서
론
방사성 동위원소 발생장치 (generator)는 반감기가 긴 모핵종 (mother nuclide)이 붕괴하여 짧은 반감기를 가진 딸핵종 (daughter nuclide)을 얻어내는 장치로 사이클로트 론의 가동 없이 효율적으로 진단용 방사성 동위원소를 보급할 수 있는 경제적 이점이 있다(Velikyan et al. 2005). 68Ga은 generator를 통해 얻는 방사성 동위원소로써 반 감기가 68분으로 킬레이트 반응을 통해 합성하고 표지 조작이 쉬워 반감기로 인한 시간제약을 받는 방사성 동 위원소 의약품 합성에서 큰 장점을 가지고 있다. 또한 68Ga을 도입한 방사성 의약품은 [18F]FDG의 암 진단 영 상과 비교하여 우수한 암 진단영상을 얻을 수 있다고 보 고되어 있다 (Tatu et al. 2005). 포피린 (Porphyrin) 유도체는 4개의 pyrrole이 4개의 methine bridge로 연결된 구조를 가진 화합물로 암세포에 선택적으로 축적이 된다. 특히, 소수성 포피린 유도체는 주로 알부민과 결합하여 체내에 분포하게 되는데 종양이 있는 부위는 정상조직과 달리 염증반응이 있어 혈관 투 과성이 증가하고 림프액이 풍부하여 종양조직주위에 많 이 분포하게 된다 (Kim et al. 2003; Brunner et al. 2004;─ ─ 335 ── 68
Ga
을 표지한 포피린 유도체의 합성
이은선1,2∙박정훈2∙김상욱2∙이흥래2∙허민구2∙김인종2 최상무2∙양승대2∙유국현1,* 1동국대학교 화학과, 2한국원자력연구원 정읍방사선과학연구소Synthesis of
68Ga Labelled Porphyrin Derivatives
Eun Sun Lee1,2, Jeong Hoon Park2, Sang Wook Kim2, Heung Nae Lee2, Min Goo Hur2, In Jing Kim2, Sang Mu Choi2, Seung Dae Yang2and Kook Hyun Yu1,*
1Department of Chemistry, Dongguk University, Seoul 100-715, Korea 2Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute,
Jeongeup 580-185, Korea
Abstract -- 68Ga (t
1/2==68 min) is suitable nuclide for imaging tumors using positron emission
tomo-graphy (PET) due to easy production from 68Ge/68Ga generator without a cyclotron on site.
Por-phyrin has planar macrocycles incorporating four pyrrole rings joined by methine bridges. It has reported that Porphyrin can become localized in tumor tissue. Hence 68Ga labeled to porphyrin as
a novel potential PET radiotracer will be promising effectively agent for tumor imaging in cancer. In this study, we synthesized [68Ga]Ga-hematoporphyrin dimethyl ester and [68
Ga]Ga-protopor-phyrin dimethyl ester. The radiochmical yield of [68Ga]Ga-hematoporphyrin dimethyl ester and
[68Ga]Ga-protoporphyrin dimethyl ester were 24% and 18%, respectively.
Key words : 68Ga, Hematoporphyrin dimethyl ester, Proporphyrin dimethyl ester
* Corresponding authors: Kook Hyun Yu, Tel. +82-2-2260-3709, Fax. +82-2-2268-8204, E-mail. [email protected]
Lee et al. 2004). 포피린 유도체는 킬레이트 리간드를 이 용하지 않고 직접 포피린 고리 안에 갈륨과 같은 금속이
온을 도입할 수 있으므로 양전자 방출핵종 68Ga을 포피
린 유도체에 도입한 복합체는 PET용 암 영상 진단 시약 으로서 응용이 가능하다 (Robert et al. 1985; Tammilmani
et al. 2006).
본 연구의 목적은 PET용 암 영상 방사성의약품을 개 발하고자 포피린 유도체 중 암세포에 축적이 잘되는 헤 마토포피린 다이메틸 에스터 (hematoporphyrin dimethyl
ester) (1a)와 프로토포피린 다이메틸 에스터
(protopor-phyrin dimethyl ester)에 68Ga을 도입한 [68Ga]갈륨-헤마
토포피린 다이메틸 에스터 (3a)와 [68Ga]갈륨-프로토포피 린 다이메틸 에스터 (4a)를 합성하였다.
재료 및 방법
1. 시료준비 본 연구에 사용된 합성 시약들은 알드리치 (Aldrich)사 와 시그마 (Sigma)사 특급 시약을 정제 없이 사용하였다. 박층 크로마토그래피 전개판은 머크사 (Merck)의 silica gel 60 F-254 (층 두께 0.25 nm)를 사용하였으며 중력 컬 럼 크로마토그래피용 실리카 젤은 머크 (Merck)사의 Silica Gel 60 (입자크기 0.06~0.20 nm, 70~230 meshAMTM)을 사용하였다.
2. 기 기
수소 핵자기 공명 스펙트럼은 500 MHz FT-NMR JEOL ECA-500 Spectrometer를 이용하여 TMS (tetramethyl sila-ne)을 기준 (0 ppm)으로 하여 얻었다. 자외선-가시광선 스펙트럼은 Varian사의 Cary 50 UV-Vis
spectrophotome-ter를 이용하였다. 방사성 동위원소 68Ga은 Obninsk사 68Ge/68Ga generator를 통해 염화갈륨 (III)으로 얻었다. 방 사성 박층 크로마토그램은 Bioscan사의 AR-2000을 사 용하여 측정하였다. 질량 스펙트럼은 JEOL사의 JMS 600 을 사용하여 얻었다. 3. 비교물질의 합성 1) 갈륨-헤마토포피린 다이메틸 에스터 (1b)의 합성 (1) 헤마토포피린 다이메틸 에스터 (1a)의 합성 헤마토포피린 500 mg (~50%, 0.418 mmol)을 오쏘 포메 이트 (orthoformate) 25 ml와 메탄올 25 ml에 녹인다. 진한 황산 5 ml을 천천히 가하여 실온에서 45분 동안 교반 후 박층 크로마토그래피로 반응이 종결됨을 확인한 후 증류수로 묽힌 후 수산화나트륨으로 pH 4.5가 되도록 맞췄다. 디클로로메탄을 혼합하여 유기층을 분리하여 증 류수로 두 번 씻어준 뒤 유기층만을 모아서 용매를 감압 증류하여 제거하고 잔여물을 컬럼 크로마토그래피로 분 리하여 생성물 헤마토포피린 다이메틸 에스터 (1a)를 얻 었다. Yield : 43% (113 mg, 0.180 mmol), Rf==0.41 (methy-lene chloride : methanol==10 : 1) 1H NMR (500 MHz, d
6 -DMSO) :δ 10.69, 10.68, 10.17, 10.15 (s, 4H, ==CH), 6.52 (s, 2H, CHOH), 6.17 (q, 2H, ==CCH), 4.33 (m, 4H, ==CCH2), 3.69 (s, 6H, OCH3), 3.55 (m, 12H, ==CCH3), 3.26 (m, 4H, CH2CO2), 2.14 (d, 6H, CHCH3), -4.00 (s, 2H, NH). (2) 갈륨-헤마토포피린 다이메틸 에스터 (1b)의 합성 헤마토포피린 다이메틸 에스터 (1a) 20 mg (0.032 mmol) 을 피리딘 1 ml를 반응 플라스크에 녹여 과량의 염화갈 륨 (gallium chloride (III))을 가한 후 온도를 100�C로 유 지하면서 교반하여 1시간 동안 환류를 시켰다. 박층 크 로마토그래피로 반응이 종결됨을 확인한 후 용매를 감압 N HN HN N NH NH HO HO HO O O OH OH OH OH OH OH CH3 H3C H3C H3C H3C H3C H3C H3C H3CO H3CO H3CO H3CO H3C H3C CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 N N O O N N N N O O Ga H2O Orthoformate Methanol, H2O, H2SO4 GaCl3/pyridine (1a) (1b)
Fig. 1. Synthesis of Ga-hematoporphyrin dimethyl ester (structures of hematoporphyrin dimethyl ester (1a) and Ga-hematoporphyrin dimethyl
증류하여 제거하고 잔류물을 증류수로 두 번 씻어준 후 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 생성물 갈륨-헤마토포 피린 다이메틸 에스터 (1b)를 얻었다. Yield : 21% (4.9 mg,
0.0067 mmol), Rf==0.56 (methylene chloride : methanol==
8.5 : 1.5) 1H NMR (500 MHz, d 6-DMSO) :δ 10.86, 10.84, 10.42, 10.41 (s, 4H, ==CH), 6.59 (s, 2H, CHOH), 6.23 (q, 2H, = =CCH), 4.47 (m, 4H, ==CCH2), 3.73 (m, 12H, ==CCH3), 3.50 (s, 6H, OCH3), 3.28 (m, 4H, CH2CO2), 2.13 (d, 6H, CHCH3). 2) 갈륨-프로토포피린 다이메틸 에스터 (2a)의 합성 프로토포피린 다이메틸 에스터 20 mg (0.034 mmol)을 피리딘 1 ml를 반응 플라스크에 녹여 과량의 염화갈륨
(gallium chloride (III))을 가한 후 온도를 100�C로 유지 하면서 교반하여 1시간 동안 환류를 시켰다. 박층 크로 마토그래피로 반응이 종결됨을 확인한 후 용매를 감압 증류하여 제거하고 잔류물을 증류수로 두 번 씻어준 후 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 생성물 갈륨-프로토포 피린 다이메틸 에스터 (2a)를 얻었다. Yield : 14% (3.3 mg,
0.0048 mmol), Rf==0.62 (methylene chloride : methanol==
8.5 : 1.5) 1H NMR (500 MHz, d 6-DMSO) :δ 10.58, 10.52, 10.51, 10.44 (s, 4H, ==CH), 8.63 (m, 2H, ==CCH), 6.53~ 6.26 (d, 2H, ==CH2), 4.47 (m, 4H, ==CCH2), 3.69~3.82 (m, 18H, ==CCH3, OCH3), 3.22 (m, 4H, CH2CO2). 3) 방사성 동위원소 68Ga의 표지반응 (1) [68Ga]갈륨-헤마토포피린 다이메틸 에스터의 합성 [68Ga]GaCl 3가 10 mCi가 들어있는 반응용기에 피리딘 용매에 녹아있는 1×104ppm의 헤마토포피린 다이메틸 에스터 (1a) 1 ml를 넣고 온도를 100�C로 유지하면서 교 반하여 1시간 동안 가열하였다. 표지 화합물의 합성을 방사성 박층 크로마토그래피 (Radio TLC)를 통하여 확 인하였다. 그 결과 24%의 [68Ga]갈륨-헤마토포피린 다이
메틸 에스터를 얻었다. TLC (methylene chloride :
metha-nol==8.5 : 1.5) Rf==0.58. (2) [68Ga]갈륨-프로토포피린 다이메틸 에스터의 합성 [68Ga]GaCl 3가 10 mCi가 들어있는 반응용기에 피리딘 용매에 녹아있는 1×104ppm의 프로토포피린 다이메틸 에스터 1 ml를 넣고 온도를 100�C로 유지하면서 교반하 여 1시간 동안 가열하였다. 표지 화합물의 합성을 방사 성 박층 크로마토그래피를 통하여 확인하였다. 그 결과 18%의 [68Ga]갈륨-프로토포피린 다이메틸 에스터를 얻
었다. TLC (methylene chloride : methanol==8.5 : 1.5) Rf==
0.64.
결과 및 논의
포피린 유도체는 대형 고리 화합물로 수소 핵자기 공 명 스펙트럼에서 특징적인 화학적 이동 (chemical shift) 을 보이는데 이것을 고리 전류 효과 (ring current effect) 때문이다. 고리 전류 효과는 파이-전자 (π-electron)의 영 향으로 자기장이 유발되어 화학적 이동이 크게 가려진
(shield) 높은장 (up field)에서 나타나거나 적게 가려진
(deshield) 낮은장 (down field)에서 나타난다. 먼저 에스터 반응을 통해 합성한 헤마토포피린 다이메틸 에스터는 고 리 전류 효과로 인해 포피린 고리 안에 위치한 아민 수 소는 크게 가려져 높은 장인 -4.00 ppm의 피크에서 나 타나게 된다. 고리 안쪽과 바깥쪽은 정반대의 자장선이 지나가기 때문에 고리 바깥쪽에 위치한 수소 4개는 적 게 가져진 낮은 장인 10.86, 10.84, 10.42, 10.41 ppm의 위치에서 피크를 보이게 된다. 고속원자충돌 질량 분석 기 스펙트럼에서 합성한 헤마토포피린 다이메틸 에스터 를 예측한 분자량 627의 피크에서 확인하였고 합성수율 은 43%이다. 합성한 갈륨-헤마토포피린 다이메틸 에스터(1b)는 갈륨 N N O O N N N N O O HN NH HO H3C H3C H3C H3C H3CO H3CO H3CO H3CO CH3 CH3 CH3 CH3 GaCl3/pyridine Ga H2O (2a)
과 포피린 고리 안의 아민 수소가 결합하여 형성하는데 그 결과로 고리 전류 효과로 인해 크게 가려졌던 -4.00 ppm의 아민 수소가 사라진 것을 통하여 반응을 확인하 였다. 포피린은 좋은 파이-전자 주개 (π-electron donor)로 갈륨과 킬레이트 결합을 형성하면 포피린 고리와 인접 한 위치의 수소들이 적게 가려진 낮은 장으로 화학적 이 동을 한다. Fig. 3(A)에서 나타낸 갈륨-헤마토포피린 다 이메틸 에스터의 자외선-가시광선 분광광도계 스펙트럼 을 보면 헤마토포피린 및 헤마토포피린 다이메틸 에스터 의 흡수는 포피린 고리 오비탈의 π에서 π*로 전자의 들 뜸을 수반하여 색깔을 띤다. 400 nm에서 이차 들뜸 상태 (S0→ S2)의 강한 전이와 500 nm에서 일차 들뜸 상태 (S1→ S2)의 약한 전이는 π-π* 전이로 최고점유 분자궤
도함수 (Highest occupied molecular orbital, HOMO)와 최 저점유 분자궤도함수 (Lowest occupied molecular orbi-tal,
LOMO)의 경계궤도함수 (Frontier orbitals)로 설명될 수 있다. 갈륨-헤마토포피린 다이메틸 에스터 (1b)의 흡수에 서 포피린 리간드에서 갈륨 (III)으로 전하가 이동하는 리간드 → 금속 전하 이동 (Ligand-to-metal charge
trans-fer)에 의해 최대흡수파장이 395 nm에서 405 nm로 이동 함을 알 수 있다. 질량 분석 시에 축에 위치한 하이드록 시기와 물 분자는 떨어져나가기 쉽기 때문에 693의 피 크에서 하이드록시기와 물 분자가 떨어져나간 갈륨-헤마 토포피린 다이메틸 에스터 (1b)의 분자량을 보였다. 710 의 질량 피크에서 물 분자가 떨어져 나가고 하이드록시 기만 남아있는 분자의 피크와 728의 질량 피크에서 하 이드록시기와 물 분자가 배위된 분자량을 확인하였고 합성수율은 21%이다. 프로토포피린 다이메틸 에스터가 갈륨과 결합하여 고 리 전류 효과로 인해 크게 가려졌던 -4.00 ppm의 아민 수소가 사라진 것을 통하여 반응을 확인하였다. Fig. 3(B) 에서 나타낸 자외선-가시광선 분광광도계에서 포피린에 포함된 금속물질과 전하이동착체 형성의 결과로 프로토
Fig. 3. UV-Vis specta of hematoporphyrin (HP), hematoporphyrin
dimethyl ester (HP-Me) and Ga-hematoporphyrin dimethyl ester (Ga-HP-Me) (A), UV-Vis spectra of protoporphyrin dimethyl ester (PP-Me) and Ga-protoporphyrin dimethyl ester (Ga-PP-Me) (B).
Fig. 4. Radio TLC of 68Ga-hematoporphyrin dimethyl ester.
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 HP HP-Me Ga-HP-Me PP-Me Ga-PP-Me (A) (B) λmax==395 λmax==395 λmax==395 λmax==405 λmax==405 300 400 500 600 700 800 nm 300 400 500 600 700 800 nm Abs Abs 1500 1200 900 600 300 0 Cnts [68Ga]GaCl3 0 50 100 150 200 mm HO OH OH H3C H3C H3C H3CO H3CO CH3 CH3 CH3 N N N N O O 68 Ga H2O
Fig. 5. Radio TLC of 68Ga-protoporphyrin dimethyl ester.
1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Cnts [68Ga]GaCl3 0 50 100 150 200 mm N OH N N N H3C H3C CH3 CH2 CH2 CH3 68 Ga H2O O OCH3 O OCH3
포피린 다이메틸 에스터의 최대흡수파장 395 nm에서 갈 륨-프로토포피린 다이메틸 에스터 (2a)의 최대흡수파장 405 nm로 이동한 것을 통하여 킬레이트 반응을 확인하 였다. 합성한 갈륨-프로토포피린 다이메틸 에스터 (2a)도 갈륨-헤마토포피린 다이메틸 에스터 (1b)와 마찬가지로 하이드록시기와 물 분자가 떨어져 나간 분자량 657의 질량 피크를 확인하였다. 물 분자가 먼저 떨어져 나가고 축에 하이드록시기가 배위된 674의 질량 피크를 보였고 합성수율은 14%이다. [68Ga]갈륨-헤마토포피린 다이메틸 에스터의 합성은 방사성 동위원소 발생장치에서 0.1 N 염산으로 용출하여 얻은 10 mCi의 [68Ga]GaCl3로 반응하였으며 나머지 실 험방법은 비교물질과 동일하다. Fig. 4에서 나타낸 방사 성 박층 크로마토그래피를 통하여 반응의 진행을 확인하 였고 0.58의 머무름 값을 얻어 비교물질과 동일하다는 것을 확인하여 [68Ga]갈륨-헤마토포피린 다이메틸 에스 터를 방사 화학적 수율은 24%로 합성하였으며 반응하 지 않은 [68Ga]GaCl3의 피크는 방사성 박층 크로마토그 래피 전개판 15 mm 부근에서 나타났다. [68Ga]갈륨-프로토포피린 다이메틸 에스터의 합성도 방사성 동위원소 발생장치에서 0.1 N 염산으로 용출하여 얻은 10 mCi의 [68Ga]GaCl3로 반응시켰으며 비교물질과 동일하게 실험을 진행하였다. Fig. 5에서 나타낸 방사성 박층 크로마토그래피를 통하여 반응의 진행을 확인하였 고 0.64의 머무름 값을 얻어 비교물질과 동일하다는 것 을 확인하여 [68Ga]갈륨-프로토포피린 다이메틸 에스터 를 방사 화학적 수율 18%로 얻었다.
결
론
PET용 암 영상 시약을 개발하기 위해 68Ga을 도입한 [68Ga]갈륨-헤마토포피린 다이메틸 에스터 ([68Ga]Ga-hematoporphyrin dimethyl ester) (3a)와 [68Ga]갈륨-프로토
포피린 다이메틸 에스터 ([68Ga]Ga-protoporphyrin
dime-thyl ester) (4a)를 각각 24%, 18%의 방사화학적 수율로
합성하였다. 합성한 68Ga 표지화합물을 이용하여 in vivo 및 in vitro 연구를 진행 중이며 앞으로 PET 진단 시약으 로 응용되리라 사료된다.
사
사
본 연구는 2009년 정부출연금 (기본사업)의 지원으로 이루어졌으며, 이에 고마움을 전합니다.참 고 문 헌
Brunner H, Alndt M amd Treittinger B. 2004. Porphyrin plati-um conjugates-new aims. Inorganica Chimi Acta 357:1649-1669.
Kim YS, Song R, Kim DH, Jun MJ and Sohn YS. 2003. Syn-thesis, biodistribution and antitumor activity of hematopor-phyrin-platinum (II) conjugates. Bioorg. Med. Chem. 11: 1753-1760.
Lee YS. 2004. Photodynamic therapy in head and neck mali-gnancy. J. Clinical Otolaryngol 15:214-221.
Robert B, Steven B and Sidneyr U. 1958. Attempts at tumor localization 64Cu-labelled copper porphyrins. Cancer 11:
259-263.
Tammilmani V, Yee KKL, Heng PWS, Soo KC and Olive M. 2006. A study comparing endogenous protoporphyrin IX induced by 5-ALA and ALA-methyl ester with exogenous PpIX and PpIX dimethyl ester in photodynamic diagnosis of human nasopharyngeal carcinoma xenografts. Int. J. Oncol. 29:997-1002.
Tatu JM, Petteri L, Tiina P, Jari J, Hannu TA and Anne R. 2005. Comparison of 18F-FDG and 68Ga PET Imaging in
the Assessment of Experimental Osteomylitis due to Sta-phyococcus aureus. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 32: 1259-1268.
Velikyan I. 2005. Synthesis, characterization and application of 68Ga-labelled macromolecules. Digital Comprehensive
Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Science and Technology 73:68-72.
Manuscript Received: December 11, 2009 Revision Accepted: December 16, 2009
