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Isolation, Culture and Cryopreservaion of Neural Stem Cell

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Academic year: 2021

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Nestin은 classVI중간형 세사(intermadiatefilament)로서 신경 줄기 세 포의 특이적인 표지인자로 알려져 있으며,4개의 exon과 3개의 intron의 유전자로 구성되어 있다.Nestin유전자의 잘 보존된 두 번째 intron인 3’ 방향의 637bp는 신경 발생 과정 중 nestin의 발현을 조절하기에 충분하 다고 알려져 있다.

본 연구에서는 신경줄기세포의 특이적인 표지자인 nestin이 rat 2nd intron에 의해 조절 받는 nestin과 GFP(green fluorescenceprotein)가 동 시에 발현되는 형질 도입된 마우스로부터 신경줄기세포를 분리하여 배양 하였다. 이렇게 배양된 세포는 신경줄기세포의 특징인 신경구 (neurosphere)를 형성하였으며,GFP를 발현하고 있었다.배양된 신경구는 단일세포로 분리하여,유세포 분석기를 통해 GFP(+)와 GFP(-)세포로 분 리하여 배양하였을 때,세포는 각각 2차 신경구를 형성하였다.GFP(+)와 GFP(-)신경구를 각각 분화 조건에서 배양하였을 때,GFP(+)신경구의 경우 신경세포(neuron)와 신경아교세포(astrocyte),그리고 희돌기교세포 (oligodendrocyte)로 분화 되었지만,GFP(-)신경구의 경우는 희돌기교세 포(oligodendrocyte)로 분화되는 능력이 저해 되어 있었다.Fibronectin이 코팅된 조건에서 배양된 신경줄기세포는 신경구를 형성하는 비율이 감소 되며,평평한 모양으로 자랐으며,GFP(+)세포는 그 수가 증가되고 있음을 확인하였다.사람으로부터 얻어진 신경줄기세포를 배양하기 위해 임신 1 0~15주의 중절된 사람 태아의 대뇌조직에서 신경줄기세포를 얻어 배양하 였다.배양된 세포는 신경구를 형성하였으며,면역형광염색 결과 nestin을

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발현하고 있었고,분화시켰을 때,신경세포와 신경아교세포로 분화되었다. 사람 대뇌의 조직이나 신경구를 냉동보관 후 녹였을 때,신경줄기세포의 성격을 그대로 유지하는지 알아보고자 잘게 조각낸 태아의 대뇌조직과 배 양된 신경구를 냉동 보관하였다.냉동보관된 조직과 신경구를 신속히 해 동하여 배양하였고,해동된 조직과 신경구 모두에서 배양 7일째에 다시 신경구를 형성하였다.면역형광염색을 통해 확인한 결과 nestin을 발현하 고 있었고,분화 조건으로 배양하였을 때,신경세포(neuron),신경아교세 포(astrocyte)로 분화됨을 확인하였다. 핵심단어 :Nestin,신경줄기세포,신경구,냉동보존,세포치료제

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국문요약 ···i 차례 ···iii 그림차례 ···iv I.서론 ···1 II.재료 및 방법 ···3 A.재료 ···3 B.실험방법 ···4 1.배양 배지의 제조 ···4 2.신경 줄기 세포의 배양 및 계대 배양 ···4 3.형질 전환 마우스의 GFP(+)세포와 GFP(-)세포의 분리 배양 ···6 4.신경줄기세포의 분화 ···6 5.분화된 세포의 면역형광염색 ···7 6.Fibronectin코팅 배양 및 세포수 측정 ···8 7.사람 신경줄기세포 신경구의 면역형광염색 ···8 III.결과 ···10 IV.고찰 ···27 V.결론 ···33 참고문헌 ···34 영문요약 ···39 별첨자료 1)줄기세포의 추출이 가능한 조직의 공여 동의서 ···41 별첨자료 2)인간 줄기세포 연구관리지침 ···43

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Fig.1.Neuralstem cellsinE12.5embryosandneurospheres···11

Fig.2.LossofGFP inlongterm culturedneurospheres···13

Fig.3.SelectioncultureofGFP(+)and(-)NSC byFACS.···14

Fig.4.GFP(-)neurosphereswerereducedindifferentiationpotential···14

Fig.5.SelectionofGFP(+)and(-)cellsbyClonalselection···15

Fig.6.EnrichmentofNSCsbyfibronectinwithbFGF···17

Fig.7.FibronectininducedproliferationofGFP(+)neuralstem cells ···18

Fig.8. Humanfetalbrainderivedneuralstem cellformed neurospheres···22

Fig.9. Immunocytochemicalanalysisofneurospheresderivedfrom humanfetalbrain···23

Fig.10.Differentiationofneuospheresdereivedfrom freshand frozentissue,frozenneurospheres···24

Fig.11.Differnetiationofneurospherederivedfrom notfrozen,thawedtissue andfrozenneurosphere···25

Fig.12.Maintainofproliferationanddifferentiationpotentialafter longterm cryopreservation···26

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서 론

신경 줄기 세포는 중추신경계에서 유래되어 자기 증식 능력을 가지고 있으면서,분화된 세포의 특성을 가지지 않으며,신경계의 여러 가지 세포 로 분화 할 수 있는 능력을 가진 세포이다(Gage등,2000).이러한 신경 줄기 세포는 시험관에서 무혈청 배지에 성장 인자를 넣어주는 방법으로 배양 할 수 있다.배양중인 신경 줄기 세포의 가장 큰 특징은 세포가 자 유롭게 떠다니는 세포 덩어리 형태의 신경구를 만들면서,증식하는 것이 다(Reynolds 등,1992;Reynolds와 Weiss,1996; Svendsen 등,1997; Vescovi등,1999;Ostenfeld등,2002).이러한 신경구는 마우스와 사람 태 아 뇌조직에서 얻어진 신경 줄기 세포에서 배양한 바가 있다.그리고 성 체의 신경줄기세포에서도 신경줄기세가 배양되었다(Wachs등,2003).또 한,신경 줄기 세포는 시험관에서 성장인자인 EGF와 bFGF가 들어있는 조건에서 2년 이상 유지하고, 배양할 수 있다(Svendsen 등, 1997; Reynolds와 Weiss,1999).신경 줄기 세포를 치료제로서 동물 모델을 이 용한 파킨스씨병 등에 적용했을 때,신경계 기능의 회복을 확인하였다 (Bjorklund와 Lindvall,2000).

Nestin은 classVI중간형 세사 단백질로서 신경 줄기 세포의 대표적 인 마커로 알려져 있으며,신경줄기세포가 분화함에 따라 억제가 되기 때 문에 신경전구세포에서 분화의 지표로 사용될 수 있다(Zimmerman 등, 1994;Dahlstrand등,1995; Lendahl등,1997;Lothian등,1999).Nestin 유전자는 4개의 exon과 3개의 intron으로 구성되어 있으며,두 번째 intron은 신경발생과정에서 nestin 유전자의 발현을 조절하는 enhancer의 역할을 한다고 알려져 있다.Nestin 유전자의 두 번째 intron은 여러 종 사이에서 진화적으로 잘 보전되어 있는데,특히 전체 1852bp중에서 가장

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잘 보존되어 있는 637bp는 신경발생과정 중 nestin의 발현을 조절하기에 충분하다고 알려져 있다(Lothian과 Lendahl,1997; Lothian 등,1999; Hallbergson 등,2003).이러한 두 번째 intron의 역할을 시각적으로 쉽게 관찰하기 위한 Yamaguchi등의 연구에서는 nestin의 promoter에 의해 발 현이 유도되는 nestin 유전자가 발현될 때, GFP(green fluorescein protein)가 동시에 발현하는 형질전환 마우스를 만들어 nestin 유전자 발 현을 시각화 시킨 바가 있다(Yamaguchi등,2000;Kwaguchi등,2001). 신경줄기세포는 세포 치료제로서 대량으로 배양을 할 수 있고,이식 치료에 곧바로 이용될 수 있다.하지만,세포 치료제로서 신경 줄기 세포 를 이용하기 위해서는 재료인 태아의 뇌조직이나 배양된 신경구가 빠른 시간 안에 준비가 되어야 하며,많은 양이 요구되는 등 여러 가지 제약이 따른다.따라서 얻어진 뇌조직이나 대량 배양된 신경구를 냉동 보존하고, 이를 원하는 시기에 즉시 해동하여 치료에 이용할 수 있는 조건의 확립이 필요하다.

본 연구는 nestin 유전자 enhancer의 2번째 intron과 GFP가 동시에 발현하는 형질전환된 마우스에서 신경줄기세포를 분리하여 배양하고,신 경줄기세포의 GFP의 발현을 관찰하였다.그리고 세포를 유세포분석기를 통해 GFP(+)세포와 GFP(-)세포를 분리하여 배양하고,각각의 분화능력을 비교하였으며,단일클론선택을 통해 단일세포로부터 배양된 신경구의 분 화능력을 비교 관찰하였다. 사람 신경줄기세포의 분리와 배양 및 냉동보존 방법을 확립하기 위하 여,사람 태아 뇌조직에서 신경줄기세포를 분리하고 배양하였고,분리된 세포는 증식하여 신경구를 형성하였다.또한 태아 뇌조직과 배양된 신경 구를 냉동 보존하고,이를 다시 해동하여 신경 줄기 세포를 배양 하였을 때,신경 줄기 세포의 특성을 그대로 유지하고 있는지 조사하였다.

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재료

료 및

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방법

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AA...재재재 료료료

Nestin promoter-GFP 형질전환 마우스는 Dr.YamaguchiM.(Tokyo Univisity,Tokyo,Japan)로부터,공여 받아 실험에 사용하였다.사람 태아 신경줄기세포의 배양을 위해서 아주대학교 병원 산부인과에서 산모치료를 위해 유산된 태아를 보호자 동의하에 제공 받아 아주대학교 의료원의 임 상심사위원회(InstitutionReview Board,IRB)의 승인을 얻는 절차에 따라 태아를 확보했다.

세포배양에 이용된 NeurobasalTM medium과 N2 supplement, B27

supplement, Dulbeco's Modified Eagle's Medium(DMEM), DMEM:F12(1:1)medium,Hank'sBalancedSaltSolution(HBSS),0.25% trypsin (EDTA free), antibiotic-antimycotic, 200 mM Glutamine은 Gibco-BRL사 (Grand Island,NY,U.S.A.)에서 구입하였고,DNase I은 Roche사(Mannheim, Germany)의 제품을 사용하였다. Leukemia Inhibitory Factor(LIF)는 Chemicon사(Temecula, CA, USA )에서, Gentamycine과 Epidermal Growth Factor(EGF)는 sigma사 (St.louis, MO,U.S.A),그리고,BasicFibroblastGrowthFactor(bFGF)는 동아 제 약에서 각각 구입하여 사용하였다. 면역형광염색법에 사용된 항체인 mouse anti-nestin(:human specific)항체와 anti-mouse nestin 항체는 Chemicon(Temecula,CA,U.S.A)에서 구입하였고,anti-glial fibrillary acidicprotein (GFAP)과 anti-CNPase는 Sigma사에서,anti-beta-tubulin III(Tuj-1)과 , anti-galactocerebroside(Gal-C)는 각각 BAbCO사 (Richmond,CA,U.S.A)와 Roshe사(Mannheim,Germany)에서 각각 구입 하였다. 형광현미경은 Olympus사(Japan)의 기기를, 유세포분석기

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(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)는 Becton Dickinson사 (Franklin Lakes,NJUSA)의 기기를 이용하였다.기타 실험재료들은 분 자생물학적 등급의 시약을 사용하였다. B BB...실실실험험험 방방방법법법 1.배양 배지의 제조 마우스 신경줄기세포의 배양을 위하여 500ml의 DMEM/F12(1:1)배 지에 5ml의 N2supplement를 넣고,오염을 방지하기 위하여,20㎍/ml 의 gentamycin과 100U/ml의 antibiotic-antimycotic을 넣은 배지를 준비 했다.사람 신경줄기세포를 배양하기 위하여 NeurobasalTM 배지에 10ml

의 B27 supplement를 넣고, 2 mM/ml의 glutamine과 20 ㎍/ml의 gentamycin,100U/ml의 antibiotic-antimycotic을 넣은 배지를 이용했다. 2.신경 줄기 세포의 배양 및 계대 배양 발생 12.5일 된 Nestin promoter-GFP 형질전환 마우스의 전뇌부분 을 얻어서 뇌막을 완전히 제거했다.준비된 조직에 10㎍/㎖의 DNaseI과 0.025% trypsin을 처리하고,상온에서 5분간 반응시켰다.여기에 10ml의 10% FBS가 포함된 DMEM을 넣어 trypsin 활성을 저해한 후,110×g로 10분간 원심분리 하였다.이후 상층액을 제거하고,HBSS로 씻어준 후 피 펫을 이용하여 조직을 잘 풀어주어 단일세포를 얻었다.얻어진 세포는 N2 supplement가 포함된 DMEM/F12배지에 105cells/ml의 밀도로 배양 접

시에 옮겨준 뒤,bFGF와 EGF를 20 ng/㎖의 농도로 처리해 주고, 2일 마다 새로운 배지로 교체하며 배양하였다.배양된 신경구는 5~7일 마다 0.025% trypsin을 처리하여 단일세포로 만들어 준 뒤,105cells/ml의 밀도

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로 계대 배양 하였다.

사람 태아의 신경줄기세포를 배양하기 위하여 확보된 임신 10~15주 태아의 대뇌 부분을 얻어낸 후,뇌막을 제거했다.얻어진 뇌조직을 메스를 사용하여 잘게 조각내고,HBSS로 씻어냈다.세척된 뇌조직은 10㎍/㎖의 DNase I이 포함된 0.025% trypsin에서 5분간 반응시켰고,10ml의 10% FBS가 포함된 DMEM을 넣어 trysin의 활성을 저해한 후,110×g로 10분 간 원심분리 하였다.이후 상층액을 제거하고,HBSS로 씻어준 후 피펫을 이용하여 조직을 잘 풀어주어 단일세포를 얻어내었다.이 세포를 HBSS로 다시 한 번 씻어준 뒤,B27supplement가 포함된 neurobasal배지에 105

cell/ml의 밀도로 희석하여 배양 접시에 옮겼다.그리고 성장인자인 10 ng/ml의 LIF와 20ng/ml의 bFGF와 EGF를 첨가한 후,5%의 이산화탄소 가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였고,새로운 배지로 매3일 마다 교 체해 주었다. 배양된 사람 신경줄기세포의 계대배양을 위해 7~10일간 배양된 신경 줄기 세포는 110×g로 원심 분리하여 신경구를 얻어낸 후,이를 HBSS로 씻어주고,0.025%의 trypsin과 10㎍/㎖의 DNaseI을 넣고 상온에서 5분 간 반응시킨 후,10ml의 10% FBS가 포함된 DMEM을 넣어 trysin의 활 성을 저해한 후,110×g로 10분간 원심분리 하였다.이후 상층액을 제거하 고,HBSS로 씻어준 후 피펫을 이용하여 세포를 풀어 주고,105cell/ml 밀도로 희석하여 계대 배양 하였다. 사람 신경줄기세포의 냉동보관을 위하여 뇌조직과 배양된 신경구를 HBSS로 세척하고, 10%의 dimethylsulfoxide(DMSO)가 포함된 Neurobasal배지를 넣고 냉동보관튜브에 옮겨 주었다.냉동보관튜브는 -70℃에서 16 시간 동안 냉동시킨 뒤,액체질소에서 2주 이상 보관하였 다.냉동보관 된 뇌조직과 신경구를 해동하기 위하여 액체질소에서 냉동

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보관튜브를 꺼내 37℃ 항온수조에서 신속히 녹였다.이를 HBSS로 2회 세 척하여 DMSO를 완전히 제거하고,B27supplement가 포함된 neurobasal 배지에 105cell/ml의 밀도로 희석하여 배양 접시에 옮겼다.여기에 성장

인자인 10ng/ml의 LIF와 20ng/ml의 bFGF와 EGF를 첨가해서 배양하 였고,새로운 배지를 매 3일마다 교체해 주었다.

3.형질전환 마우스의 GFP(+)세포와 GFP(-)세포의 분리 배양

유세포 분석기(FluorescenceActivatedCellSorter,FACS)를 이용해 서 GFP(+)세포와 GFP(-)세포를 분리해 내기 위하여,7일간 배양된 신경 구를 단일세포로 만들어 주고,N2supplement와 20ng/㎖의 bFGF,EGF 가 들어있는 배지에서 하루 동안 안정화 시켰다.세포는 104cells/ml

밀도로 N2supplement가 포함된 DMEM/F12배지에 희석한 후,FACS를 통해 GFP(+)세포와 GFP(-)세포를 분리 하였다.분리된 세포는 10ml 의 HBSS로 세척한 후,N2supplement와 20ng/㎖의 bFGF,EGF가 들어 있는 배지에서 배양하였다.

GFP(+)세포와 GFP(-)세포의 단일클론선택을 위하여,7일간 배양된 신경구를 단일세포로 만들어 주고,N2 supplement와 20 ng/㎖의 bFGF, EGF가 들어있는 배지에서 하루 동안 안정화 시켰다.세포는 mini-well plate에 1cell/well의 밀도로 넣어주고,배양하였다.

4.신경줄기세포의 분화

신경줄기세포로부터 배양된 신경구를 분화시키기 위하여 10㎍/ml의 poly-L-ornithine을 커버슬립에 코팅하고,신경구를 1% FBS가 포함된 배 양 배지에서 2시간 동안 붙였다.형질전환된 마우스의 신경구는 성장인자 가 없고 N2supplement가 포함된 DMEM/F12배지에서 7일간 분화시켰

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고,새로운 배지는 매 3일 마다 교체해 주었다.사람 신경줄기세포의 분화 에는 B27 supplement가 포함된 neurobasal배지에서 7일간 분화시켰고, 새로운 배지는 매 3일 마다 교체해 주었다.

5.분화된 세포의 면역형광염색

커버슬립에서 7 일간 분화된 세포를 PBS로 2회 씻어준 후,4 %의 paraformaldehyde로 10분 동안 고정한 후 다시 PBS로 세척하였다.1% BSA와 5% horseserum,5% goatserum이 포함된 blocking solution 을 넣어준 후,4℃에서 16시간 동안 blocking하였다.

분화된 형질전환 마우스의 신경줄기세포를 면역형광염색 하기 위하여 일차 항체로 anti-galC(1:20)는 DMEM에 희석하여 37 ℃에서 16 시간 동안 반응시켰고, anti-β-tubuline III(1:500), anti-GFAP(1:200), anti-CNPase(1:1000)는 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다.반응이 끝난 세포는 0.03%의 triton X-100이 첨가된 PBS 용액(PBST)으로 세 번 세 척하고,이차 항체반응으로 fluoresceinanti-mouseIgG(1:200)으로 상온에 서 45분간 반응시키고,PBST 용액으로 세 번 세척하고,propidium iodide 로 5분간 반응시켜 대조염색을 했고,PBST 용액으로 세 번 세척한 후 형 광현미경을 통하여 관찰하였다.

분화된 사람 신경줄기세포의 면역형광염색을 위하여,커버슬립의 세 포를 PBS로 2회 씻어준 후,4%의 paraformaldehyde로 10분 동안 고정 한 후 다시 PBS로 세척하였다.1 % BSA와 5 % horse serum,5 % goatserum이 포함된 blocking solution을 넣어준 후,4℃에서 16 시간 동안 blocking하였다. 일차 항체로서 anti-β-tubulineIII(1:500), anti-GFAP(1:200)를 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후,tritonX-100이 첨가된 PBS 용액(PBST)으로 세 번 세척하였다. 이차 항체반응은

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fluorescein anti-mouse IgG(1:200)으로 상온에서 45분간 반응시키고, PBST 용액으로 세 번 세척하고,propidium iodide로 5분간 반응시켜 대 조염색을 했고,PBST 용액으로 세 번 세척한 후 형광현미경을 통하여 관 찰하였다.

6.Fibronectin코팅 배양 및 세포수의 측정

12wellplate에 10㎍/ml의 농도로 HBSS에 희석된 poly-L-ornithine 을 처리해 주고,37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다.반응이 끝난 후, HBSS로 한 번 세척해 주고, 1 ㎍/ml의 농도로 HBSS에 희석된 fibronectin을 처리한 후,4℃에서 16시간 동안 반응시켰다.반응이 끝난 후,HBSS로 한 번 세척해 주고,단일세포를 5×103cells/ml의 밀도로 배

양하였다.GFP 발현 세포와 생존된 세포의 양상을 알아보기 위하여 1㎍ /ml의 hoechst와 propium iodide(PI)를 염색하고,위치를 무작위로 선택하 여 사진을 얻어 세포의 수를 측정하였다.

7.사람 신경줄기세포 신경구의 면역형광염색

냉동보관 하지 않은 사람 신경줄기세포와 냉동 보관된 뇌조직 및 냉 동 보관된 신경구로부터 유래된 신경줄기세포를 면역 형광 염색하기 위하 여,10 ㎍/ml의 poly-L-ornithine을 커버슬립에 코팅하고,신경구를 1% FBS가 포함된 배양 배지에서 2시간 동안 붙였다.준비된 신경구를 PBS 로 2회 씻어준 후,4%의 paraformaldehyde로 10분 동안고정한 후 다시 PBS로 세척하였다.1% BSA와 10% Horseserum이 포함된 solution을 처리하고,4 ℃에서 16시간 동안 blocking하였다.일차 항체로서 human specificanti-nestin, (1:500)을 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후,triton X-100이 0.03% 첨가된 PBS 용액(PBST)으로 세 번 세척하였다.이차 항

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체반응은fluoresceinanti-mouseIgG(1:200)으로 상온에서 45분간 반응시 키고,PBST 용액으로 세 번 세척하고,propidium iodide(PI)로 5분간 반 응시켜 대조 염색을 수행하였고 세 번 세척한 후 형광현미경을 통하여 관 찰하였다.

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I

I

II

I

II

I

I.

.

.결

결 과

1.Nestinpromotor-GFP 형질전환 마우스의 신경줄기세포 배양

Nestin enhancer의 두 번째 인트론에 의해 조절되는 nestin유전자와 동시에 GFP를 발현하는 형질전환된 마우스의 임신 13.5일이 된 배아에서 GFP 발현을 확인하였을 때,GFP는 중추신경계 전반에 걸쳐 발현하였다 (Fig.1A).이러한 GFP의 발현양상은 신경줄기세포의 분포가 배아의 중 추신경계를 중심으로 신경줄기세포가 분포하고 있음을 의미한다. GFP를 발현하는 신경줄기세포를 분리하고 배양하기 위하여,배아의 전뇌 조직을 분리하여,단일세포를 얻었다.세포는 N2supplement가 첨가 된 DMEM/F12배지에서 성장인자인 EGF와 bFGF를 20 ng/㎖의 농도로 넣어준 조건에서 배양하였다.배양된 세포는 증식과 분열을 통해 세포수 가 증가되었으며,신경줄기세포를 배양할 때 나타나는 큰 특징인,신경구 (neurosphere)를 형성하였다(Fig.1B~C).배양된 신경구를 형광 현미경 로 관찰한 결과,신경구는 GFP를 발현하고 있었고,GFP(+) 신경구와 GFP(-)신경구가 섞여있는 양상을 관찰하였다. 형성된 신경구가 신경줄기세포의 특성을 가지고 있는지 확인하기 위 하여,신경구를 성장인자가 배재된 N2supplement가 첨가된 DMEM/F12 배지에서 분화시켰다. 면역형광염색 결과 형성된 신경구는 신경세포 (neuron),신경아교세포(astrocyte)그리고 희돌기교세포(oligodendrocyte) 로 분화되었다(Fig.1D~F).

이것은 Nestinenhancer의 두 번째 인트론에 의해 조절되는 nestin유 전자와 동시에 GFP를 발현하는 형질전환된 마우스의 전뇌 조직에서 얻어 진 세포가 신경 줄기세포이며,생체에서 뿐만 아니라,시험관에서 배양하 였을 때도 GFP를 발현함을 알 수 있다.

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FFFiiiggg...111..N.NNeeeuuurrraaalllssstteteemmm ccceeellllllsssiiinnnEEE112122...555eeemmmbbbrrryyyooosssaaannndddnnneeeuuurrrooossspphphheeerrreeesss...

(A)GFP(+)neuralstem cells were located in the developing CNS ofthe Nestin-eGFP transgenicmouseembryos(E12.5).(B)Neuralstem cellswere proliferated asneurospheresin cultureafterisolated from theforebrain. (C) GFP(+)neuralstem cellsin culture.Notepresenceofsomeneurospheredid not express GFP. (D) Multipotency of neurospheres were verified by differentiation into -tubulin III(+)neurons(D),GFAP(+)astrocytes(E)and GalC (+)oligodendrocytes (F)onto poly-L-ornithine coated coverslips for7 day.

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2.신경구의 계대배양 및 GFP발현의 변화 배양된 신경구는 다시 단일세포로 만들어 준 다음,같은 배양조건으 로 배양하였다.세포는 다시 증식하여 신경구를 형성하였고,신경구의 GFP 발현은 유지되고 있음을 관찰하였다(Fig.2A,2B ).같은 방법으로 여러 번 계대배양 하였을 경우,신경구의 형성능력은 그대로 유지되고 있 었으나,GFP의 발현은 감소하는 경향을 관찰하였다(Fig.2C~2F). 이러한 결과는 신경구의 형성능력은 계대배양을 할 때도 유지되나 GFP 발현이 감소되는 것으로 보아 신경줄기세포가 시험관내에서 배양할 때, 신경구내 신경줄기세포군에서 변화가 있었음을 알려 준다. 3.FACS를 이용한 GFP(+)/(-)세포의 분리 단일세포에서 배양된 신경구를 다시 단일세포로 만들어 준 후,세포 는 유세포 분석기(Fluorescence Activated CellSorter,FACS)를 이용하 여,GFP(+)세포와 GFP(-)세포를 분리하였다(Fig.3).분리한 세포는 신 경구 배양조건으로 배양하였고,GFP(+)와 GFP(-)세포 모두에서 신경구 를 다시 형성하였다(Fig 3A~3H).이렇게 만들어진 신경구의 분화능력을 비교해 보기 위하여,GFP(+)세포와 GFP(-)세포에서 유래한 각각의 신경 구를 분화시켰다.그 결과 GFP(+)세포에서 유래한 신경구의 경우는 신 경세포와 신경아교세포, 희돌기교세포로 분화되었지만(Fig. 4A~4C), GFP(-)세포에서 유래한 신경구는 신경세포와 신경아교세포로 분화가 유 도되었으나,희돌기교세포로 분화하는 능력은 저해되어 있었다(Fig.4D~ 4F). GFP(+)나 GFP(-)세포는 가각 증식하여 신경구를 형성하였으며,이 러한 결과는 증식 능력에는 차이가 없음을 의미한다.그러나 각각의 신경 구를 분화시켰을 때,GFP(-)세포에서 유래한 신경구의 경우 희돌기교세

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FFFiiiggg...222...LLLooossssss ooofffGGGFFFPPP iiinn lnllooonnnggg ttteeerrrmmm cccuuullltuttuurrreeeddd nnneeeuuurrrooosssppphhheeerrreeesss...Neuralstem cellsweremaintainedasneurospheres.Thenumberof GFP(-)neurospheres were increased over passage. expression was reduced by passage. 1st neurospheres(A,B)2ndneurospheres;(C,D)6thneurospheres(E,F).

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FFFiiiggg...333...SSSeeellleeeccctttiiiooonnncccuululltttuuurrreeeooofffGGGFFFPPP(((+++)))aaannnddd(((--)-))NNNSSSCCC bbbyy FyFFAAACCCSSS...Nestin-eGFP transgenicmouseNSC wassortedby FACS.SortedGFP(+)and(-)fraction. Cells was proliferated and grown to neurosphere GFP(+) fractioned neural stem cellneurosphere expressed GFP butGFP(-)neuralstem cellwas not expressedGFP.

FFFiiiggg...444...GGGFFFPPP(((---))) nnneeeuururrooosssppphhheeerrreee wwwaaasss rrreeeddduuucceceeddd iiinnn dddiiiffffffeeerrreeennntttiiiaaatttiiiooonnn pppooottteeennntttiiiaaalll. GFP(+)and (-)cells were fractionated by FACS sorting and cultured for neurosphere.Neuropsheresweredifferentiatedfor7days.Immunocytochemical analysis was indicated specificproteins forneuron (A,D),astrocyte (B,E), and oligodendrocyte (C,F).GFP(+)neurospheres maintained a potentialto differentiateinto alltypesofcells(A-C)whereasGFP(-)neurospheresfailed to differentiate into oligodendrocytes(D-F).The results indicate thatGFP(-) cellshavelimiteddifferentiationpotentialcomparedtoGFP(+)cells.

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FFFiiiggg 555...SSSeelelleeeccctttiiionoonn ooofffGGGFFFPPP(((+++))) aaannnddd (((---))) ccceeellllllsss bbbyyy CCClllooonnnaaalllssseeellleeeccctttiiiooonnn...Neural stem cellwereselectedbyclonalselectioninmini-welltraysfor10daysand allowed to form neurospheres.Neurospheres were differentiated on 10㎍/㎖ polyornithine coated cover-slip and performed immunocytochemistry.As a result, GFP(-) Neuropsheres reduced differentiation to oligodendrocyte comparedwithGFP(+)neurospheres.

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로 분화 되었다.(Fig.10A~10B)포로 분화되는 능력이 저해되어있는 것은 GFP(+)세포와 GFP(-)세포의특성에 차이가 있음을 말해준다.이러한 결 과는 nestin 유전자가 nestin enhancer의 2nd intron에 의해 조절되는 세 포군이 그렇지 않은 세포군에 비해 신경줄기세포의 특성을 좀 더 유지하 고 있음을 말해준다. 4.GFP(+)세포와 GFP(-)세포의 단일클론선택 GFP(+)세포와 GFP(-)세포가 단일세포에서 분열하고 증식하여 신 경구를 만들어 낼 수 있는 능력을 비교하기 위하여,세포를 단일 클론 선 택했다.형질 도입된 마우스 배아의 전뇌부위에서 얻어진 세포를 배양하 여 신경구로 배양하였다.배양된 신경구는 다시 단일세포로 만들어 준 후, well당 1개의 세포가 배양될 수 있는 농도로 희석하고,mini-wellplate 에 세포를 배양하였다.GFP(+)세포와 GFP(-)세포에서 배양된 세포는 증 식하여 신경구를 형성하였고(Fig.5A~5B,5E~5F)각각의 신경구는 분 화조건에서 배양하였다.분화된 세포를 면역형광염색으로 비교한 결과, GFP(+)세포에서 유래된 신경구의 경우는 신경세포,신경아교세포,희돌 기교세포로 분화되었지만(Fig.5C~5D),GFP(-)세포에서 유래된 신경구 는 희돌기교세포로 분화되는 능력이 저해되었다(Fig.5G~5H). 이러한 결과는 유세포분석기를 통한 분리,배양,분화 실험의 결과와 일치하며,GFP(-)세포는 GFP(+)세포에 비해 신경줄기세포의 특성이 저 해되어 있음을 알 수 있다. 5.Fibronectin코팅과 GFP(+)신경줄기세포의 증가 형질전환된 마우스의 신경줄기세포에서 GFP(+)세포의 증가를 위해 10㎍/ml의 poly-L-ornithine이 코팅된 배양접시에 신경줄기세포의 이동

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FFFiiiggg...66.6..EEEnnnrrriiiccchhhmmmeeennntt otoofff NNNSSSCCCss bsbbyyy fffiiibbbrrrooonnneeeccctttiiinnn wwwiiittthh bh bbFFFGGGFFF...Neurospheres driven from nestin-GFP transgenicmiceweredissociated to singlecellsand cultured on polyornithine (PO)with and withoutfibronectin and bFGF.The number ofGFP(+) cells was increased in the presence offibronectin and bFGF.Thus,the relative ratio of GFP(+) cells over total cells remains constant.The results indicated neuralstem cells can be easily expanded in thepresenceof fibronectinbFGF withoutlosingdifferentiationpotential.

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FFFiiiggg...777...FFFiiibbbrrrooonnneeeccctttiiinnn iiinnnddduuuccceededd ppprrrooollliiifffeeerrraaatttiiiooonnn ooofffGGGFFFPPP(((+++)))nnneeeuuurrraaalllsssttteeemmm ccceeellllllsss... Fibronectin coated condition was increased GFP(+) cell population(a) and maintainedcellratioofGFP(+)cellintotalcells.

(A) (A) (A) (A) (B) (B) (B) (B)

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성에 중요한 역할을 한다고 알려진 fibronectin을 1㎍/ml의 농도로 코팅 하였다.여기에 단일세포를 5×103 cells/ml의 밀도로 배양하고,bFGF를 20 ng/㎖의 농도로 처리해 주고 배양하였다.Hoechst와 PI의 대조염색 후, GFP(+)세포의 수의 변화를 확인하였을 때,Fibronectin이 코팅되어 있는 경우 신경줄기세포의 수가 증가하고,특히 GFP(+)세포의 비율이 대조군과 비교했을 때,증가하는 양상을 나타냈다(Fig.6). 세포수의 변화를 알아보기 위하여 무작위로 세포의 사진을 얻고 세포 의 수를 세어 비교하였다.1 ㎍/ml의 fibronectin이 코팅되고 20ng/ml의 bFGF가 된 조건에서 GFP(+)세포의 수가 증가 되었으며(Fig.7A),전체 세포수에서의 비율이 유지되었다(Fig7B). 이러한 결과는 fibronectin의 코팅과 성장인자인 bFGF만으로 신경줄기세 포의 수를 증가 시킬 수 있음을 말해준다. 6.사람 태아의 신경줄기세포의 배양 사람 태아의 대뇌 조직에서 분리된 세포는 B-27supplement와 성장 인자인 LIF,bFGF 그리고 EGF가 포함된 Neurobasal배지에서 배양시켰 다.배양 초기에는 단일세포로 증식을 시작했으며,세포는 증식하면서 구 체를 형성하기 시작했고,배양 10일째에 크기가 약 150~200㎛인 신경구 를 형성하였다(Fig.8). 7.사람 신경줄기세포에서 유래된 신경구의 면역 형광 염색 사람 태아 뇌조직에서 배양된 세포가 신경 줄기 세포의 특성을 가지 고 있는지 알아보기 위해,배양된 신경구를 신경 줄기 세포에 특이적인 표지자인 nestin 항체를 이용하여 면역 형광 염색을 수행하였다.그 결과 배양된 신경구는 nestin을 발현하고 있었고(Figs9A~9C),신경 줄기 세

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포의 특성을 가지고 있음을 확인하였다.사람 태아의 뇌조직을 냉동 보관 할 때,신경 줄기 세포의 성질을 유지한 하는지 알아보기 위하여,잘게 조 각 낸 뇌조직을 10%의 DMSO가 포함된 동결 보관 배양액에 넣고,2주 동안 액체 질소에서 보관하였다.냉동 보관된 뇌조직을 신속히 녹인 후, HBSS로 2번 씻어 주고,얼리지 않은 조직에서 세포를 얻는 방법과 같은 방법으로 세포를 얻었다.이 세포를 배양 배지에서 배양했을 때,다시 신 경구를 형성하였다.이 신경구를 nestin 항체를 이용하여 면역 형광 염색 을 했을 때,역시 nestin을 발현 하고 있었다(Figs9D~9F). 처음 형성된 신경구를 냉동 보관 하고,해동했을 때,신경 줄기 세포의 특성을 유지하고 있는지 알아보기 위하여, 배양된 신경구를 10%의 DMSO가 포함된 neurobasal배지에 넣고,2주 동안 액체 질소에서 보관 하였다. 냉동 보관된 신경구는 신속히 해동하고, HBSS로 2번 씻어 DMSO준 후,성장 인자가 포함된 배양 배지에서 하루 동안 안정화 시킨 후,단일세포로 만들어 계대 배양했다.계대 배양된 세포는 증식하여,다 시 신경구를 형성하였다.이렇게 배양된 신경구를 nestin항체를 이용하여 면역 형광 염색을 했을 때,역시 nestin을 발현 하고 있었다(Figs 9G~ 9I). 8.분화된 사람 신경구의 면역 형광 염색 사람 태아 뇌조직에서 배양된 신경구가 신경 줄기 세포의 분화능력을 가지고 있는지 알아보기 위하여, 배양된 신경구를 10㎍/ml의 poly-L-ornithine이 코팅된 커버슬립에 붙인 후,성장 인자가 없는 배양 배지에서 7일간 분화 시켰다. 분화된 세포는 신경 세포의 표지자인 anti-betatubulineIII과 신경 교세포의 표지자인 anti-GFAP 항체를 이용 하여 면역 형광 염색을 한 결과 배양된 신경구는 신경세포와 신경교세포

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로 분화 되었다.(Fig.10A~10B)

냉동 보관된 태아 뇌조직과 신경구를 해동 시킨 후,각각 배양된 신 경구가 신경 줄기 세포의 분화능력을 유지하고 있는지 알아보기 위하여, 배양된 신경구를 10㎍/ml의 poly-L-ornithine이 코팅된 커버슬립에 붙인 후,성장 인자가 없는 배양 배지에서 7일간 분화 시켰다.냉동시키지 않은 조건에서 배양된 신경구와 마찬 가지로 냉동 보관된 뇌조직에서 유래된 세포는 신경세포와 신경교세포로 분화가 되었으며(Fig 11C~11D),냉동 보관된 신경구에서 배양된 세포도 역시 같은 결과를 얻었다(Fig 11E~ 11F). 9.장기 보존된 뇌조직에서 유래된 신경 줄기 세포의 분화능력 장기간 동안 냉동 보존된 태아 뇌조직이 신경 줄기 세포의 특성을 유 지하고 있는지 확인하기 위하여,6개월(23주)동안 액체 질소에서 장기 보존된 태아 뇌조직에서 세포를 분리하여 같은 조건으로 배양하였다.분 리 배양된 세포는 신경구를 형성하였고(Fig11A~11B),형성된 신경 줄기 세포를 분화 시켰을 때,신경세포와 신경아교세포로 분화 되었다.2주 동 안 액체 질소에서 보존된 신경구를 분화 시켰을 경우와 비교했을 때,6개 월 이상 장기간 보존 했을 때에도 그 분화능력을 유지하고 있었다(Fig. 11C).

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FFFiiiggg...888...HHHuuummmaaannnfffeeetttaalallbbbrrraaaiiinnndddeeerrriiivvveeedddnnneeeuuurrraaalllsssttteeemmm ccceeellllllfffooorrrmmemeedddnnneeeuuurrrooosssppphhheeerrreeesss... 12week human fetalbrain tissue was dissociated into single cell(A) and maintained in neurobasal medium supplemented with B27, 10ng/ml of leukemiainhibitory factor(LIF)and 20ng/mlofepidermalgrowth factor(EGF) and basic fibroblastgrowth factor(bFGF).Single cellwas proliferated and formed neurospheres (B)~ (F).(B)Daysin vitro(DIV)2,(C)DIV 4,(D) DIV 6,(E)DIV8,(F)DIV10,Scalebar=100㎛.

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FFFiiiggg... 999...IIImmmmmmuuunnnooocccyytyttoooccchhheeemmmiiicccaaalll aaannnaaalllyyysssiiisss ooofff nnneeueuurrrooosssppphhheeerrreeesss dddeeerrriiivvveeeddd fffrrrooommm hhhuuummmaanannfffeeetttaaalllbbbrrraaaiiinnn...Fresh(notfrozen)humanfetalbrainandstoredbrainand neurospheres in liquid nitrogen expressed nestin,Fresh(not frozen) human fetalbrain derived neurospheresexpressed nestin,known asneuralstem cell marker(A)and counterstained with propidium iodide(PI)(B).Neurospheres derived from human fetalbrain were stored in liquid nitrogen tank for 2 weeks.Neurosphereswerethawed and dissociated into singlecellsby itself. Single cells grown as neurospheres fora week and neurospheres expressed nestin(D)and counterstained with PI(E).Frozen brain tissue neurospheres expressed nestin (G) and counter stained with PI(H).(C),(F) and (I) is mergedimage.

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FFFiiiggg...111000..D.DDiiiffffffeeerrreeennntttiiiaaatttiiiooonnn ooofffnnneeeuuurrrooosspspphhheeerrreeesssdddeererriiivvveeeddd fffrrrooommm fffrrreeessshhh aaannnddd fffrrrooozzzeeennn tttiiissssssuuueee,,, fffrrrooozzzeeennn nnneeeuuurrrooossspphphheeerrreee... Differentiated Neurospheres was expressed neuronaland glialmarkers.Human fetalbrain tissue derived neurospheres weredifferentiated 1% FBS contained neurobasalmedium supplemented with B27.Thawed tissue derived neurospheres and thawed neurospheres derived neurospheres were differentiated in same condition.The cellwas expressed Tuj-1,thespecificmarkerforneuron((A),(C)and(E))andpositiveforglial cell marker glial fibrillary acidic protein(GFAP) ((B),(D) and (F)).The results indicated thatfresh -(A),(B)-,frozen tissue -(C),(D)- and frozen neurospheres-(E),(F)-weresamedifferentiationpotential.

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FFFiiiggg...111111...DDDiiiffffffeeerrreeennntttiiiaaatttiiiooonnn ooofffnnneeeuuurrrooosssppphhheeerrreeesssdddeeerrriiivvveeeddd fffrrrooommm fffrrreeessshhh,fffrrrooozzzeeennntttiiissssssuuueee aaannndddfffrrrooozzzeeennnnnneeeuuurrrooosssppphhheeerrreee... 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Not frozen Frozen tis s ue Frozen s phere Type of cryopreservation % o f G F A P a n d T u j-1 Tuj-1 GFAP

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FFFiiiggg...111222...MMMaaaiiinnntttaaaiiinnn oofoffppprrrooollliiifffeererraaatttiiiooonnn aaannnddddddiiiffffffeeerrreeennntttiiiaaatttiiiooonnnpppooottteeennnttitiiaaalllaaafffttteeerrrlllooonnnggg ttteeerrrmmm Cryopreservation...Fetalbrain tissue wasStored for2 weeks orfor23 weeksin liquid nitrogen and prepared cellforneuralstem cellculture.Cells were formed neurospheres(Fig.4A,4B)and Single cells were proliferated andformedneurospheres.Neurospheresweredifferentiated1% FBS contained neurobasalmedium supplementedwithB27andcomparedexpressionofTuj-1 and GFAP by immunocytochemistry and cellcount.There was no certain differencebetween thetwoofstored for2weeksand23weeksneuralstem cell.

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I

I

IV

V

V.

.

.고

고 찰

신경계의 세포는 손상 일어난 뒤 한정된 부위에서 신경줄기세포가 분 화하여 신경세포의 재생이 일어난다.이러한 신경줄기세포는 마우스와 사 람의 해마체 부분과 뇌실부위에서 높게 발현하고 있음이 알려져 있다.신 경세포 손상에 의한 여러 가지 치료의 방법 중에서 이러한 신경줄기세포 를 세포치료제로서 이용하는 방법이 여러 가지 방법으로 검토되고 있다. 하지만,이러한 신경줄기세포의 특이적인 표지자가 존재하지 않아 순수한 신경줄기세포를 분리하는데 어려움이 있다.현재 생체 내에 GFP가 nestin 유전자의 두 번째 intron에 의해 동시에 발현하는 형질전환 마우스가 만 들어졌고,여기서 분리된 세포를 유세포 분석기로 분리할 수 연구가 있다 (Murayama등,2002). 본 연구에서는 이러한 형질전환된 마우스의 임신 12.5일 된 태아의 전 뇌부위에서 신경줄기세포를 분리하고,이를 배양하였다.7일간 배양된 세 포는 신경줄기세포의 큰 특징인 신경구(neurosphere)를 형성하였고,GFP 를 발현하고 있었다.배양된 신경구를 단일세포로 만들어 주고,계대 배양 하였을 때,세포는 다시 신경구를 형성하였고,GFP의 발현이 유지되고 있 음을 관찰하였다.이는 신경조직에서 유래한 신경줄기세포를 성장인자가 포함된 배지에서 배양하였을 때,세포는 계속해서 증식하고 있음을 알 수 있다.그러나 계대 배양이 지속될수록 GFP의 발현은 감소하고 있는 결과 는 신경줄기세포의 특성이 시험관내에서 배양될 때 변화했음을 의미한다. 이는 GFP의 발현이 14일 된 배아에서 최고를 이루다 점차 감소하고,태 어난 후 4일이 지나면 현저히 감소하는 생체내의 결과로 미루어 보아 (Mignone등,2004),신경줄기세포를 4주 이상 시험관내 배양할 때,GFP를 발현하는 신경줄기세포군에 변화가 일어났음을 알 수 있다.

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배양된 신경줄기세포의 GFP(+)세포와 GFP(-)세포의 특성을 비교하 기 위하여,배양된 신경구를 단일세포로 만들어 주고,이를 유세포 분리기 를 통해 GFP(+)세포와 GFP(-)세포를 분리하였다.분리된 세포는 성장인 자가 포함된 N2supplement가 포함된 DMEM/F12배지에서 배양하였을 때,나란히 신경구를 형성하였다.형성된 신경구를 각각 분화 시켰을 때, GFP(+)세포의 경우는 신경세포(neuron)와 신경아교세포(astrocyte),희돌 기세포(oligodendrocyte)로 분화되었지만,GFP(-)세포는 희돌기세포로 분 화되는 능력이 저해되었다. 하나의 세포에서 발생한 신경줄기세포가 신경구를 형성하고,그 특성 을 유지하고 있는지 알기위해,형질전환된 마우스로부터 배양된 신경구를 단일세포로 만들어주고,단일클론선택 방법으로 세포를 배양하였다.배양 된 세포는 GFP(+)세포와 GFP(-)세포 모두에서 신경구를 형성하였고,각 각의 신경구를 분화시켰을 때,GFP(-)가 희돌기교세포로 분화되는 능력 이 저해되어 있음을 관찰하였다.이러한 결과는 GFP(-)세포가 GFP(+)세 포 보다 분화 할 수 있는 능력이 저해되어 있음을 말하는 것으로 GFP(+) 세포가 신경줄기세포로서의 특성을 더 많이 가지고 있음을 말해준다.따 라서 nestinenhancer부위의 두 번째 intron에 의해서 발생된 세포가 신 경줄기세포의 특성을 보다 더 강하게 가지고 있음을 말해준다. 최근 마우스 배아줄기세포를 신경구로 배양한 후에 얻은 신경줄기세 포를 분화시켜서 신경세포를 얻은 결과가 있다(Lee등,2000;Rathjen등, 2002).이때 배아줄기세포에서 배양된 신경줄기세포를 배양하기 위하여, 시험관내 배양할 때 세포의 이동성을 증가시킨다고 알려진 fibronectin을 코팅하였고,성장인자인 bFGF만을 이용하여 신경줄기세포를 배양하는 방 법을 이용하였다. 성장인자인 EGF는 신경줄기세포를 배양할 때, neurosphere의 형성에 관여하여 세포를 증식시키는 역할을 하고 있는 것

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으로 알려져 있지만(Reynolds와 Weiss,1992),이와는 별도로 bFGF역시 성체의 줄무늬체(striatum)(Gritti등,1996),척수(Weiss등,1996),성체와 태아의 해마체 및 태아의 대뇌피질에서 얻어진 세포를 증식시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Gensburger등,1987;Ray 등,1993;Johe등, 1996;Qian등 1997). 본 연구에서는 이러한 내용에 착안하여 형질전환된 마우스의 신경줄 기세포에서 GFP(+)세포를 안정적으로 배양하고 그 수를 증가시킬 수 있 는지 알기 위해 신경줄기세포를 시험관내 배양할 때 세포의 이동성을 증 가시킨다고 알려진 fibronectin을 이용하여 세포를 배양하였다. Fibronectin을 1㎍/㎕의 농도로 배양접시에 코팅하고,성장인자인 bFGF 를 20ng/㎖의 농도로 처리해 주고,신경줄기세포를 배양하여 GFP(+)세 포의 수의 변화를 확인하였다.Fibronectin이 코팅되어 있는 경우 신경줄 기세포의 수가 증가하였고,특히 GFP(+)세포의 비율이 대조군과 비교했 을 때,증가하는 양상을 나타냈다.이러한 결과는 fibronectin의 코팅과 성 장인자인 bFGF만으로 신경줄기세포의 수를 증가 시킬 수 있음을 말해준 다. 퇴행성 질환이나 신경손상에 의한 신경계의 질환은 각종 독성물질이 나 사고 등에 의한 신경세포의 파괴에서 비롯된다.이러한 질환에 대한 치료의 방법으로 여러 가지 연구 방법들이 적용되고 있지만,현재 극복해 야할 문제들이 많이 남아 있다.유전자 치료의 방법은 아직까지 효과의 지속성에서 문제가 있으며,이식 치료 방법으로서의 배아 줄기세포의 이 용은 지속성과 윤리적인 차원에서 문제가 지적되고 있다. 신경 줄기 세포는 신경계의 세포인 신경세포와 신경교세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포이다.이 세포를 이용한 이식 치료 방법의 확립 은 보다 직접적인 신경계의 퇴행성 질환이나 신경을 손상 받은 환자에 대

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한 보다 정확하고 적극적인 치료 방법이 될 것 이다. 그러나,세포 치료제로서 신경 줄기 세포의 이용에는 몇 가지 제약이 따르고 있다.치료에 이용할 수 있는 뇌조직의 공여자를 확보하기 어렵고, 따라서 충분한 치료용 세포의 확보가 어렵다.그리고 치료를 요하는 환자 가 있을 때,곧 바로 세포를 확보하기가 어렵다는 문제점이 발생한다.따 라서 신경 줄기 세포의 재료가 될 수 있는 뇌조직이나 신경구의 냉동 보 존 기술의 확립은 치료가 필요한 환자가 발생 하였을 때,즉시 세포를 준 비할 수 있도록 할 수 있는 중요한 기술이다. 본 연구는 태아 뇌조직의 냉동보관 방법은 대뇌 반구 전체를 얼리는 경우보다 작은 조각으로 잘라 얼리는 경우가 세포 생존율이 높다는 보고 (Negish 등,2002)를 참조하여 확보된 신경 줄기 세포의 재료로 이용할 수 있는 뇌조직을 작게 잘라 냉동보관 하였고,또한 배양된 신경구를 냉 동보관 하였고,이를 다시 해동했을 때,신경 줄기 세포의 성질을 유지하 고 있는지 확인하고자 하였다. 신경 줄기 세포의 배양을 위하여 확보된 임신 10~15주 태아의 대뇌 부분에서 얻어진 단일세포를 B27supplement가 포함된 neurobasal배지 에서 배양 하였다.배양 배지는 신경 줄기 세포를 매우 선택적으로 배양 시킬 수 있는 조성으로 구성되어,이러한 배지 조건에서 배양된 세포는, 구체를 형성하여 신경구(neurosphere)를 형성하면서 증식하게 된다.신경 구는 신경 줄기 세포를 시험관에서 배양 할 때 나타나는 전형적인 특징이 며 또한 배양된 신경구는 세포 치료제의 재료로서 매우 중요한 위치에 있 다.즉,신경 줄기 세포는 신경구를 통해서 증식이 활성화 된다는 보고가 있었고,또한 신경 줄기세포의 분화능을 유지한다고 알려져 있다. 본 연구에서 배양된 신경구는 면역 형광 염색법으로 확인했을 때,신경 줄기 세포의 특이적인 표지자인 nestin을 발현하고 있었으며,배양된 신경

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구를 분화시키는 조건에서 배양했을 때,신경세포와 신경아교세포로 분화 되었다.이러한 결과는 사람 태아의 뇌조직에서 유래된 신경 줄기 세포를 시험관에서 배양 할 수 있음을 말해준다. 신경 줄기 세포의 재료로 매우 유용하게 이용될 수 있는 태아의 대뇌 조직을 냉동 보관 하고,이를 해동 시켰을 때,이 조직에서 유래한 세포가 신경 줄기 세포의 특성을 유지하고 있는지 확인하기 위하여,대뇌 조직을 작게 조각내어 이를 냉동 보관하였다.보관된 조직은 해동하여,세포를 추 출하고,배양 배지에서 배양 하였다.배양된 세포는 얼리지 않은 조건과 마찬가지로 신경구를 형성하였고,신경 줄기 세포의 특이적인 표지자인 nestin이 발현하고 있었으며,분화 조건에서 배양 하였을 때,신경세포와 신경아교세포로 분화 되었다.조직 상태에서 냉동 보관된 세포 역시 신경 줄기 세포의 특성을 유지하고 있었고,신경 줄기 세포를 냉동 보관 하는 방법에 조직을 곧바로 냉동 보관 하는 방법을 이용 할 수 있다는 가능성 을 확인했다.뇌조직을 냉동 상태로 장기 보관하고,다시 해동했을 때 얻 어진 세포는 다시 신경구를 형성하였으며,분화 시켰을 때 신경 세포와 신경 아교 세포로 분화되는 비율이 유지는 결과는 이를 뒷받침 해준다. 신경 줄기 세포의 냉동 보관 방법은 계대 배양 직전,신경구의 상태 로 보관하는 방법이 알려져 있다(Vescovi등 1999).본 연구의 결과에서도 신경구를 냉동 보관하였다가 해동 하였을 때,형성된 신경구는 신경 줄기 세포의 표지자인 nestin 이 발현하고 있었고,분화 조건에서 배양 하였을 때,신경계의 세포인 신경세포와 신경 교세포로 분화되었다.이러한 결과 는 신경 줄기 세포를 계대 배양 직전의 신경구를 냉동 보관 하는 방법도 좋은 방법이 될 수 있음을 말해준다. 본 연구의 결과는 nestin 유전자의 발현에 enhancer부위의 두 번째 intron이 신경줄기세포의 특성을 유지하는데,중요한 역할을 한다는 사실

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을 확인했다.특히 GFP가 발현하는 형질전환 마우스에서 유래한 신경줄 기세포의 배양과 분화 양상의 결과는 이러한 결과를 뒷받침 해 준다.그 리고 신경줄기세포를 배양하는 데 있어 신경구를 형성시키지 않고 세포외 기질인 fibronectin과 성장인자인 bFGF만으로도 충분히 배양이 가능하다 는 사실을 확인했다. 다음으로,본 연구에서는 사람 신경줄기세포를 배양하기 위하여 공여 된 태아의 뇌조직에서 세포를 얻어 배양하였다.분리된 세포는 신경구를 형성하였고,nestin을 발현하고 있었다.뇌조직이나 신경구를 냉동 보관하 고 이를 해동을 했을 때,해동된 조직과 신경구 모두에서 그 고유의 성질 을 잃지 않음을 확인하였다.20주 이상 장기 보관된 뇌조직에서 얻은 신 경줄기세포를 배양하였을 때,세포는 신경구를 형성하는 능력을 그대로 유지하고 있었고,2주 정도의 짧은 기간 냉동보관 된 조직에서 얻은 세포 의 신경구 형성능력과 분화능력에서 큰 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과들은 양적으로 한정되어 세포 치료제로서 이용하기 어려웠던 신경 줄기 세포의 양적인 확보 및 보관을 위해,합법적으로 공여된 태아 의 대뇌 조직이나 대량 배양된 신경구의 냉동 보관 방법의 확립으로,치 료에 필요한 세포의 확보와 치료 목적의 신경 줄기 세포 연구에 도움이 될 것으로 기대된다.

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결 론

본 연구의 결과는 신경줄기세포에서 발현되는 nestin 유전자의 enhancer부위의 두 번째 intron이 신경줄기세포에 보다 특이적으로 작용 하는 것을 신경구의 분화와 단일클론선택,유세포 분석기를 통한 선택을 통해 보였다.따라서 nestin 유전자의 두 번째 intron은 신경줄기세포의 보다 더 명확한 마커로 사용 될 수 있을 것이다.그리고 사람의 태아 뇌 조직을 작게 잘라 냉동 보존했을 때에도,신경줄기세포가 발생한 결과로 보아,신경줄기세포의 재료로서 뇌조직을 보관하는 방법이 좋은 대안이 될 수 있다.

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참 고

고 문

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KwangwonKwon

DepartmentofMedicalSciences TheGraduateSchool,AjouUniversity

(SupervisedbyAssociatedprofessorHaeyoungSuh-Kim)

Nestin isa memberoftheclassVIintermediated filamentproteins and awell-known stem cellmarkerin theneurallineage.Thenestin geneconsistsoffourexonsandthreeintrons.Ithasbeenknownthat thenestintransgenecontainingthesecondintronissufficienttodirect tissuespecificexpressionofthenestingeneindeveloping embryos.In thisstudy,weinvestigatedwhetherthesecondintronoftheratnestin gene is sufficientto confertissue-specific expression ofthe gene in neuralstem cellsinvitroandinvivosystem.Tostudythespecificity of the second intron of the nestin gene, eGFP expression was determined in transgenic mice carrying the nestin 2nd intron-eGFP transgene.eGFP expression washigh in developing embryos butnot intheadultmice.Neuralstem cellwereisolatedfrom theforebrainof E12.5transgenicmiceandsortedby FACS basedon GFP expression.

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Both GFP (+) and (-) cells could generate neurospheres but the differentiation potentialinto oligodendrocyte was reduced in eGFP(-) neurospheres. To determine differentiation ability neurosphere from single cell,we selected by clonalselection and cultured for10 day. SinglecellwasformedneurosphereandexpressedGFP ornot.

Neuralstem cells (NSCs) derived from fetaland adult central nervous system has been expanded,differentiated,and fount to be multipotentand self-renewing.In thisstudy,weinvestigated whether the NSCs from cryopreserved fetal brain tissue or cultured neurospheres maintain the differentiation potential compared with fresh(notfrozen)tissuederived NSCs.Neuralstem cellwasprepared from gestation10to15weekshumanfetalbrain.Culturedneuralstem cellwas expressed nestin,a well-known stem cellmarker in the neurallineage and positive neuronalmarker(β-tubulin-III) and glial marker(GlialFibrillary Acidic Protein,GFAP)afterdifferentiation.To comparedwith notfrozen andfrozen tissueorneurospheres,tissueor neurospherewascryopreservedinliquidnitrogenfor2weeks.Thecell derived from frozen tissueorneurosphereswasexpressed nestin and neuronalmarker(β-tubulin-III)and glialmarker(GlialFibrillary Acidic Protein,GFAP)differentiationmarkersafterdifferentiation.Theresults indicated that cryopreserved fetal brain tissue or neurospheres maintainsNSCsfate,sotissueand neurospherescould storein liquid nitrogen.The Cryopreservation oftissue orneurosphere,expand the chancesforuseoftheNSCscouldtherapeuticapproach.

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별 별별첨첨첨자자자료료료 --- 111)))줄줄줄기기기세세세포포포의의의 추추추출출출이이이 가가가능능능한한한 조조조직직직의의의 공공공여여여 동동동의의의서서서 양양양식식식

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8)냉동배아를 제공하는 경우 아래의 냉동배아 관련 연구지원 전제조 건에 대해 충분히 설명을 들었으며 이에 동의합니다. ○ 연구에 사용하는 배아는 불임치료목적을 위해 체외 수정하여 보관 된 배아 중 수정 후 5년 이상 경과된 폐기예정인 잉여 냉동배아로 한정한다. ○ 배아제공에 대한 동의서를 받는 시점은 반드시 공여자가 판단하기 에 불임치료가 끝난 시점이어야 한다. ○ 연구목적으로 제공된 배아는 해당 연구자 이외의 타인에게 제공되 지 못하며 줄기세포 추출이외의 다른 목적으로 사용할 수 없고 해 당 연구수행 후 적법한 절차를 거쳐 폐기하여야 한다. 본본본인인인은은은 이이이상상상의의 내의 내내용용용을을을 충충충분분분히히히 인인지인지지하하하고고고 배배배아아아 및및및 줄줄줄기기기세세세포포포의의의 추추추출출출 이이이 가가가능능능한한한 조조조직직직 및및및 검검검체체체를를를 연연연구구에구에에 제제제공공공하하하는는는데데 동데 동동의의의합합합니니니다다다... 2003년 월 일 공여자 ________________________(인) 공여자 ________________________(인)

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별 별별첨첨첨자자자료료료 --2-22)))인인인간간간 줄줄줄기기기세세세포포포 연연연구구관구관관리리리지지지침침침

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2 22...연연연구구구책책책임임임자자자는는는 줄줄줄기기기세세세포포포 공공공여여여자자자((배(배배아아아의의의 경경경우우우 난난난자자자 및및및 정정정자자자제제제공공공자자자)))에에에 게 게 게 아아아래래래의의의 내내용내용용이이이 포포포함함함된된 동된 동동의의의서서서를를를 받받받아아아야야야 한한한다다다. 1)연구의 목적 및 연구의 범위는 장기이식연구를 포함한 줄기세포의 추출임을 밝혀야 한다. 2)줄기세포 공여자는 추출한 줄기세포를 이용한 연구에서 경제적인 창 출효과가 발생할 수도 있음을 인지하고 이에 대한 권리를 주장할 수 없음을 명시하여야 한다. 3)줄기세포공여자는 줄기세포를 이용한 치료의 수혜자에 대하여 어떠 한 권리도 주장할 수 없음을 명시하여야 한다. 4)줄기세포 공여자에 관한 일체의 인명 및 신상정보는 비밀이 보장됨 을 알려주어야 한다. 5)줄기세포 공여자는 추출된 줄기세포나 줄기세포 세포주가 수년간 보 관될 수 있음을 인지하여야 한다. 6)관련연구는 줄기세포 공여자에게 직접적인 의료혜택을 제공하기 위 하여 수행되는 것이 아님을 명시하여야 한다. 7)연구목적으로 제공된 배아는 줄기세포 추출 이외의 다른 목적으로 사용되지 않을 것이며,다른 사람의 자궁 내에 착상되거나 할 수는 없음을 명시하여야 한다. 3 33...줄줄줄기기기세세세포포포 연연연구구구와와와 관관관련련련하하하여여여 연연연구구계구계계획획획서서서의의의 작작작성성성시시시 아아아래래래의의의 내내내용용용이이이 포포포 함함함되되되어어어야야야 한한한다다다... 1)연구개발의 내용 및 방법에 연구에 사용될 배아를 포함한 줄기세포 의 출처 및 획득절차를 명시하여야 한다. 2)연구에 필요한 배아 및 기타 줄기세포의 추출이 가능한 조직을 보유 하고 있는 기관의 “연구지원확인서”(배아 및 기타 줄기세포의 추출

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