 mm

(A)

Mass [m/z]

% Intensity

20 40 60 80

799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0

100 1.0E+4

[M+2H]²⁺

1286.9

0

(B)

[M+H]⁺ 2571.9

100

90 80 70 60 50 40 30 20 10

0 0

Gill Mantle Piscidin 1

10 20 30

Peptide concentration (μg/mL)

Hemolysis (%)

40 50 60 70 80 90 100

Fig. 4. Gel retardation analysis or the binding of gill or mantle extract to DNA. Binding of extract to DNA was assessed by mea- suring the retardation of commercial molecular weight marker λ-HindIII-digested DNA (50 ng) migration through an agarose gel.

Lane 1: λ-HindIII-digested DNA(50 ng), lane 2: negative control, 0.0.1% HAc, lane 3: gill extract, lane 4: mantle extract, lane 5:

positive control, piscidin 1 1 μg.

B. subtilis

KCTC1021

E. coli D31

: 5 mm

Histone H1 (~21 kDa)

Lysozyme (~11 kDa) Aprotinin (~6.5 kDa) Piscidin 1 (~2.5 kDa)

1 2 3

(A)

1 2 3

Histone H1 (~21 kDa)

Lysozyme (~11 kDa) Aprotinin (~6.5 kDa) Piscidin 1 (~2.5 kDa) (B)

1 2 3 4 5

1: λ-HindIII-digested DNA 2: Buffer without peptide 3: Gill

4: Mantle 5: Piscidin 1

(---) % CH

3

CN---

5 35 65

Absorbance at 220 nm

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

1.2

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0 0

Piscidin 1 0.01% HAc Gill Mantle

10 20 30

Time (min)

Fluorescence Intensity

40 50 60

0 10 20 30 40 50 60

Time (min)

: 5 mm

(A)

Absorbance at 220 nm

0 0

0.15 0.30

Time (min)

20 40 60 80 100

0

0.5 1.0

(---) NaCl (M)

: 5 mm

(B)

(---) % CH

3

CN

5 25 45

Absorbance at 220 nm

0 0.04 0.08 0.12 0.15

0 10 20 30 40

Time (min)

: 5 mm

(A)

Mass [m/z]

% Intensity

20 40 60 80

799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0

100 1.0E+4

[M+2H]²⁺

1286.9

0

(B)

[M+H]⁺ 2571.9

100

90 80 70 60 50 40 30 20 10

0 0

Gill Mantle Piscidin 1

10 20 30

Peptide concentration (μg/mL)

Hemolysis (%)

40 50 60 70 80 90 100