하는 학제간 연구분야라 할 수 있다. 현재까지 이러한 복합적인 측면에서의 접근이 잘 이루어지지 않았던 것이 실용화가 더딘 이유 중의 한 요인이라 생각된다.
이 분야는 직접 바이오매스 원료를 다루고 전통적 인 화학공정을 적용하기 때문에 어려운 점이 많고 화 려하게 보이지 않는 측면이 있다. 그러나 전처리는 바 이오매스로부터 에탄올을 비롯한 유용산물을 생물공
학적으로 생산하기 위해서는 반드시 거쳐 가야 하는 필수 요소공정이다. 아울러 [그림 9]에서 보는 바와 같이 현재까지 바이오에너지 생산공정에서 가장 비용 이 많이 드는 공정부분으로서 공정경제성(process enconmics)의 향상을 위해서도 이에 대한 많은 연구 개발이 이루어져만 새로운 획기적 계기가 있을 것이다.
Capital Recovery Charge Grid Electricity
Raw Materials
Total Plant Electricity Process Elect.
Fixed Costs
(0.20) (0.10) - 0.10 0.20 0.30 0.40
Utilities Storage Boiler/Turbogenerator
Wastewater Treatment Distillation and Solids
Recovery Cellulase
SSCF Pretreatment / Conditioning
Feed Handling
Biomass Feedstock 33%
5%
18%
12%
9%
10%
4%
4%
1%
Net 4%
(after ~10x cost reduction)
그림 9. 리그노셀룰로스로부터 에탄올 생산공정의 비용(단위 : US dollar, Biomass Refining CAFI).
진 용 수
성균관대학교 생명공학부 식품생명공학전공, [email protected]
서론
최근 급등한 유가와 범세계적인 친환경규제(CO
2규제)에 따른 바이오 연료에 대한 관심이 매우 지대 하다. 특히 바이오에탄올 생산관련 연구는 미국, 일본, 유럽연합 등 선진국들의 국가적 차원 연구뿐만 아니 라, BP, Dupont 등의 석유화학회사들도 활발하게 참 여하고 있다. 보다 안정적이고 지속적인 에너지원의
공급을 위해서는 그간의 원유편중의 에너지 수급보다 는 다변화된 대체 에너지원을 개발하는 것이 필요하 다고 하겠다. 이미 국내에서도 가정용 연료는 가스, 전 력생산용 연료는 원자력 등으로 대체 에너지원이 자 리를 잡아가고 있으나 수송용 연료의 경우는 아직 휘 발유와 경유 같은 석유 의존도가 매우 높은 실정이다.
바이오에탄올은 기존의 수송용 휘발유와 공동으로 사
용이 가능하므로 국내 에너지원 다변화에 큰 효과가 있을 것으로 사료된다. 이러한 상황은 비단 우리나라 에만 국한된 것이 아니어서 선진국, 특히 미국에서는 renewable biomass를 이용한 바이오에탄올의 생산도 급격히 증가하는 추세이다.
현재 바이오에탄올 생산에 사용되는 원료(기질)는 대부분이 곡류 유래의 전분이나 열대작물에서 얻어지 는 당류이다. 미국의 경우는 대부분이 옥수수 전분의 가수분해시 얻어지는 포도당을 원료로 하여 바이오에 탄올을 생산하고 있고 브라질의 경우에는 사탕수수에 서 얻어지는 설탕을 원료로 하여 바이오에탄올을 생 산하고 있다. 특히 브라질의 경우에는 풍부한 사탕수 수 자원을 이용한 바이오에탄올 생산이 상업화 되어 현재 소형자동차의 54%(2005년)가 바이오에탄올을 연료로 사용하고 있다. 하지만 사람이 식량으로 먹을 수 있는 농작물을 에너지원으로 쓰는 것은, 아직도 상 당수의 인류가 식량난으로 허덕이고 있는 시점에서 비판을 받고 있을 뿐더러 앞으로 급속히 증가하게 될 바이오에탄올의 수요를 충족시키지 못하기 때문에 근 본적인 한계를 지니고 있다고 하겠다. 따라서 기존 농 작물의 가식부분을 원료로 이용할 것이 아니라 인류 가 식량으로 이용하지 못할뿐더러 안정적인 바이오에 너지 원료원이 될 수 있는 목질계 자원을 활용한 바이 오에탄올 생산연구가 현재 많이 진행되고 있다.
자연계에 존재하는 섬유소 바이오매스를 효과적으 로 에탄올로 전환하는데 가장 장애가 되는 두 가지 요 소기술들은 다음과 같다. ① cellulose와 hemicellulose, 및 lignin으로 구성된 바이오매스를 효과적으로 depolymerize하여 발효 가능한 당류를 효율적으로 유 리시키는 기술, ② 바이오매스를 구성하는 당류인, 포 도당, 자일로스, 아라비노스 등의 다양한 당류를 발효 하여 에탄올을 생산하는 균주개량 기술이다. 본 고에 서는 후자의 전환기술에 관하여 보다 자세하게 최근 연구동향을 소개하고자 한다. 세부적으로는 크게 세 가지 방향에서의 균주개발 연구가 이루어지고 있는데, 첫째는 cellulose의 분해 및 발효를 동시에 수행하는
동시당화 발효를 위한 연구이며, 둘째는 섬유소 바이 오매스의 전처리후에 유리되는 다량의 오탄당을 발효 하는 균주 개발 연구이며, 셋째는 섬유소 바이오매스 의 전처리 과정에서 생산되는 발효저해제에 내성을 가지는 균주의 개발 연구이다.
Cellulose의 동시당화 발효를 위한 대사공학적 균주개발
목질계 유래 cellulose의 당화를 위해서는 많은 양의 효소가 전처리 과정에서 필요하게 되는데 이때 사용 되는 효소비용은 에탄올 생산비용의 상당한 부분을 차지하고 있다. 따라서 유전자 재조합 기술을 이용하 여 cellulase를 생산하는 미생물을 이용한 cellulose의 에탄올로의 one-step conversion 공정의 구현이 시도되 어 왔다. 소위 동시당화 발효공정(SSF, Simultaneous Saccharification and Fermentation)의 장점은 전처 리와 발효공정을 통합함으로서 비용의 감소를 기대할 수 있고, cellulose의 당화에 사용되는 대부분의 효소 가 product인 포도당에 의해서 product inhibition을 보이기 때문에 지속적으로 생산되는 포도당이 발효 균주에 의해서 에탄올로 전환됨으로서 지속적인 효소 의 가수분해능을 기대할 수 있다는 장점이 있다.
Cellulose의 포도당으로의 효과적인 가수분해를 위해
서는 endoglucanase, exoglucanase, beta-glucosidase
세 가지 효소의 작용이 필요하다. 대부분의 에탄올 발
효균주는 위의 효소들을 생산하지 못하기 때문에,
Trichoderma reesei, Clostridium thermocellum,
Kluyveromyces fragilis 등의 cellulose 가수분해 효소
유전자를 발효 균주에 도입하는 방법이 사용되고 있
다. 다양한 cellulase 효소를 발현하여 분비하는 재조
합 효모가 제조되어 cellulase를 기질로 생육하고 소량
의 에탄올을 생산하는 결과가 보고되고는 있지만 현
재까지 이러한 접근방법이 상업적으로 성공 가능한
정도에는 크게 미치지 못하고 있다.
섬유소 바이오매스 유래 당류의 효율적인 발효를 위한 균주개발
포도당이 주성분인 전분유래 가수분해물의 경우와 는 달리 섬유소 자원의 가수 분해물에는 여러 가지 당 류(포도당, 자일로스, arabinose)가 복합적으로 존재 하게 된다. 따라서 가수 분해물에 존재하는 모든 당을 효율적으로 발효할 수 있는 균주의 개발
이 매우 중요하다. 이외에도 상업적 바 이오에탄올 생산을 위한 균주는 에탄올 수율, 생산성, 그리고 생육특성에서 [표 1]과 같은 특성이 요구된다.
대부분의 자연계에 존재하는 에탄올 발효 세균 및 효모는 위에서 언급한 특 성들을 충분히 만족시키지 못하기 때문 에 유전자 재조합 기법을 이용한 대사공 학적 균주 개량 연구가 꾸준히 시도되어 왔다. 특히 혼합당 발효를 위해서 기존 에는 자연계에 존재하는 wild type 균주 인 Pichia stipitis, Candida shehatae 등 의 균주의 이용이 시도 되었으나, P.
stipitis로 대표되는 오탄당 발효균주는 포도당과 자일로스를 효과적으로 발효 하여 에탄올을 생산하는 반면, 발효속도 와 에탄올 내성측면에서 상업적인 이용 이 힘든 것으로 사료되고 있다. 따라서
대사공학을 이용하여 혼합당으로부터 에탄올을 생산 하는 재조합 균주의 개발이 세균 및 효모를 이용하여 다양하게 시도되어 왔다. 재조합 균주를 이용한 혼합 당 발효 연구는 크게 다음과 같이 세 가지 방향으로 진행되어 왔다[그림 1].
에탄올 수율(yield) 이론수율의 90% 이상(포도당의 경우 이론 수율은 0.51g ethanol/g glucose, 따라서 0.45g/g 이상)
에탄올 내성 40g/L 이상
에탄올 생산성(productivity) 1g ethanol/Lㆍh 이상
성장 및 발효를 위한 배지조건 값싼 배지조성성분에서 잘 자라며 발효능을 보여야 함.
전처리후 가수분해물에서의
전처리 시 발생하는 각종 inhibitors에 대한 내성을 보여야 함.
성장 및 발효
오염 방지를 위한 균주 생육특성 대용량 발효 시 오염방지를 위해서 낮은 pH와 또는 높은 온도에서 자라는 특성이 요구됨.
혼합당 발효능 포도당, 자일로스, 아라비노스 등의 육탄당 및 오탄당을 모두 발효할 수 있어야 함.
표 1. 바이오에탄올 생산을 위한 균주의 특성
균주특성 요구조건
Advantage:
Advantage:
Advantage:
Disadvantage:
Disadvantage:
Disadvantage:
폭넓은 당류의 발효, 빠른 발효속도(생산성)
높은 에탄올 수율 및 내성, 빠른 발효속도(생산성) 빈약한 에탄올 내성, 전처리 산물에 민감,
전처리 산물에 민감, (특히 Acetate)
높은 에탄올 수율 및 내성, 이미 상업적 에탄올 발효, 성능에 검증됨,
Xylitol이 부산물로 생성,
그림 1. 대사공학적 방법에 의한 혼합당 발효를 위한 재조합 균주의 개발 과 그 장단점 비교. Red color로 표시된 유전자는 대사능 향상을 위해서 도입된 유전자임.
재조합 대장균(Escherichia coli)을 이용한 대사공학 연구：wild-type 대장균을 이용할 수 있는 당류의 범 위(spectrum)는 매우 넓고 이미 재조합 단백질 생산 을 위한 대형발효 성공사례가 있다는 점에서 강점을 지니고 있으나, 소량의 에탄올을 생산하고 다량의 유 기산을 생성하는 문제점이 있다. 따라서 유전자 재조 합 기법을 이용하여 대장균의 유기산 생성 대사 경로 를 제거하고 에탄올 생성 경로의 활성화가 시도되었 다. 이를 위해서 Ingram 등은 효모와 Zymomonas mobilis와 같은 에탄올 발효 균주에서 발견되는 pyruvate decarboxylase(pdc)와 alcohol dehydrogenase (adh) 유전자의 과발현을 시도하여 80g/L의 자일로스 로부터 에탄올을 최종 농도 53~56g/L 및 0.72g/Lㆍh 의 생산성으로 균주를 개발하였다. 재조합 대장균에 의한 에탄올 생산은 포도당, 자일로스, 아라비노스 등 의 대부분의 목질계 자원 유래의 당류를 발효할 수 에 탄올 발효 속도가 매우 월등(50g/L의 자일로스를 16 시간 이내에 발효가능)하다는 장점을 지닌다. 하지만 대장균의 특성상 발효조 내에 생산되는 에탄올에 저 항성을 가지지 못하기 때문에 고농도 에탄올 생산공 정(>60g/L)의 구현이 어렵다는 단점과 재조합 대장 균의 생육이 전처리후에 생성되는 aldehyde 및 organic acid와 같은 inhibitory 물질에 매우 민감하다 는 단점이 있다.
재조합 Zymomonas mobilis를 이용한 연구：
Zymomonas mobilis는 Gram 양성세균으로서 고농 도의 에탄올(~120g/L)을 빠른 시간 생성하는 특성 을 가지고 있으며, GRAS(generally regarded as safe)로 인정된다는 면에서 대용량 에탄올 발효를 위 한 균주로 적합하다고 하겠다. 특히 Zymomonas 균 주는 EMP 대사 경로를 사용하는 다른 에탄올 생성 균주와는 달리, ED(Entner-Doudoroff) 대사경로를 이용하여 당을 대사한다. 그 결과 혐기적 조건에서 포 도당 한분자의 ATP 만을(EMP 경로의 경우 2분자 의 ATP 생성) 생성함으로서 세포의 생육은 감소하
고 에탄올의 생성은 촉진되는 대사능을 보이는 우수 한 에탄올 생성균주이다. 하지만 대장균과 같이 다양 한 당류를 발효하지 못하는 단점을 지니고 있다. 따라 서 자일로스 발효능이 없는 Z. mobilis에 대사공학적 으로 자일로스 발효 경로를 도입하여 포도당과 자일 로스를 모두 발효하여 에탄올을 생산하는 재조합 균 주의 개발이 미국의 NREL(National Renewable Energy Laboratory)의 연구진에서 의해 시도되었다.
이를 위해서 대장균의 자일로스 발효경로를 담당하는 효소인 xylose isomerase(xylA), xylulose kinase (xylB), transketolase(tktA), 및 transaldolase(talB) 유전자가 Z. mobilis에 도입되었다. 또한 도입된 외래 유전자들의 안정적인 발현을 위해서 이들 유전자들의 Z. mobilis의 유전체 상에 삽입되었다. 이와 같이 만들 어진 재조합 균주는 매우 빠른 발효 속도 그리고 포도 당과 자일로스를 모두 발효한다는 면에서 매우 우수 한 특성을 지닌다고 하겠지만, 재조합 Z. mobilis가 당 가수분해를 위한 전처리 과정에서 상당량 발생하는 acetic acid에 대한 저항성이 매우 약하다는 치명적인 단점을 지니고 있다. 따라서 현재 연구는 재조합 Z.
mobilis 균주의 acetic acid 저항성을 증대시키는 방향 으로 진행되고 있다.
재조합 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 연구：
S. cerevisiae는 전통적으로 에탄올 발효 및 알콜 함유
식품의 제조에 오랜 기간 이용되어 왔으며, 이미 전분
및 당류 유래 자원을 이용한 바이오에탄올 생산에 이
용되어 상업적인 가능성을 검증받은 균주이다. 하지
만, S. cerevisiae는 자일로스를 발효하지 못하는 약점
을 지니고 있다. S. cerevisiae는 자일로스를 발효하지
못하지만, 그 이성체인 xylulose를 발효하여 에탄올을
생산할 수 있다. 이러한 사실에 근거하여 자일로스를
xylulose로 전환시키는 효소인 xylose isomerase를 대
장균으로부터 분리하여 S. cerevisiae에 도입하여 자
일로스를 발효하려는 많은 연구가 이루어 졌지만, 세
균 유래의 xylose isomerase가 S. cerevisiae에서 활성
발현이 되지 않으므로 성공하지 못하였다. 또 다른 접 근방법으로 자연계에 존재하는 대표적인 자일로스 발 효 효모인 Pichia stipitis로부터 자일로스 xylulose로 전환시키는 효소인 xylose reductase(XR), xylitol dehydrogenase(XDH) 및 xylulokinase (XK)의 유전 자들(XYL1, XYL2 및 XYL3)을 S. cerevisiae에 도 입함으로써 자일로스를 발효하는 재조합 S. cerevisiae 를 구축하려는 연구가 수행되었다. 이러한 연구는 부 분적으로 성공적이어서 XYL1, XYL2 및 XYL3가 발현되는 재조합 S. cerevisiae는 자일로스를 발효하 여 에 탄 올 을 생 산 할 수 있 었 다 . 하 지 만 , XR/XDH/XK를 이용한 재조합 S. cerevisiae의 자일 로스 발효는 그 속도가 포도당에 비해서 매우 느리고 다량의 xylitol이 부산물로 생산됨으로 인하여 에탄올 수율이 현저히 낮다는 문제점이 대두되었다. 최근에 는 혐기곰팡이에서 유래한 xylose isomerase를 S.
cerevisiae에 도입하고 활성 발현시킴으로서 부산물인 xylitol의 생성없이 고효율로 자일로스를 에탄올로 전 환하는 균주의 개발이 보고되고 있다. 또한 corn stover 가수분해물에 다량 존재하는 아라비노스를 발 효하여 에탄올을 생산하는 재조합 균주가 보고되고 있다. 효모내에 세균에 존재하는 아라비노스 대사경 로를 구성하는 효소인, arabinose isomerase(araA), ribulokinase(araB) 및 ribulose-5-phosphate(araD) 를 도입함으로써 아라비노스를 대사하여 에탄올을 생 산하는 균주의 제작이 가능하다. 최근에는 이와같이 제작된 균주에 evolutionary engineering 접근방법을
통한 개량을 통해서 0.43g/g의 수율과 0.29g/g cellㆍ hour의 생산성으로 아라비노스를 에탄올로 전환하는 균주가 제작되기도 하였다.
섬유소 바이오매스의 전처리 과정에서 생산되는 발효저해제에 내성을 가지는 균주의 개발
발효가능한 당류를 분리하기 위한 바이오매스의 전 처리 과정에서 부산물로 생산되는 furfural 및 5- hydroxylmethylfurfual 발효저해 물질은 미생물균주 의 생육에 나쁜 영향을 미쳐서 에탄올 발효의 수율 및 생산성을 저해한다. 현재로서는 이러한 발효저해제에 내성을 부여하는 정확한 기작의 이해를 바탕으로한 rational 균주 개량 전략보다는 미생물 균주를 장시간 (continuous culture 등을 통해서) 발효저해제에 노출 시키고 내성을 획득한 돌연변이 균주를 선별하는 소 위 evolutionary engineering 전략이 많이 사용되어 왔다. 최근에는 이와 같이 얻어진 내성균주의 유전체 수준의 발현 분석을 통해서 내성을 부여하는 유전자 및 네트워크를 발굴하려는 연구가 수행되고 있다.
개량된 균주의 성능 및 전망
문헌에 보고된 wild type 및 재조합 균주의 목질계 hydrolyzate를 이용한 에탄올 발효능을 비교하면 다 음의 [표 2]와 같다.
현재로서는 어떠한 재조합 균주가 앞으로 목질계 자원을 이용한 에탄올 생산에 상업적으로 이용될지는 예측하기 어렵지만, 성공적인 균주는 ① biomass의
E. coli KO11 Bagasse 0.49 0.37
E. coli KO11 Corn fiber 0.39~0.41 N/A
Z. mobilis 8b Corn stover 0.46 0.214
P. stipitis Wheat straw 0.41 0.44
S. cerevisiae 424A(LNF-ST) Corn stover 0.36 0.072
S. cerevisiae TMB3400 Corn stover 0.33 0.036
S. cerevisiae TMB3400 Spruce 0.43 0.25
표 2. 목질계 hydrolyzate를 이용한 wild type 및 재조합 균주의 에탄올 발효능 비교
균주 Hydrolyzate 에탄올 수율(Yield) Sp. productivity(g/g cellsㆍh)
가수분해 과정에서 생산되는 미생물 생육저해 물질에 저항성을 가지며, ② 에탄올 수율의 향상을 위해서 부 산물의 생산이 최소화되어야 하며, ③ 비생산성 (specific productivity)이 우수하며, ④ 생성된 에탄올 에 의한 생육 및 발효 저해를 받지 않아야 하며, ⑤ 대 량 생산공정에 적용하기 용이한 균주가 되어야 한다.
앞서 기술한 재조합 대장균, 재조합 Zymomonas, 재
조합 효모 모두 위의 조건을 모두 만족시키지는 못한 다. 하지만, 목질계 자원의 전처리 과정에서 생산되는 organic acids, furan derivatives, phenolic compounds 등의 많은 미생물 inhibitory compounds 들에 강한 내성을 보이고 이미 전분계 자원을 이용한 에탄올 생산에서 그 상업적 가능성을 선보인 recombinant S. cerevisiae가 유망할 것으로 사료된다.
박 영 훈
CJ(주), [email protected]
서언
바이오연료사업은 바이오매스 자원으로부터 바이 오에탄올, 바이오디젤 등 바이오연료를 생산, 공급하 는 사업으로 산업 바이오(industrial biotech)의 중요 한 부분 중 하나이다. 산업바이오 분야는 각각 레드 및 그린 바이오텍으로 알려진 의약과 농업관련 바이 오 기술과 함께 앞으로 도래할 바이오 경제를 이끌고 나갈 미래기술사업 분야이다. 좀 더 구체적으로 이야 기한다면, 옥수수, 콩, 사탕수수 등의 바이오매스 자원 을 원료로 사용하고 생명공학 기술을 이용하여 바이 오 기반 화학제품이나 바이오연료 등의 물질을 생산 하는 기술 분야이다. 기존에 잘 알려진 원유를 원료한 석유정제(petroleum refinery) 프로세스와의 유사성 에 빗대어 “바이오 리파이너리(biorefinery)”라고 불
리기도 한다[그림 1]. 이 기술은 친환경적이라는 점 이외에도 인류가 앞으로 닥칠 석유자원의 고갈 등에 대비하는 에너지기술 분야로서 반드시 확보되어야 하 는 기술이다. 당연히 이 분야에 있어서 절호의 사업 기회도 발견할 수 있으리라 판단됨은 두 말할 필요가 없다. 그러나 바이오연료의 사업 기회를 분석함에 있 어서는 자원 확보, 운송 및 물류, 마케팅 문제 등 다양 한 각도에서의 고려가 필요하며 정확한 정보가 확보 되어야 한다. 현재 우리나라에서는 많은 기업에서 이 분야에 관심을 갖고 준비작업을 진행 중이라고 알려 져 있다. 본 고에서는 우리나라에서의 바이오연료 사 업의 사업화 전략에 대해 부분적으로나마 고찰해 보 고자 한다.
석유자원 기반경제
전환 바이오매스 기반경제
식물자원
석유화학산업
석유연료
바이오연료 산업바이오
포도당
납사 석유화학 기초원료
1차 대사산물
고분자 합성수지 화합물 및 화학제품 기능성소재 등
그림 1. 석유기반 화학산업과 산업바이오 비교.
